全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(4): 744752 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2009B020)和重庆市自然科学基金项目(CSTC2010BB1012)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 李加纳, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: xiexy8009@163.com
Received(收稿日期): 2012-08-04; Accepted(接受日期): 2012-12-08; Published online(网络出版日期): 2013-01-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130128.0919.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00744
干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析
谢小玉 张 兵 张 霞 马仲炼 李加纳*
西南大学农学与生物科技学院 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 以抗旱能力强的油菜 Holiday 为材料, 以干旱处理的样品为 Tester, 正常水分管理(对照)为 Driver 构建干旱
诱导的甘蓝型油菜叶片正向抑制性消减杂交 (SSH)文库。随机挑选 24个阳性克隆进行 PCR 验证 , 结果表明 , 其中
23个含有插入片段, 平均大小在 750 bp左右。将 96个阳性克隆测序, 运用 CAP3 Sequence Assembly Program聚类、
拼接和去除冗余, 获得重叠群 4条, 单拷贝序列 82条, 平均长度为 542 bp。经 BlastX程序比对蛋白数据库发现, 11
条 EST没有找到同源性序列, 75条有同源序列。KOBAS分析发现, 28条 EST被定位到 67条代谢途径中, 根据 P值
推测, 光合中的碳固定、有氧呼吸的电子供体、氮代谢、乙醛酸和二羧酸代谢在植物干旱胁迫中发挥着极为重要的
作用。这些 EST涉及到的功能中所占比例最大的分别是细胞器(58.82%)、结合(30.77%)和新陈代谢过程(43.72%), 表
明甘蓝型油菜受到干旱胁迫时, 细胞器组件上的功能发挥了重要的作用, 结合基因和蛋白被激活, 加强了新陈代谢。
关键词: 油菜; 抑制差减杂交; 干旱胁迫; cDNA文库; 表达序列标签
Construction and Analysis of SSH Library in Rapeseed (Brassica napus L.)
under Drought Stress
XIE Xiao-Yu, ZHANG Bing, ZHANG Xia, MA Zhong-Lian, and LI Jia-Na*
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University / Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education,
Chongqing 400716, China
Abstract: The positive SSH library in leaves of rapeseed (Brassica napus L.) Holiday (with high drought resistance ability) was
constructed using the sample under drought stress as Tester and the sample under normal water management as Driver.
Twenty-four positive clones selected randomly were verified by using PCR. The result of electrophoresis showed that 23 clones
contained inserts whose average length was 750 bp. Ninety-six positive clones were sequenced and analyzed by CAP3 Sequence
Assembly Program, showing that four contigs and 82 singletons were contained and the average length of 86 ESTs was 542 bp.
BlastX alignment with Nr database showed 11 ESTs without significant similarity and 75 ESTs with similarity in GenBank data-
base. KOBAS suggested that 28 ESTs were mapped to 67 pathways. It could be predicted that the carbon fixation in photosyn-
thetic organism, electron donor III of aerobic respiration, nitrogen metabolism, glyoxylate and dicarboxylate metabolism played a
key role in drought tolerance of rapeseed. The analysis of ESTs showed that a large share of function could be attributed to organ-
elle (58.82%), binding (30.77%), and metabolic process (43.72%), which plays important roles in metabolism of rapeseed under
drought stress.
Keywords: Rapeseed (Brassica napus L.); Suppression subtractive hybridization (SSH); Drought stress; cDNA library; Express
sequence tag
季节性干旱是油菜生产的主要自然灾害之一, 可能
发生在油菜生长的各个时期 , 严重影响油菜的生长和产
量。尤其在我国甘蓝型油菜主产区(长江流域)春季易出现
干旱少雨气候 , 对处于水分敏感期的抽薹开花期的油菜
产生很大的影响, 不仅影响到油菜正常的生长, 还使油菜
的开花结实受阻, 授粉受精不能完成, 导致油菜产量降低,
含油量降低。据报道春旱使我国长江中下游地区的油菜减
产 20%以上[1]。因此了解油菜抗旱机制, 培育油菜抗旱品
种迫在眉睫。
抗旱性是由多基因控制的性状, 在拟南芥[2]、棉花[3]、
第 4期 谢小玉等: 干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析 745


小麦[4]、水稻[5]、玉米[6-7]、大豆[8]、高粱[9]和烟草[10]等植
物中, 已经分离到大量干旱胁迫诱导的基因。在油菜中,
Yu等[11]在甘蓝型油菜(B. napus)中获得了原生质膜水通道
蛋白 BnPIP1 基因片段全长, 转化烟草后发现过量表达
BnPIP1 基因烟草植株在生长的各个时期抗干旱胁迫能力
明显增强。近些年来, 抑制消减杂交(SSH)以高灵敏、易
操作、高效富集低表达丰度基因和均一化目的基因片段,
假阳性率低、重复性好、结果便于分析[12]的优势, 广泛用
于差异表达基因的分离和 cDNA 文库构建, 可以方便地
分离各种环境胁迫条件下诱导表达的抗性相关基因 , 从
而揭示植物的抗逆机制。如在抗旱基因的研究上, 研究者
利用 SSH技术构建了玉米[13]、小麦[14]、大豆[15]、棉花[16-17]、
斑茅 [18]等作物的抑制消减文库。本研究以甘蓝型油菜
Holiday为材料, 采用 SSH技术构建油菜在干旱胁迫下的
正向 SSH cDNA 文库, 了解文库中抗旱基因的表达种类
和丰度, 进而找到参与抗旱的代谢途径和适应机理, 鉴定
油菜在干旱胁迫下差异表达的相关基因 , 为揭示油菜抗
旱的分子机制和克隆油菜抗旱基因奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
将抗旱性强的高油酸(油酸含量 74%)甘蓝型油菜材
料Holiday盆栽于西南大学遮雨网室, 油菜生长至抽薹期,
选择长势良好且生长一致的油菜作为试验材料。浇水使盆
土达到饱和, 然后分为 2 组(各 5 盆), 即对照(正常浇水)
和干旱处理(不浇水), 每天采用 TRIME HD-PICO64 型便
携式土壤水分测量仪测定土壤含水量 , 保持对照组土壤
含水量为 65%~75%。干旱处理的植株最底部叶片开始出
现萎蔫时(土壤相对含水量为 40%~45%, 植株受中度干旱
胁迫, 而对照植株生长良好)为干旱第 1天, 分别在第 1、
3、5和 7 d (土壤相对含水量为 30%~35%, 接近重度干旱)
上午 9:00~9:30 采集对照和处理取顶部完全展开的第 1
叶。以液氮速冻, –80℃保存。
1.2 油菜叶片 RNA的提取及 mRNA的纯化
采用 Invitrogen 公司生产的 TRIzol 试剂盒提取总
RNA, TaKaRa的 Oligotextm-dT30 mRNA Purification Kit
分离 mRNA, 等量混合在第 1、第 3、第 5 和第 7 天对照
样品的 mRNA为 Driver, 处理样品的 mRNA为 Tester。用
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA和 mRNA质量, 紫外分
光光度计(DU800, BAKEMAN)测定其纯度和浓度。
1.3 抑制性消减杂交
按照 SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit说明书, 合
成第 1链和第 2链, 采用 DNA Fragment Purification Kit
Ver. 2.0纯化 PCR产物, 并取 6 µL用于 DNA合成质量和
酶切效率的检测。在 37℃水浴下分别对 Tester 和 Driver
用 Rsa I酶切 2~3 h, 将酶切后的 Tester cDNA分成 2等份,
连接上不同的接头, 分别利用甘蓝型油菜持家基因 Beta
tubulin 引物设计特异引物与试剂盒提供的通用引物
Primer1 扩增连接产物, 2.0%琼脂糖电泳检验接头连接效
率, 而 Driver cDNA不连接头。将连有接头的 Tester cDNA
与等量的 Driver混合, 进行第 1次差减杂交。将 2种第 1
次差减杂交的产物混合, 再与新鲜变性的 Driver cDNA
进行第 2次差减杂交, 再取杂交样品 cDNA和未消减杂交
的 Tester进行 PCR扩增, 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测; 将消
减杂交 cDNA 第 2 次 PCR 产物和未消减杂交 cDNA 第 2
次 PCR 产物进行 PCR, 分别设置 18、23、28 和 33 个循
环, 取 5 µL产物用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测。再进行第
2次 PCR产物的纯化。
1.4 SSH-cDNA文库构建
取 4 µL 纯化的 PCR 产物, 使用 TaKaRa 公司的
PMD19-T Vector 对消减杂交片段进行连接。大肠杆菌感
受态制备采用氯化钙二次重悬法。从–80℃储存的大肠杆
菌菌株的保存菌液中取出菌液, 37℃, 225转 min–1扩大培
养约 2.5~3.0 h, 至 OD600=0.4停止。用 2 mL冰浴冷却的
0.1 mol L–1 CaCl2 溶液轻轻重悬菌体至均匀, 冰水浴 30
min 后即制成感受态细胞悬液; 加入 5 µL 连接产物并轻
轻混匀, 在恒温振荡器上 37℃, 200转 min–1复苏培养 80
min, 使受体菌恢复正常生长状态; 在 37℃下在 LB 固体
培养基平板均匀涂布 Amp (50 g mL–1)、X-gal (80 g
mL–1)和 IPTG (0.5 mmol L–1), 37℃倒置培养于恒温培养箱
中 14~16 h至长出大小合适的蓝、白菌落。挑取白色饱满
菌落置 96细胞培养板(每孔有 70 µL LB培养基), 于 37℃
静置培养 16~20 h, 与 13 µL甘油(甘油经过高压蒸汽灭菌
20 min)混匀, –70℃保存, 建成 SSH文库。
1.5 差异表达序列测序和生物信息学分析
以巢式 PCR引物 Primer 1和 Primer 2R进行菌液 PCR
扩增, 对阳性克隆进行进一步筛选, 选取一板 96 孔板克
隆送宝生物工程(大连)有限公司测序。应用 VecScreen, 去
除构建文库时所用的载体及巢式引物接头序列 , 摒弃低
质量的序列。利用 Blast程序在 GenBank中寻找同源序列,
了解基因功能。同时结合 KOBAS程序进行基因功能归类
和代谢途径分析, 寻找与抗旱密切相关的代谢途径, 运用
Blast2GO, 对功能蛋白进行注释和分类[19]。
2 结果与分析
2.1 油菜叶片总 RNA及 mRNA质量检测
Tester 和 Driver 总 RNA 分离、纯化后, 将对照组和
处理组不同时期提取的 RNA 等量混合, 1.2%琼脂糖电泳
检测(图 1)显示, 28S RNA和 18S RNA条带清晰、明显、
无拖尾现象, 28S 条带比 18S 条带亮一些, 两者之比大于
1, 表明提取的总 RNA完整性好, 无降解。用紫外分光光
度计检测显示 OD260/OD280 介于 1.99~2.16 之间, OD260/
OD230介于 2.0~2.2之间, 表明纯度高, 无蛋白质、抽提试
剂、多糖、多酚污染。纯化的 mRNA 也呈现正常弥散均
匀分布 , 长度均在 750 bp 以上(图 2), 表明所获得的
mRNA质量较高。
746 作 物 学 报 第 39卷



图 1 总 RNA电泳检测
Fig. 1 Analysis of total RNA
M: 2000 bp DNA marker; 1~5: 对照总 RNA; 6~10: 处理总 RNA。
1–5: driver total RNA; 6–10: tester total RNA.



图 2 mRNA质量检测
Fig. 2 Quality detection of mRNA
M: 2000 bp DNA marker; 1: 对照 mRNA; 2: 处理 RNA。
1: driver mRNA; 2: tester mRNA.
2.2 文库的构建检测
2.2.1 双链 cDNA 的合成 使用 SMARTer cDNA
Synthesis Kit (Clontech Code No.634925)进行 ds cDNA合
成。选择 15 循环(泳道 1、6 和 11)、18 循环(泳道 2、7
和 12)、21 循环(泳道 3、8 和 13)、24 循环(泳道 4、9 和
14)、27循环(泳道 5、10和 15)各 5 µL产物进行 1%琼脂
糖凝胶电泳。图 3表明, 18循环为 cDNA合成最优循环数。
2.2.2 Rsa I 酶切 双链 cDNA的 Rsa I酶切充分是进
行后续实验的关键步骤之一。使用 Rsa I消化 ds cDNA (图
4)。Rsa I酶切后的 cDNA主要分布在 250~1000 bp, 与酶
切前比较, 分布范围明显下移, 表明酶切效果比较好, 合
乎构建文库的要求。
2.2.3 接头连接效率分析 接头连接效率检测(图 5)表
明特异引物和通用引物扩增的连接产物量大于 2 个特异
引物扩增的产物量的 25% (达到 PCR-Select cDNA Sub-
traction Kit对接头效率的要求), 说明接头连接成功。
2.2.4 2 次 PCR 产物分析 第 1次和第 2次 PCR产物
电泳结果(图 6和图 7)表明, 消减杂交的 PCR产物分别比
未消减杂交的 PCR 产物条带暗淡, 产物量低, 说明共同
存在的基因被消减, 只有特异性基因被扩增, 据对照结果
判断此次消减实验成功。
2.2.5 消减杂交效率检测 选择 18、23、28 和 33 循
环各 5 µL产物进行琼脂糖凝胶电泳(图 8)。可以看出, 未
消减样品的扩增产物在 18 个循环时就出现了, 而消减样
品的扩增产物在 33 个循环时才隐约出现。因而表明 2 种
材料中共有的 Beta tubulin基因在 Tester中得到有效的扣
除, 持家基因在消减产物中的丰度大大下降, 达到了去除
持家基因、富集差异基因的目的。因杂交后持家基因已经



图 3 LD-PCR循环数梯度
Fig. 3 Cycle amplification of LD-PCR
M: 10000 bp DNA marker; 1~5: 处理 ds cDNA产物; 6~10: 对照 ds cDNA产物; 11~15: mouse对照 ds cDNA产物。
1–5: tester-ds cDNA products; 6–10: driver-ds cDNA products; 11–15: mouse control-ds cDNA products.


第 4期 谢小玉等: 干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析 747




图 4 ds cDNA酶切前后效果
Fig. 4 The ds cDNA before and after Rsa I digestion
M1: 10000 bp DNA marker; 1: 处理 ds cDNA产物; 2: 处理 ds
cDNA- Rsa I消化产物; 3:对照 ds cDNA产物; 4: 对照 ds cDNA-
Rsa I消化产物; 5: mouse 对照 ds cDNA产物; 6: mouse对照 ds
cDNA- Rsa I消化产物; M2: 2000 bp DNA ladder marker。
1: tester ds cDNA; 2: tester ds cDNA-Rsa I digestion products;
3: driver ds cDNA; 4: driver ds cDNA-Rsa I digestion products;
5: mouse control-ds cDNA; 6: mouse control-ds cDNA-Rsa I di-
gestion products.



图 5 连接效率检测
Fig. 5 Results of ligation efficiency analysis
M: 2000 bp DNA marker; 1和 3: 处理为模板, 根据 Beta tubulin
基因引物设计的特异引物和 primer1作为引物的 PCR产物; 2和
4: 处理为模板, 根据 Beta tubulin基因引物设计的特异引物的
PCR产物。
1 and 3: tester-Beta 3/PCR primer1 PCR; 2 and 4: tester-Beta 5/
3PCR.

被消减掉了, 剩余的基因只是差异表达的基因, 即在干旱
诱导下特异表达的基因。因此电泳结果表明本次消减实验
成功。
2.2.6 SSH cDNA 文库蓝白斑筛选及消减文库中插入片
段大小检测 第 2 轮 PCR 产物与载体连接转入大肠杆
菌, 构建相应的抑制消减杂交文库。将白菌 600个 50 µL–1


图 6 第 1次 PCR产物分析
Fig. 6 Analysis of the first PCR products
M: 2000 bp marker; 1: 样品第 1次 PCR产物(杂交); 2: 样品第 1
次 PCR产物(未杂交); 3: mouse对照第 1次 PCR产物(杂交); 4:
mouse对照第 1次 PCR产物(未杂交); 5: 阳性对照; 6: 阴性对照。
1: the first PCR products of sample (hybridized); 2: the first PCR
products of sample (unhybridized); 3: the first PCR products of
mouse control (hybridized); 4: the first PCR products of mouse
control (unhybridized); 5: positive control; 6: negtive control.



图 7 第 2次 PCR产物分析
Fig. 7 Analysis of the second PCR products
M: 2000 bp marker; 1: 样品第 2次 PCR产物(杂交); 2: 样品第 2
次 PCR产物(未杂交); 3: mouse对照第 2次 PCR产物(杂交);
4: mouse对照第 2次 PCR产物(未杂交); 5: 阳性对照; 6: 阴性对照。
1: the second PCR products of sample (hybridized); 2: the second
PCR products of sample (unhybridized); 3: the second PCR products of
mouse control (hybridized); 4: the second PCR products of mouse
control (unhybridized); 5: positive control; 6: negtive control.

转化液涂板, 有效库容约 1×106, 随机在平板上挑选 24个
单菌落使用 SapphireAmp Fast PCR Master Mix Kit (Code
No. DRR350S)和 T载体两端通用引物 M13-47/RV-M进行
阳性克隆筛选, 判定阳性克隆率。电泳结果(图 9)表明 1
号是空质粒为假阳性, 检测阳性克隆率为 23/24, 其余克
隆片段平均约为 750 bp, 说明连接和转化效果比较好。
2.3 EST生物信息学分析
2.3.1 测序及结果分析 通过测序获得 90个 EST, 应
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图 8 消减杂交效率检测
Fig. 8 Detection of subtractive hybridization
M: 2000 bp DNA marker; 1: sample-Beta 5/3PCR (18循环杂交);
2: sample-Beta 5/3PCR (23循环杂交); 3: sample-Beta 5/3PCR
(28循环杂交); 4: sample-Beta 5/3PCR (33循环杂交): 5: sample-
Beta 5/3PCR (18循环未杂交); 6: sample-Beta 5/3PCR (23循环
未杂交) mRNA; 7: sample-Beta 5/3PCR (28循环未杂交);
8: sample-Beta 5/3PCR (33循环未杂交)。
1: sample-Beta 5/3PCR (18 cycles hybridization); 2: sample-Beta
5/3PCR (23 cycles hybridization); 3: sample-Beta 5/3PCR (28 cycles
hybridization); 4: sample-Beta 5/3PCR (33 cycles hybridization);
5: sample-Beta 5/3PCR (18 cycles unhybridization); 6: sample-Beta
5/3PCR (23 cycles unhybridization); 7: sample-Beta 5/3PCR (28
cycles unhybridization); 8: sample-Beta 5/3PCR (33 cycles
unhybridization).

用VecScreen去除构建文库时所用的载体及巢式引物接头
序列, 获得 90条高质量的 EST序列。运用 CAP3 Sequence
Assembly Program对 90条高质量的 EST进行聚类分析。
经过聚类、拼接和去除冗余, 最终获得 86 条 unigene, 其
中获得重叠群(contigs) 4条, 单拷贝序列(singleton) 82条。
测序的 EST 长度介于 101~930 bp, 平均长度为 542 bp,
101~250 bp有 5条, 251~400 bp有 13条, 401~550 bp的
EST达到 30条, 其次 551~700 bp有 19条, 701~850 bp有
13条, 851~1000 bp有 6条。
2.3.2 EST 序列分析 对测序获得的 EST 利用 NCBI
BlastN和 BlastX工具分别进行Nucleotide Collection (nr/nt)
数据库和 Non-Redundant Protein Sequences (nr)数据库的
序列比对。Blastx的结果以 E值低于 1E–08, 匹配序列超
过 100 bp 认为有同源性[20], 其他参数选择默认, 同源性
比对发现, 其中 75 条 unigene 具有同源基因, 余下的 11
条 unigene 没有匹配项, 推测其一可能代表新基因, 其二
是处在 3′末端、5′末端非翻译区的较短序列(表 1)。
从表 1 可以看出, 有同源性的 EST 来源于拟南芥、
甘蓝型油菜、盐芥、水稻、二穗短柄草、烟草、大麦等物
种。经 Blastx 比对后按照注释的功能分类, 51 条 unigene
与已知功能的蛋白有同源性, 11 条 unigene 与假想蛋白
(hypothetical protein)有同源性, 3 条 unigene 与推定蛋白
(putative protein)有同源性, 9 条 unigene 与未命名蛋白有
同源性。此外, TE-85 与拟南芥的 uncharacterized protein
(登录号为 NP_565802.1)同源。
2.3.3 京都基因和基因组百科全书(KEGG)代谢途径分析
和基因功能分类 用基于 KEGG 的序列注释分析系统
(KOBAS)程序进行代谢途径分析 , 寻找与抗旱密切相关
的代谢途径。将 86 条 uniEST 提交 KOBAS, 参考物种为
Arabidopsis thaliana。其中 74 条序列得到匹配, 剩余 12
条序列无匹配信号, 28条 EST被定位到 67条代谢途径中,
P < 0.5的代谢途径共有 59条。根据 P值推测, 光合中的
碳固定、有氧呼吸的电子供体、信号转导、氮代谢、乙醛
酸和二羧酸代谢可能在植物干旱胁迫中发挥着重要的作
用。
KOBAS基因功能归类结果表明, 没有分类的比例最
大, 占 74.32%。参与新陈代谢的 EST 占 16.22%, 涉及到
遗传信息途径的占 5.41%, 与环境信息途径和细胞进程有
关的分别占 2.70%和 1.35%。这似乎表明植物在受到干旱
影响时, 体内新陈代谢进程加快, 以增强物质代谢和能量
代谢提高对外部伤害的抵御能力。
2.3.4 GO 基因注释和功能分类 通过对 86条 EST序
列进行功能注释, 将获得的功能注释的 ESTs 序列进行
GO分类, 结果有 67个 EST 片段得到匹配, 19条 EST 片
段没有匹配信息。
通过 GO功能注释后归类, 共有 47条 EST代表的基
因共同在分子组分、分子功能、生物学过程 3类中具有功



图 9 SSH文库阳性克隆片段检测
Fig. 9 Positive fragments analysis of SSH cDNA library
M: 2000 bp DNA marker; 1~24: 阳性克隆 PCR结果。
1–24: PCR products of positive clones.

第 4期 谢小玉等: 干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析 749


表 1 BlastX同源性比对部分结果
Table 1 Result of BlastX alignment
克隆号
Clone No.
同源性
Homology
物种
Species
一致性
Identity (%)
E值
E-value
TEcontig1 Phosphoribulokinase Arabidopsis thaliana 83 1E–15
TEcontig2 Delta 1-pyrrolinE–5-carboxylate synthetase A Brassica napus 99 3E–110
TEcontig3 Hypothetical protein ARALYDRAFT_899336 Arabidopsis lyrata subsp. 82 5E–10
TEcontig4 Mitochondrial substrate carrier family protein Arabidopsis lyrata subsp. 88 1E–27
TE-1 Regulatory particle triple-A ATPase 3 Arabidopsis thaliana 93 3E–121
TE-2 SERK1 Helianthus annuus 94 4E–92
TE-3 Unnamed protein product Arabidopsis thaliana 90 5E–111
TE-4 Cystine lyase BOCL-3 Brassica oleracea 97 8E–124
TE-5 F5M15.26 Arabidopsis thaliana 68 4E–87
TE-7 Serine/threonine-protein kinase ATPK19/ATPK2 Brassica rapa 96 1E–58
TE-9 Malate dehydrogenase 2 Brassica napus 100 3E–147
TE-11 AT4G34670(40S ribosomal protein S3a-2) Arabidopsis thaliana 69 3E–11
TE-13 Rho GDP-dissociation inhibitor family protein Arabidopsis lyrata subsp. 53 2E–11
TE-14 Chitinase Brassica rapa subsp. 96 8E–55
TE-15 Membrane fusion protein Use1 Arabidopsis thaliana 83 4E–91
TE-16 Hypothetical protein ARALYDRAFT_895394 Arabidopsis lyrata subsp. 82 1E–89
TE-18 Hypothetical protein Arabidopsis thaliana 92 7E–115
TE-19 PR-4 Brassica rapa subsp. 98 9E–40
TE-20 Unnamed protein product Arabidopsis thaliana 86 3E–57
TE-24 Hypothetical protein ARALYDRAFT_909820 Arabidopsis lyrata subsp. 70 1E–31
TE-25 Oxidoreductase, acting on the CH-CH group of donors Arabidopsis lyrata subsp. 68 3E–90
TE-27 Sec-independent protein translocase protein TatA Arabidopsis thaliana 85 3E–48
TE-28 Putative anion transporter 6 Arabidopsis thaliana 92 2E–146
TE-29 Unnamed protein product Thellungiella halophila 91 2E–73
TE-30 Ethylene-responsive transcription factor ABR1 Brassica juncea 70 5E–35
TE-31 Macrophage migration inhibitory factor family protein Arabidopsis lyrata subsp. 91 8E–68
TE-32 At5g33280-like protein Arabidopsis lyrata subsp. 94 6E–91
TE-34 Unnamed protein product Thellungiella halophila 84 6E–93
TE-35 Polyubiquitin-like Brachypodium distachyon 99 0
TE-36 Cold-regulated protein Cor25 Brassica rapa subsp. 94 4E–62
TE-37 Extensin 4 Arabidopsis thaliana 41 3E–05
TE-38 Hypothetical protein NitaMp027 Nicotiana tabacum 91 7E–47
TE-39 DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 38 unnamed protein Arabidopsis thaliana 91 4E–129
TE-41 Product Thellungiella halophila 99 5E–145
TE-42 HXXXD-type acyl-transferase-like protein Arabidopsis thaliana 68 3E–33
TE-43 Cytochrome P450 Arabidopsis thaliana 78 3E–32
TE-45 Unnamed protein product Thellungiella halophila 85 1E–91
TE-49 Chitinase class IV, partial Brassica napus 95 6E–76
TE-51 Late embryogenesis abundant hydroxyproline-rich glycoprotein Arabidopsis thaliana 81 1E–31
TE-52 Alternative oxidase 3 Arabidopsis thaliana 93 5E–121
TE-53 Hypothetical protein ARALYDRAFT_488807 Arabidopsis lyrata subsp. 97 4E–167
TE-55 ATGSKB6 Arabidopsis lyrata subsp. 93 4E–152
TE-56 3-phosphoglycerate dehydrogenase Arabidopsis lyrata subsp. 87 9E–82
TE-57 Mitochondrial phosphate translocator Arabidopsis thaliana 96 9E–67
750 作 物 学 报 第 39卷

(续表 1)
克隆号
Clone No.
同源性
Homology
物种
Species
一致性
Identity (%)
E值
E-value
TE-58 Hypothetical protein ARALYDRAFT_906015 Arabidopsis lyrata subsp. 78 2E–31
TE-59 Hypothetical protein Arabidopsis thaliana 64 1E–32
TE-60 Ribulose bisphosphate carboxylase Brassica rapa 100 2E–23
TE-61 Universal stress protein family protein Arabidopsis lyrata subsp. 74 4E–30
TE-62 Binding protein Arabidopsis lyrata subsp. 75 3E–113
TE-65 Hypothetical protein ARALYDRAFT_494541 Arabidopsis lyrata subsp. 91 3E–80
TE-66 At1g09800 Arabidopsis thaliana 90 1E–101
TE-67 NEDD8-like protein RUB1; Os09g0420800 Oryza sativa 100 1E–24
TE-68 F-box protein 2 Arabidopsis thaliana 70 2E–63
TE-70 Putative aspartate--tRNA ligase Arabidopsis thaliana 73 6E–50
TE-71 Lipid transfer protein Arabidopsis thaliana 99 4E–57
TE-72 Gamma carbonic anhydrase like 1 Brassica napus 99 6E–63
TE-73 Subtilisin-like protease; AT5g67360/K8K14_8 Arabidopsis thaliana 91 2E–68
TE-74 Expressed protein Arabidopsis thaliana 64 9E–108
TE-75 Unnamed protein product Arabidopsis thaliana 89 2E–37
TE-76 Peroxisomal biogenesis factor 11 family protein Thellungiella halophila 97 7E–56
TE-79 Beta-tubulin 6 Arabidopsis lyrata subsp. 95 6E–35
TE-80 Unnamed protein product Oryza sativa indica Group 83 3E–28
TE-81 Hypothetical protein ARALYDRAFT_474913 65 2E–34
TE-85 Uncharacterized protein Thellungiella halophila 85 4E–117
TE-86 Auxin-responsive family protein Arabidopsis lyrata subsp. 100 9E–14
TE-87 Hypothetical protein ARALYDRAFT_328473 Arabidopsis thaliana 68 9E–19
TE-88 GTP-binding protein, putative Brassica napus 100 6E–110
TE-89 Chloroplast beta-carbonic anhydrase Brassica oleracea 99 1E–21
TE-90 IAA-amino acid hydrolase 6 Brassica napus 99 1E–131
TE-91 Rossm ann-foldNAD (P)-binding domain-containing protein Brassica rapa 83 8E–95
TE-92 Pentatricopeptide repeat-containing protein Arabidopsis thaliana 81 9E–145
TE-93 Unnamed protein product Arabidopsis thaliana 94 7E–161
TE-94 Putative MAP kinase Arabidopsis thaliana 99 3E–70
TE-95 NADPH-ferrihemoprotein reductase Arabidopsis thaliana 88 2E–159
TE-96 Mitochondrial RNA helicase-like protein Arabidopsis lyrata subsp. 95 1E–60

能。这说明植物耐旱是一个复杂的、涉及到众多基因的激
活和蛋白代谢的过程。而其中 61条 EST被定位到细胞组
分, 56条 EST被定位到分子功能, 56条 EST被定位到生物
学过程。而细胞组分、分子功能及生物学过程的注释中分
布的亚类各不相同(表 3), 表明甘蓝型油菜面对干旱胁迫
时, 细胞器组件上的功能发挥了重要的作用, 结合基因和
蛋白被激活和活化 , 如线粒体和叶绿体的内部组分活性
增强, 新陈代谢加强响应, 并调动自身的防御机制积极抵
御外部干旱的伤害。
3 讨论
干旱影响油菜正常的生长发育, 通过 SSH 技术, 可
以发掘干旱胁迫下造成油菜生育障碍的基因表达情况 ,
富集、克隆关键基因, 并进行功能和转基因研究。
根据 P 值最小确定, 光合中的碳固定、有氧呼吸的
电子供体、氮代谢、乙醛酸和二羧酸代谢与抵御干旱胁迫
有紧密关系。光合作用 CO2固定产生有机物, 为植物抵御
干旱储备能量, 本文的 TE9、TE60 和 TEcontig1 参与 C
代谢过程。苹果酸脱氢酶除在三羧酸循环中有重要功能外,
在 C4 植物光合作用中也有重要功能, 它可帮助外界 CO2
进入维管束鞘细胞参加 C3循环。有氧呼吸的电子供体是
呼吸链的组成部分, 组织通过有氧呼吸产生能量, 供给生
命活动, 本文的 TE52交替氧化酶是植物体线粒体内膜上
的线粒体呼吸链中抗氰呼吸途径的末端氧化酶。传递电
子给 O2生成 H2O。可以调节细胞多方面的代谢和功能,
以适应环境改变 , 增强抗逆能力 , 调节植物生长速率 ,
第 4期 谢小玉等: 干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析 751


表 2 KOBAS软件分析的部分干旱诱导代谢途径
Table 2 Representative drought-induced metabolic pathways identified by KOBAS
KEGG代谢途径
KEGG pathway
基因登录号
ID
EST克隆号
EST number
P值
P-value
Carbon fixation in photosynthetic organisms ath00710 TE9, TE60, TEcontig1 0.01
Aerobic respiration- electron donor III PWY-4302 TE52, TE58, TE72 0.01
Glyoxylate and dicarboxylate metabolism ath00630 TE9, TE60 0.01
Nitrogen metabolism ath00910 TE55, TE89 0.02
Photorespiration PWY-181 TE41, TE60 0.03
Alanine, aspartate and glutamate metabolism ath00250 TE41, TE55 0.03
Glycine, serine and threonine metabolism ath00260 TE41, TE56 0.03
Rubisco shunt PWY-5723 TEcontig1, TE60 0.04
Calvin-benson-bassham cycle CALVIN-PWY TEcontig1, TE60 0.04
Developmental biology None TE94, TE7 0.04
TCA cycle variation III (eukaryotic) PWY-5690 TE9, TE58 0.04
P值大于 0.05的代谢途径没有列出。Pathways with a P-value higher than 0.05 were not listed.

表 3 GO基因注释的功能分类的主要亚类及其比例
Table 3 Main sub-category and percentage of GO annotated gene classification of EST
细胞组分 Cellular component 分子功能 Molecular function 生物学过程 Biological process
亚类
Sub-category
比例
(%)
亚类
Sub-category
比例
(%)
亚类
Sub-category
比例
(%)
细胞器 Organelle 58.82 结合 Binding 30.77 新陈代谢过程 Metabolic process 43.72
胞外区组分 Extracellular region 9.80 运输活性 Transporter activity 23.08 防御类过程 Defense 16.94
胞内区部分 Intracellular part 7.84 催化活性 Catalytic activity 20.51 运输途径 Transport 9.84

并与细胞凋亡和光合作用相关。氮代谢是植物基本的生
理过程之一。水分胁迫等关键生态因子对氮代谢有重要的
影响。光合碳代谢和 NO2–同化都发生在叶绿体内, 二者
都消耗来自碳同化和光合及电子传递链的有机碳和能量。
甚至氮代谢在某些组织内消耗光合能量的一半以上 , 本
文中 TE55和 TE89都与之有密切联系。
研究发现 , 葡萄在干旱胁迫下 , 磷酸核酮糖激酶等
会发挥关键性的作用抵御干旱胁迫 [21], 而且磷酸核酮糖
激酶在盐害和低温胁迫下也发现其大量表达 [22-23]使脯氨
酸积累。本研究中克隆的 TEcontig1 (磷酸核酮糖激酶)参
与碳水化合物的代谢过程, TEcontig2 与脯氨酸的合成有
关, 此外, 该酶还与罕见的代谢疾病有着密切联系[24]。研
究发现, 克隆 TE-14 (chitinase)在 PEG模拟干旱条件下在
草莓中大量表达[25]。
本研究也发现了某些 EST 代表的基因除受干旱诱导
外还响应辐射如紫外线, 冷害, 创伤, 氧化应激, 元素缺
乏如低硫、低钾, 内源性激素如茉莉酸、脱落酸、油菜素
内酯、甘露醇, 化学因子, 金属离子如铬离子, 光, 生物
因子, 无机物如 CO2, 有机物如单糖、多糖、葡萄糖, 高
温、盐害等的诱导, 这表明干旱胁迫与其他因素诱导的基
因某些是相同的 , 进而表明植物在抵御各种外界逆境胁
迫时有着共同的机制和途径。
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