全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(12): 21922197 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971838), 山西省科技攻关项目(201303110015-1)和山西省归国留学人员科研项目(2013-146)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 白云凤, E-mail: byfok@126.com
Received(收稿日期): 2014-02-25; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-09-26.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140926.0822.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.02192
籽粒苋 AhNAD-ME的序列特征与表达
白云凤 1,3,* 聂江婷 2 张忠梁 1 李 平 1 张维锋 1 闫建俊 1 冯瑞云 1
张 耀 1
1山西省农业科学院作物科学研究所, 山西太原 030032; 2山西大学生物工程学院, 山西太原 030006; 3农业部黄土高原作物基因资源与
种质创制重点实验室, 山西太原 030006
摘 要: NAD(P)-苹果酸酶催化苹果酸氧化脱羧, 产生丙酮酸和 CO2, 伴随 NAD(P)的还原。在 C4植物中, 苹果酸酶
参与了 C4光合作用。本研究对克隆的双子叶 C4植物籽粒苋 NAD-苹果酸酶基因(AhNAD-ME)编码的氨基酸序列进行
了生物信息学分析, 结果表明, AhNAD-ME具有苹果酸酶的完整功能域, 包括苹果酸 N端结构域和苹果酸酶的 NAD
结合结构域; 进化树表明, 该序列属于 NAD-ME 的 α 亚基, 该亚基定位于线粒体基质中。半定量 RT-PCR 分析表明,
该基因主要在叶片和茎中表达, 表达量随光照时间延长而增加。将 AhNAD-ME 基因重组到原核表达载体 pEASY-E1
中, 电击法转化到大肠杆菌 Transette (DE3)菌株中, IPTG诱导其高效表达, 表达的融合蛋白的分子量与预期相符, 主
要以包涵体形式存在。
关键词: 籽粒苋; AhNAD-ME; 序列特征; 表达模式; 原核表达
Sequence Characteristics and Expression of NAD-malic enzyme in Amaranthus
hypochondriacus L.
BAI Yun-Feng1,3,*, NIE Jiang-Ting2, ZHANG Zhong-Liang1, LI Ping1, ZHANG Wei-Feng1, YAN Jian-Jun1,
FENG Rui-Yun1, and ZHANG Yao1
1 Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032, China; 2 College of Bioengineering, Shanxi University, Tai-
yuan 030006, China; 3 China Key Laboratory of Loess Plateau Crop Gene Resources and Germplasm Creation, Ministry of Agriculture, Taiyuan
030006, China
Abstract: The NAD(P)-malic enzyme (NAD(P)-ME) found in many metabolic pathways catalyzes the oxidative decarboxylation
of L-malate, which results in producing pyruvate, CO2 and NAD(P)H. In C4 plants, NAD(P)-ME plays a key role in photosyn-
thetic carbon fixation. This study was aimed to characterize the AhNAD-ME in dicotyledonous C4 Amaranthus hypochondriacus
by sequence analysis, examine the expression patterns of AhNAD-ME gene in different tissues and different durations of illumina-
tion time, and construct a recombinant plasmid pEASY-E1 harboring the AhNAD-ME cDNA and then transform the plasmid into
E. coli Transette (DE3) for prokaryotic expression after IPTG induction. The result showed that AhNAD-ME contains all of the
motifs required for a complete and functional malic enzyme and is localized specifically to the mitochondrial matrix.
Semi-quantitative RT-PCR results showed that AhNAD-ME was constitutively expressed in all examined tissues, with different
expression levels, and strongly up-regulated under light in the leaf and stem. Results of SDS-PAGE demonstrated that the specific
fusion protein with an expected molecular weight was successfully expressed in E. coli transette (DE3) induced by IPTG.
Keywords: Amaranthus hypochondriacus; AhNAD-ME; Sequence characteristics; Expression pattern; Prokaryotic expression
苹果酸是植物代谢过程中的重要中间产物。苹
果酸酶(malic enzyme, ME) 在金属离子Mn2+或Mg2+
的存在下, 催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸和 CO2,
伴随产生还原性物质 NAD(P)H, 调控植物体内的呼
吸作用和脂类生成[1-2]等重要代谢途径, 对于保持植
物细胞的渗透势、稳定细胞质的 pH值[3]、维持根系
的离子吸收平衡、调节果实成熟和风味形成[4]、应
对生物和非生物逆境胁迫[5-6]等方面起重要作用。在
第 12期 白云凤等: 籽粒苋 AhNAD-ME的序列特征与表达 2193


C4 植物中, 苹果酸酶催化叶肉细胞的苹果酸脱羧释
放出的 CO2 被核酮糖 -1,5 二磷酸羧化酶 /加氧酶
(Rubisco)重新固定进入 Calvin 循环, 产生的丙酮酸
再生为磷酸烯醇式丙酮酸(PEP), 使 C4 途径得以循
环。CO2的释放提高了 Rubisco周围的 CO2浓度, 抑
制了 Rubisco的加氧功能, 提高了 CO2固定效率[7-9]。
根据辅酶因子的不同, 苹果酸酶分为NAD依赖
型(NAD-malic enzyme, NAD-ME)和 NADP 依赖型
(NADP-malic enzyme, NADP-ME)。根据在细胞和组
织中的分布, NAD(P)-ME 分为细胞质型和质体型,
根据功能又可分为光合型和非光合型等类型。玉米
NADP-ME 有光合型(C4)、非光合型(C3)和根型 3 种
类型[10-11]。光合型定位于绿色叶片, 参与 C4光合循
环; 非光合型定位于黄化叶片, 具体作用尚不清楚;
根型定位在根细胞中, 主要参与防御反应[12]。水稻
和拟南芥的 NADP-ME 包含 1 个质体型和 3 个细胞
质型 [13], 具有组织和发育特异性表达。高等植物
NAD(P)-ME家族成员催化同一个生化反应, 但代谢
途径和表达模式不同 [2,14], 可能与其在细胞内的定
位有关。
籽粒苋(A. hypochondriacus)粮饲兼用 , 是双子
叶 C4 植物, 属于苋科(Amaranthus)苋属(Amaranth-
ceae), 原产于中美洲和东南亚, 近年我国年种植面
积在 10万公顷以上, 从黑龙江到海南均有分布[15]。
籽粒苋能高效利用土壤养分[16]和水分[17], 光合速率
快, 生物学产量很高[18]。在本课题组先前克隆到籽
粒苋 NAD-ME (AhNAD-ME)基因[19-20]的基础上, 分
析其序列特征, 进行亚细胞定位, 探明时空表达特
性, 构建原核表达载体获得原核表达蛋白, 将为进
一步研究其酶学特性和转基因利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料籽粒苋和克隆载体 pSURE-AhNAD-
ME 由本实验室保存, 原核表达载体 pEASY-E1 和
大肠杆菌菌株 Trans1-T1 和 Transetta (DE3)的感受
态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。限制性
内切酶、T4 DNA 连接酶、LA-Taq 酶、M-MLV 反
转录酶、DNA Marker、Premixed Protein Marker、
IPTG、考马斯亮蓝 R-250 为大连宝生物公司产品;
氨苄青霉素购自 Sigma 公司。DNA 凝胶回收试剂
盒、RNA 提取试剂盒购自北京艾德来生物科技有
限公司。
1.2 AhNAD-ME特征分析和亚细胞定位预测
以 AhNAD-ME 基因推导的氨基酸序列作 query,
利用 BlastP 在线工具分析其结构域和进化地位 ,
PSORT (http://www.psort.org/)和 SoftBerry ProtComp
9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 在线 预测
AhDNA-ME的亚细胞定位, 用SignalP 4.1预测导肽[21]。
用 Clustal 1.8.1和 MEGA 4.1软件构建系统进化树。
1.3 时空表达模式分析
运用半定量RT-PCR检测AhNAD-ME基因的表达
量, 以Actin为内标基因。将籽粒苋植株暗处理1 d后,
置光照下2、4、6和8 h, 分别提取暗处理和不同光照
时段的根、茎、叶的总RNA, 以此为模板, 用Oligo
dT Primer作引物, 通过反转录合成cDNA第1链。以
cDNA第1链为模板, 扩增AhNAD-ME基因和内标基
因Actin。扩增AhNAD-ME的正向引物为5-ACCCAC
AAAGAGTGTTACCG-3, 反向引物为 5-TTCCCT
GATTAACGTGCC-3, 扩增内标基因的正向引物为
5-CTACAATGAGCTTCGGGTTGC-3, 反向引物为
5-GGACTTCTGGACAACGGAATCTC-3。取RT-PCR
产物20 μL经1%琼脂糖凝胶电泳, 然后成像, 采用
软件BandScan进行灰度分析 , 在Microsoft Excel中
作图。
1.4 原核表达载体构建
以含有 AhNAD-ME 全长基因的克隆载体
pSURE-AhNAD-ME为模板, 利用引物 P1 (5-CAAG
ATCTCAATGTTGTTGCTTTGTAGTC-3)和 P2 (5-C
GGTAACCTTCAGCGTTTCTTGTACAC-3)进行 PCR
扩增, 琼脂糖凝胶电泳中可见大约 1.8 kb 的片段,
将其纯化回收 , 取 4 μL 与 1 μL 原核表达载体
pEASY-E1混匀, 25℃连接 15 min。反应结束后, 转
化大肠杆菌 Trans1-T1 感受态细胞。挑取单菌落至
LB (含 100 mg L–1 Amp)液体培养基, 37℃过夜培养。
提取质粒进行 PCR 检测, 以空载体 pEASY-E1 作为
负对照, 引物为 P1 和 P2。将 PCR 鉴定呈现阳性的
单克隆提取质粒, 用 Xba I和 Sac I双酶切鉴定, 并
送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。
1.5 重组载体在大肠杆菌 Transetta (DE3)的诱
导表达和 SDS-PAGE分析
将基因序列无变异、插入方向正确的重组质粒,
通过电击导入 Transetta (DE3)感受态细胞。挑取单菌
落至 LB (含 100 mg L–1Amp)液体培养基, 37℃过夜
培养。以菌液为模板进行 PCR 扩增, 以未转化的菌
液为负对照, 引物为 P1和 P2。
2194 作 物 学 报 第 40卷

将导入重组载体的 6 mL 单菌落菌液加入
600 mL LB液体培养基(含 100 mg L–1 Amp), 于 37℃,
200转 min–1振荡培养。当菌液的 OD600值为 0.4~0.6
时, 加入 IPTG, 终浓度为 1 mmol L–1。然后等量分
成 6 管, 其中 4 管于 30℃条件下分别诱导 0、2、4
和 6 h。反应结束后, 从每管取菌液 2 mL, 18 000×g
离心 1 min, 弃上清液, 加入 SDS上样缓冲液, 悬浮
混匀, 沸水浴 5~10 min, 18 000×g离心 1 min, 冰浴
5 min, 进行 SDS-PAGE电泳。另 2管分别在 30℃和
16℃条件下诱导 4 h, 离心收集菌体后用 1×PBS将菌
体悬浮, 用超声波破碎(20 mm的变幅杆, 400 W, 超
声 2 s, 间隔 5 s, 重复 60次), 9600×g离心 10 min, 分
离上清液和沉淀, 并分别加入 SDS 上样缓冲液, 混
匀, 沸水浴 5~10 min后上样, SDS-PAGE电泳。电泳
完毕, 用考马斯亮蓝 R-250染色并脱色至背景清晰。
2 结果与分析
2.1 籽粒苋 AhNAD-ME 特征分析和亚细胞定位
预测
将AhNAD-ME基因(GenBank登录号为HQ186303)
编码的氨基酸序列提交 NCBI, 进行 BlastP。蛋白质
保守结构域分析表明该序列含有完整的NAD-ME保
守功能域, 包括苹果酸 N 端结构域和苹果酸酶的
NAD结合结构域[含有 6个 NAD(P)结合位点]。系统
进化树(图 1)显示, 该序列先与双子叶植物的 NAD-
ME 的 α 亚基(62 kD)聚为一类, 再与单子叶植物的
NAD-ME的 α亚基(62 kD)聚为一类, 而单子叶植物
与双子叶植物 NAD-ME的 β亚基(59 kD)聚为 1 类,
表明植物 NAD-ME的 α亚基和 β亚基的分化在单、
双子叶植物分化之前已经完成。
用SoftBerry ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.
com/berry.phtml)在线预测AhNAD-ME的蛋白质亚细
胞定位 , 表明该蛋白位于线粒体。 PSORT在线
(http://www.psort.org/)分析进一步表明该蛋白质位
于线粒体基质。SignaP4.1在线分析表明AhNAD-ME
没有明显的导肽序列(结果未显示)。
2.2 AhNAD-ME 基因的光诱导和组织特异性表
达特性
在暗处理或光照条件下, AhNAD-ME 基因在叶
片中均表达, 并且随着光照时间的延长, 表达量相
应增加。在光照 0~4 h区间, 随光照时间延长, 表达
量增加幅度大; 在光照 4~8 h区间, 表达量增加幅度
趋缓, 证实 AhNAD-ME 基因具有光诱导表达特性。
根、茎、叶表达模式不尽相同。在暗处理条件下 ,
AhNAD-ME 在根、茎、叶中均有低水平表达, 但在
光照处理后, 叶片中的表达量急速增加, 茎中表达
量也明显增加, 但根中表达量无明显变化(图 2 和图
3), 证实在无光条件下, 籽粒苋 AhNAD-ME 基因呈
现低水平的组成型表达, 在光照条件下则呈现绿色
组织特异性表达。预示 AhNAD-ME基因低水平组成
型表达可以满足苹果酸的基本代谢活动, 在光照条
件下则可能参与了光合作用。
2.3 AhNAD-ME的原核表达
用 IPTG 诱导含有重组质粒的 Transetta (DE3)
菌株表达重组蛋白, SDS-PAGE检测结果表明, 30℃
诱导 2 h 就有特异的蛋白条带出现。随着诱导时间
延长, 条带颜色进一步加深。诱导蛋白的分子量约
66 kD (图 4), 与预期的蛋白质分子量相符。
为了获得能够可溶性表达的目的蛋白, 用 IPTG
分别在 30℃和 16℃下诱导 4 h, 对上清液和沉淀进
行 SDS-PAGE 电泳检测。结果表明, 在 2 个温度条
件下, 融合蛋白均能被诱导, 但 30℃诱导的表达量
高于 16℃, 但 2 个温度诱导的融合蛋白主要以包涵
体的形式存在(图 4)。
3 讨论
植物的多数蛋白质由核基因编码, 在细胞质内
与内质网相结合的核糖体上合成, 之后在前导序列
的指引下到达特定的细胞器, 部分蛋白质被分泌到
细胞外或留在细胞质中。蛋白质只有转运到正确部
位才能参与细胞的各种代谢活动, 协同保证生命活
动的正常运行。前导序列一般位于前体蛋白质N-端,
长度约20~80个氨基酸。有些蛋白质则由内部定位信
号指导它们在细胞内的转运和定位。内部定位信号
序列隐藏在成熟的蛋白质中, 不会被删除, 可能对
蛋白质的折叠和功能有重要作用[22]。线粒体是重要
的细胞器, 但线粒体的蛋白质合成能力有限。大量
的线粒体蛋白质是在细胞质中合成的, 在前导序列,
也称之为导肽的指引下, 通过TOM复合体和TIM23
转位酶分送到基质、内膜或膜间隙, 之后信号肽酶
切除导肽, 前体蛋白变为成熟蛋白。导肽通常是疏
水的 , 这种特征性结构有利于穿过线粒体的双层
膜。线粒体导肽有一些特征[23], 如富含丙氨酸、精
氨酸、亮氨酸和丝氨酸, 很少含带有负电荷的谷氨
酸、天冬氨酸以及异亮氨酸和赖氨酸, 在相对于切
割位点-2位的氨基酸为精氨酸, 是protease-I的识别
第 12期 白云凤等: 籽粒苋 AhNAD-ME的序列特征与表达 2195



图 1 籽粒苋 AhNAD-ME氨基酸序列与其他植物同源基因的系统进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree of AhNAD-ME and NAD-ME in other species based on amino acid sequence

图 2 AhNAD-ME的表达模式
Fig. 2 Expression profile of AhNAD-ME
2196 作 物 学 报 第 40卷


图 3 AhNAD-ME表达模式灰度分析
Fig. 3 Grayscale analysis of AhNAD-ME expression profile

位点, 第 8位为非极性氨基酸; 起始的 2个氨基酸为
Met-Leu。但同一种蛋白质的导肽在不同植物中差
异较大, 不具有高度保守的序列[24]。我们用 SignalP
在线分析了AhNAD-ME的氨基酸序列, 发现其不具
备导肽序列, 而 Long 等[25]微量测序结果表明成熟
的 AhNAD-ME 的 N-端缺少了 31个氨基酸。分析
AhNAD-ME N-端的 31个氨基酸序列, 发现丙氨酸、
精氨酸、亮氨酸和丝氨酸的含量占到 54.8%, 不含有
天冬氨酸以及异亮氨酸和赖氨酸等带负电荷的氨基
酸, 符合线粒体导肽的序列特征。由于线粒体导肽
的非保守性, 给判断蛋白质是否具有导肽序列带来
困难, 需要生物信息学技术和亚细胞蛋白质组学技
术相互印证。

图 4 图 AhNAD-ME原核表达 SDS-PAGE电泳
Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the AhNAD-ME expression
M: 蛋白质分子量标准; 1: 不含重组质粒的菌株 Transette (DE3) 在 30℃诱导 2 h后的表达产物; 2~9: 含有重组质粒的菌株 Transette
(DE3)的表达产物。其中 2、3、4和 5分别为 30℃诱导 0、2、4和 6 h后的表达产物; 6和 7为 30℃诱导 4 h后的沉淀和上清;
8和 9为 16℃诱导 4 h后的沉淀和上清液。
M: premixed protein marker; 1 refers to Transette (DE3) without recombined plasmid induced by IPTG under 30℃ for 2 h; 2, 3, 4, and 5
refer to Transette (DE3) with recombined plasmid induced by IPTG for 0, 2, 4, and 6 hours, respectively; 6 and 7 refer to precipitate and
supernatant liquor of Transette (DE3) with recombined plasmid induced by IPTG under 30℃ for 4 hours, respectively; 8 and 9 refer to pre-
cipitate and supernatant liquor of Transette (DE3) with recombined plasmid induced by IPTG under 16℃ for 4 hours, respectively.

植物的 NAD-ME有不同的构成形式, 如三色苋
(Amaranthus tricolor)、禾草龙爪稷 (Eleusine cora-
cana)[26]和洋野黍(Panicum dichotomiflorum)[27]叶片
的NAD-ME是同源八聚体, 籽粒苋的NAD-ME是异
源八聚体[22]。本研究用 AhNAD-ME 作 query 进行
BlastP, 表明双子叶植物的 α 亚基(62 kD)先与单子
叶植物的 α亚基聚合, 双子叶植物的 β亚基(59 kD)
则先与单子叶植物的 β 亚基聚合, 似乎表明在单、
双子叶植物分化之前这 2 个亚基的编码基因已经分
化。不同物种的 α 亚基均具有完整的苹果酸酶的结
构域, 似乎 β 亚基与 α 亚基的聚合对于酶活性调节
具有重要作用。深入研究不同植物的 NAD-ME构成
形式及其活性, 将有助于加深理解 NAD-ME功能的
自我调节和进化机制。
蛋白质的体外表达是功能鉴定和抗体制备的基
础。原核表达系统具有培养方法简单, 产量高、速
度快、稳定性好等优点[28-29]。但真核基因在大肠杆
菌中的正确表达受很多因子的影响, 如目的基因本
身的特性、诱导温度和时间、密码子偏好性等。
Transetta (DE3)菌株是 BL21的衍生系, 该菌株补充
了大肠杆菌缺乏的 6 种稀有密码子(AUA、AGG、
AGA、CUA、CCC、GGA)对应的 tRNA, 利于提高
真核基因在原核系统中的表达水平。本研究将
AhNAD-ME基因重组到 pEASY-T载体上, 电击转化
到 Transetta (DE3)菌株中, 在原核细胞中高效表达。
籽粒苋 AhNAD-ME 基因较大 , 开放可读框长度为
1872 bp, 编码 623个氨基酸[20]。原核表达蛋白的获
得为基因功能鉴定奠定了基础, 也为制备抗体提供
了抗原。
4 结论
籽粒苋 AhNAD-ME 具有苹果酸酶的完整功能
第 12期 白云凤等: 籽粒苋 AhNAD-ME的序列特征与表达 2197


域, 定位于线粒体基质中; 表达模式为光诱导、绿色
组织特异性表达。构建了 AhNAD-ME基因的原核表
达载体, 并在大肠杆菌中高效表达。
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