全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(4): 524530 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08001006-005, 2014ZX08009-024B), 江苏省杰出青年基金项目(BK2012010),
江苏省高校优势学科建设工程和“青蓝工程”等项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘巧泉, E-mail: qqliu@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87996648
第一作者联系方式: E-mail: wanghm@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87979056
Received(收稿日期): 2014-11-01; Accepted(接受日期): 2015-02-06; Published online(网络出版日期): 2015-03-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150303.1650.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00524
以谷蛋白 GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与
积累
王红梅 1 张昌泉 1 李钱峰 1 辛世文 2 刘巧泉 1,* 徐明良 1,3
1扬州大学农学院 / 植物功能基因组学教育部重点实验室 / 江苏省作物遗传生理重点实验室 / 粮食作物现代产业技术协同创新中心,
江苏扬州 225009; 2香港中文大学生物系, 香港; 3中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193
摘 要: 提高外源蛋白在特定目标组织器官中的表达量是转基因植物研究与开发的核心技术之一。谷蛋白是水稻种
子中最主要的贮藏蛋白, 其表达具有严格的时空特异性。为进一步研究谷蛋白信号肽序列在指导基因表达中的作用,
本研究克隆了水稻谷蛋白 GluA-2基因的启动子及其信号肽编码序列, 并与 GUS报告基因编码区融合, 构建了分别含
有和不含有信号肽的表达载体 p13GG和 p13GSG; 经农杆菌介导法分别转入同一水稻品种中, 获得了 20多个独立转
化子, PCR证明外源基因都已整合进了水稻基因组中。Northern杂交结果表明, 融合 GluA-2信号肽编码序列可显著
提高 GUS基因在水稻胚乳中的转录; 利用 GUS特异的抗体进行 Western杂交分析, 显示该信号肽序列可显著提高外
源蛋白在转基因水稻胚乳中的积累, 但是其所指导表达的 GUS 蛋白在水稻胚乳中并没有表现出相应的活性, 其机制
有待进一步深入解析。相关结果对于水稻品质改良基因工程研究以及以水稻种子作为生物反应器高效表达外源蛋白
具有重要的指导作用。
关键词: 转基因水稻; 信号肽; 谷蛋白; 胚乳; 基因表达
Enhancing Expression and Accumulation of Foreign Proteins by Using the
Signal Peptide of Glutelin GluA-2 in Endosperm of Transgenic Rice
WANG Hong-Mei1, ZHANG Chang-Quan1, LI Qian-Feng1, SUN Samuel Sing-Min2, LIU Qiao-Quan1,*, and
XU Ming-Liang1,3
1 Jiangsu Key Laboratory for Crop Genetics and Physiology / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of Ministry of Education /
Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 2 Department of Biology,
The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong, China; 3 College of Agriculture and Biotechnology, Chinese Agricultural University, Beijing
100193, China
Abstract: It is one of the key important techniques to enhance the expression of foreign proteins in target tissue/organ of trans-
genic plants. Glutelin is the major component of storage proteins in rice seeds, and its expression was tightly temporal and tissue-
specific, which is controlled by several mechanisms. To further reveal the function of the Glutelin signal peptide on expression of
target gene, in present study, we isolated the promoter and signal peptide-coding sequences of the glutelin GluA-2 gene, and fused
them transcriptionally to the GUS coding sequences. Beside, the construct without the GluA-2 signal peptide-coding sequences
was also generated as a control. Both constructs with the GUS chimeric genes, named as p13GSG and p13GG, were introduced
into the same rice variety by Agrobacterium-mediated transformation. More than twenty independent transgenic lines were gener-
ated for each construct, and the integration of the GUS chimeric gene was confirmed by PCR technique. The results from North-
ern blot analysis showed that, after fusing the GluA-2 signal peptide coding sequences between the GluA-2 promoter and the GUS
coding sequence, the transcription of GUS chimeric gene could be dramatically increased. Then, Western blot was carried out by
using the GUS-specific antibody, and the results obviously revealed that the accumulation of foreign proteins was significantly
enhanced in the endosperm of transgenic rice with the signal peptide. However, there was no or very low GUS activity in the
第 4期 王红梅等: 以谷蛋白 GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与积累 525


endosperm of transgenic rice plants with the signal peptide. These results were very useful to improve the grain quality of rice via
genetic engineering, especially produce foreign proteins in the seeds of rice as bioreactor.
Keywords: Transgenic rice; Signal peptide; Glutelin; Endosperm; Gene expression
在水稻种子中贮藏蛋白是仅次于淀粉的第二大
类贮藏成分, 绝大多数贮藏蛋白基因的表达具有严
格的组织与时空特异性, 并且还具有特定的蛋白靶
向元件[1-3]。贮藏蛋白基因在翻译成蛋白前体时, 其
氨基末端都含有一段信号肽(signal peptide)序列, 长
度随种类不同而异 ; 这些信号肽在贮藏蛋白及其
mRNA 的定位与运输中起重要作用。在贮藏蛋白基
因转录出成熟的 mRNA 后, 首先翻译成含信号肽的
前体蛋白, 由信号肽序列牵引定向地转移到粗糙型
内质网腔内, 随后这一信号肽序列从前体蛋白上被
剪除下来, 以便贮藏蛋白能正确地加工[4]。除了在目
标蛋白的正确定向中具有决定作用外, 信号肽序列
在调控基因表达水平上也具有重要的作用[5]。信号
肽序列的上述特性已在转基因植物研究中获得了很
好的应用。例如, 利用菜豆肌动蛋白内质网特异的
信号肽序列可明显增强大肠杆菌辅酶 Q在转基因烟
草中的转录与随后的表达量。由此可见, 贮藏蛋白
的信号肽序列对转基因植物中外源蛋白的表达与沉
积是有积极作用的。
谷蛋白是水稻胚乳中最主要的贮藏蛋白, 它一
般在种子发育的中后期大量合成并积累[6-8]。虽然它
与豆科植物中的 11S球蛋白的溶解性能完全不同 ,
但它们在氨基酸组成、蛋白质结构及其合成途径上
有许多相似之处 [9-10], 因此有时将水稻谷蛋白也归
为植物的球蛋白大家族中。水稻种子中含有 3 种不
同分子量的谷蛋白, 分别为 57 kD 的前体谷蛋白、
37~39 kD的酸性亚基(具酸性等电点)和 20~22 kD的
碱性亚基(具碱性等电点), 其中的酸性亚基和碱性
亚基是由谷蛋白前体经翻译后加工剪切而成[6]。成
熟的谷蛋白都是异质性的, 如谷蛋白酸性亚基至少
由 12个多肽组成, 而碱性亚基也至少含有 9个多肽[10]。
根据谷蛋白的氨基酸序列, 可将其分为 A 和 B 两个
大的亚家族, 分别称为 GluA 和 GluB, 每一个亚家
族都由多基因控制; GluA 或 GluB 内各多肽间氨基
酸序列的同源性在 80%~88%之间, 而两类不同亚家
族间多肽的氨基酸序列同源性却不到 65%[11]。从谷
蛋白基因或其 cDNA 推导的氨基酸序列分析, 在谷
蛋白前体的N-端有一个很典型的由 24个氨基酸残基
组成的信号肽, 该信号肽序列在引导谷蛋白前体定
位于内质网膜, 进而转运到内质网膜腔内的过程中
起重要作用[11-12]。
目前, 多数谷蛋白基因已被分离克隆 [11-15]。在
GluA亚家族中至少有 3种不同的编码基因, Takaiwa
和 Oono[15]将它们分别命名为 GluA-1、GluA-2 和
GluA-3, 它们在每个水稻单倍性基因组上都含有
5~8 个拷贝[12]。另外还有一个基因称为 GluA-4, 属
于假基因[15]。GluA亚家族内各成员间在基因组织结
构及一些特异序列上都很保守[12]。GluA-1与 GluA-2
的编码区核苷酸序列同源性高达 95%, 而 GluA-1
(或 GluA-2)与 GluA-3的同源性为 81%。GluA-2是水
稻谷蛋白家族的成员之一, 其前体蛋白的氨基末端
含有由 24个氨基酸组成的信号肽序列, 其编码基因
只在发育的水稻胚乳中特异性地表达[12-14]。
本研究克隆了水稻GluA-2基因的启动子及其信
号肽编码序列, 并与 GUS 报告基因编码区融合, 经
农杆菌介导转入水稻中, 以研究利用该基因信号肽
序列指导外源基因在转基因水稻中表达的作用。
1 材料与方法
1.1 植物材料
高产粳稻(Oryza sativa L. subsp. japonica)品种
武香粳9号为转化受体品种; 另一粳稻品种武运粳8
号基因组DNA作为模板用于克隆GluA-2基因启动子
和信号肽编码序列。
1.2 菌株与载体
载体 pGEM-T 购自 Promega 公司, 农杆菌菌株
EHA105 和双元载体 pCAMBIA1301 由澳大利亚
Jefferson 教授提供, 双元载体 pC1300/GN 由本实验
室自行购建[16], 大肠杆菌 DH5α 为本实验室保存。
限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自 TaKaRa公司。
1.3 GluA-2基因启动子和信号肽编码序列的克隆
根据Takaiwa等[13-14]和Okita等[12]发表的谷蛋白
基因序列, 在水稻谷蛋白 GluA-2 前体的 N-端含有
由 24个氨基酸组成的信号肽序列。根据已发表的水
稻谷蛋白 GluA-2 基因的核苷酸序列(GenBank 登录
号为 Y00687), 设计引物 Gt1P6 (5′-CAGGATCCAA
TGGCATCCATAAATCGCCCC-3′)和 Gt1P10 (5′-CA
CCATGGCTAGGGAGCCATCGCACAA-3′), 在引物
5′末端分别加上 BamH I和 Nco I酶切位点(下画线表
示); 以水稻品种武运粳 8 号基因组 DNA 为模板进
526 作 物 学 报 第 41卷

行 PCR扩增, 用于克隆 GluA-2 基因 ATG 下游+1 ~
+72 位碱基之间的信号肽编码序列(称为 GluA-2_SP
片段, 图 1-a)。设计引物 Gt1P1 (5′-GGCAAGCTTCA
CTGCTACCTTTAAGTAAC-3′)和 Gt1P3 (5′-CGAGG
ATCCGTTGTTGTAGGACTAATGAA-3′), 从水稻总
DNA中扩增 GluA-2基因翻译起始密码子 ATG上游
1.3 kb 长的启动子区。在 2 个引物的 5′末端分别加
上了 Hind III和 Bam HI限制性内切酶位点(下画线
表示)。扩增的启动子片段称为 GluA-2_Pro 片段。
PCR扩增程序为: 95℃、5 min; 95℃、1 min, 50℃、
1 min, 72℃、1 min, 30个循环; 72℃、10 min。PCR
产物经克隆入质粒 pGEM-T后进行序列分析。
1.4 GUS嵌合表达载体的构建
将 GluA-2_Pro 和 GluA-2_SP 片段连接在一起,
形成 GluA-2_Pro+SP片段。然后, 将该片段经 Hind
III 和 Nco I 双酶切, 替代双元载体 pCAMBIA1301
中 GUS 编码区上游的 CaMV35S 启动子, 即构建成
双元载体 p13GSG (图 1-b)。该载体中, 在 GluA-2_
Pro 启动子与 GUS 基因编码区(保留有自己的 ATG
序列)之间即含有 GluA-2 基因的信号肽编码序列,
信号肽编码序列与GUS编码区序列组成一个融合基
因, 经测序证明两者的读码框都没有发生改变。同
时, 为比较GluA-2基因信号肽编码序列对GUS基因
表达的影响, 又构建了只含有 GluA-2 基因启动子
(GluA-2_Pro)的GUS嵌合基因。用Hind III和 Bam HI
双酶切 GluA-2_Pro片段, 连接入质粒 pC1300/GN [16]
的相应酶切位点中, 构建成含 GluA-2_Pro 启动子与
GUS 报告基因相融合的质粒 p13GG (图 1-c)。构建
的载体经冻融法导入农杆菌 EHA105 中, 并用于水
稻转化。

图 1 谷蛋白 GluA-2信号肽序列(a)及双元载体 p13GSG (b)和 p13GG (c)中 T-DNA区的结构
Fig. 1 Sequences of rice GluA-2 signal peptide (a), and the T-DNA structure of binary vectors p13GSG (b) and p13GG (c)
P35S和 T35S分别代表 CaMV35S启动子和终止子, Hyg代表潮霉素抗性基因, TNOS代表 NOS终止子。
P35S and T35S represent the promoter and terminator of CaMV35S gene, respectively; Hyg means the hygromycin resistance gene,
TNOS means the terminator of NOS gene.

1.5 转基因水稻培育与 PCR分析
取武香粳 9号开花后 12 d左右的未成熟胚诱导
初生愈伤组织, 作为农杆菌介导转化的受体愈伤组
织。按刘巧泉等[17]的方法进行水稻组织培养及其农
杆菌介导的转化。按 CTAB 法[18]从转基因水稻叶片
中提取总 DNA; 参照刘巧泉等[17]的方法进行 GUS
编码区片段的 PCR 扩增, 预期 PCR 产物片段长为
500 bp左右。
1.6 胚乳总 RNA的提取及其 Northern杂交
按郑霏琴等[19]的冷酚法从水稻开花后 12~15 d
的未成熟种子中提取总 RNA。取 5~10 g 总 RNA,
经 55℃变性 20 min在 1.0%琼脂糖/甲醛凝胶分离后,
按 Sambrook 等[20]和 Roche 公司推荐的方法将 RNA
转移至尼龙膜(Roche)上, 在紫外交联仪(Bio-Rad)上
于 254 nm 处将 RNA 固定到膜上 , 再以地高辛
(Digoxigenin, Roche)标记的 GUS基因编码区序列作
为探针进行杂交。
1.7 种子蛋白的提取及其Western杂交
在转基因水稻成熟后, 收取成熟种子磨成米粉,
从其淀粉胚乳中分别提取可溶性蛋白和总蛋白。按
每 1 mg米粉 10 L抽提液加入可溶性种子总蛋白抽
提缓冲液(50 mmol L–1 Na3PO4, pH 7.0, 500 mmol L–1
第 4期 王红梅等: 以谷蛋白 GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与积累 527


NaCl), 在 37℃振摇 3 h; 然后在 15 000转 min–1、4℃
离心 20 min, 吸取上清液至另一新的离心管中, 保
存在 4℃备用。按 Bradford 法[21]测定蛋白浓度。按
Yamagata等[6]方法提取种子总蛋白。按 Sambrook等[20]
的 SDS-PAGE程序, 取适量种子总蛋白样品与 2样
品缓冲液混合, 99℃变性处理 10 min 后, 在 12%分
离胶和 5%积层胶组成的聚丙烯酰胺凝胶上于电泳
分离 ; 经 SDS-PAGE 分离后 , 将蛋白质转移到
Nitrocellulose膜上。按 AURORA Western blot chemi-
luminescent detection system (AURORA)推荐的程序
进行 Western 杂交, 所用的抗体为 GUS 特异的兔免
疫抗血清(购自 Abcam公司), 按 1∶10 000稀释。
1.8 GUS活性分析
参照 Jefferson[22]的组织化学染色方法检测转基
因水稻中的 GUS活性。按 Bradford[21]的方法测定总
蛋白含量。
2 结果与分析
2.1 转基因水稻植株的获得与鉴定
将构建的双元载体 p13GSG和 p13GG经冻融法
分别导入根癌农杆菌菌株 EHA105 感受态细胞中。
按本实验室已建立的农杆菌介导法转化水稻的程序[17],
将所构建的 2个 GUS融合基因分别导入水稻品种武
香粳 9 号中, 再生的小苗经生根壮苗后移入网室或
人工气候室盆栽。两个融合基因构建中, 各获得 20
个以上的独立转化子。含 GluA-2_Pro+GUS 融合基
因(载体 p13GG)的转基因植株称为 GG1、GG2 和
GG20等, 而含 GluA-2_Pro_SP+GUS融合基因(载体
p13GSG)的转基因植株称为 GSG1、GSG2和 GSG20
等。每个转化子各含有 2~6 个转基因水稻植株。转
基因水稻植株移栽入大田后 , 绝大多数能正常生
长、开花并结实。经 PCR 分析证明 GUS 融合基因
已整合进转基因水稻的基因组中(图 2-a)。

图 2 转基因水稻的 PCR (a)和未成熟种子总 RNA的 Northern杂交分析(b)
Fig. 2 PCR (a) and Northern blot (b) analyses of transgenic rice
图 a为转基因水稻植株总 DNA的 PCR分析, 所用引物为 GUS基因特异引物。图 b上图为 Northern杂交结果, 下图显示总 RNA中的
28S核糖体 RNA。总 RNA分别抽提自 GG和 GSG类转基因水稻植株或未转化植株(标记为 WT)的未成熟种子。杂交所用的探针为地
高辛标记的反义 GUS编码区片段。
Panels a and b show the PCR analysis using GUS specific primers of total leaf DNA and Northern blot analysis of total RNA from developing
seeds of rice plants, respectively. WT means wild type plant, GG and GSG mean the transgenic plants derived from the GG and GSG con-
structs, respectively. The probe for Northern blot is DIG-labeled anti-GUS DNA fragment.

2.2 融合 GluA-2 信号肽编码序列可显著提高外
源基因在水稻胚乳中的转录
在转基因水稻开花后 12 d 左右 , 从每一植株
上收取 40 粒左右未成熟种子 , 提取总 RNA, 并用
与 GUS 基因编码区序列特异的反义 DNA 探针进
行 Northern 杂交分析 , 结果显示在两类转基因水
稻植株未成熟种子中都有较高的 GUS 基因的转录
本(图2-b)。从杂交信号的强弱判断 , 虽然在不同转
化子间的表达量有较大的差异 , 但从总体情况分
析 , 在 GSG转基因水稻中 , 与 GluA-2信号肽序列
融合的 GUS 嵌合基因的表达水平明显高于 GG 类
转基因水稻种子中 GUS 嵌合基因(即不含信号肽
序列、只含 GluA-2 启动子序列的 GUS 嵌合基因)
的转录水平 , 说明有 GluA-2 信号肽序列的存在 ,
528 作 物 学 报 第 41卷

可提高目标基因在转基因水稻胚乳中的转录水平
(图 2-b)。
2.3 GSG转基因水稻中没有 GUS活性
在转基因水稻植株开花后 15 d左右, 从已检测
为 GUS基因阳性的转基因植株上分别取叶片、茎和
未成熟种子进行 GUS组织化学染色分析。结果显示,
对于 GG 类转基因水稻植株, 在未成熟种子胚乳中
能观察到很强的 GUS活性(图 3-a); 而在叶片、茎和
胚等组织中, 只有极少数转基因植株有 GUS 活性,
并且较弱, 而绝大多数观察不到 GUS 蓝色。显示
GluA-2 启动子可指导外源基因在水稻胚乳中特异性
表达, 这与之前的研究相一致[12]。但是, 在 GSG 转
基因水稻不同组织中都没有检测到 GUS 活性(图
3-b), 暗示与 GluA-2信号肽序列融合的 GUS嵌合基
因虽然可以在转基因水稻种子中高效转录, 但是检
测不到外源蛋白的活性表达。

图 3 转基因水稻植株 GG (a)和 GSG (b)发育种子中 GUS活性分析
Fig. 3 GUS activity analysis of developing seeds of GG (a) and GSG (b) transgenic rice

2.4 融合GluA-2信号肽序列显著提高GUS蛋白
在转基因胚乳中的积累
在转基因水稻成熟后, 收取成熟种子, 从其胚
乳中提取种子总蛋白, 用抗 GUS 的特异抗体进行
Western杂交分析, 结果显示在两类转基因水稻成熟
种子中都有 GUS蛋白的积累(图 4-a)。在不同转基因
水稻种子中 GUS 蛋白的表达量有所不同 , 这与
Northern 杂交的结果相类似。但从总体趋势上分析,
在 GSG 类转基因水稻胚乳中 GUS 蛋白的积累量明
显高于 GG 类转基因水稻中的(图 4-a)。进一步先从
转基因水稻成熟种子中提取可溶性蛋白, 然后再从
沉淀物中分离出总蛋白, 分别经 SDS-PAGE 分离后
进行 Western杂交分析。结果显示, 在 GG类转基因
水稻成熟种子可溶性蛋白中可检测到GUS蛋白的存
在, 而在 GSG类转基因水稻种子中可溶性蛋白中却
检测不到 GUS蛋白(图4-b)。在已不含可溶性蛋白的
总蛋白提取物中 , 两类转基因水稻中都有较强的
GUS蛋白积累, 但是GSG类转基因水稻种子中GUS
蛋白的积累量要显著高于前者(图 4-c), 这与种子中
总蛋白的分析结果相一致。
综合上述结果, 当在 GUS基因编码区前加接上
GluA-2 基因的信号肽编码序列时, 不仅可明显促进
GUS 融合基因的转录效率, 而且可使最终的蛋白产
物表达量也明显增多。对 Northern 和 Western 杂交
中各杂交信号进行扫描定量比较分析 , 可估算在
GSG类转基因水稻胚乳中 GUS蛋白的表达量比 GG
类转基因水稻中的要高 5~10倍。

图 4 转基因水稻植株成熟种子蛋白的 Western杂交分析
Fig. 4 Western blot analyses of proteins from mature seeds of
transgenic rice
种子蛋白分别抽提自 GG和 GSG类转基因水稻植株或未转化植
株(WT)的成熟种子, 其中 a为种子总蛋白, b为种子可溶性蛋白,
c为去除可溶性蛋白后的其他蛋白。每个泳道所加的蛋白量一
致。图左侧箭头所指为 GUS蛋白。
Proteins were extracted from the mature seeds of GG and GSG
transgenic plants or their wild type (WT), respectively. Panels a, b,
and c mean the total proteins, soluble proteins and the remaining
total proteins after extraction of soluble proteins, respectively. The
amount of proteins for each lane is same. The arrow at left indicates
the expressed GUS protein.
3 讨论
植物种子贮藏蛋白基因在翻译成前体蛋白时 ,
其 N 端都含有一段信号肽序列, 长度随物种和贮藏
蛋白种类的不同而异, 它们在贮藏蛋白及其 mRNA
分子的定位及运输中起重要作用[4,23]。水稻醇溶蛋白
第 4期 王红梅等: 以谷蛋白 GluA-2信号肽增强外源蛋白在转基因水稻胚乳中的表达与积累 529


mRNA上与信号肽对应的序列在将该mRNA定位到
特定的内质网膜上的过程中起着决定作用[24]。本研
究将谷蛋白 GluA-2 的信号肽编码序列融合在 GUS
编码区的 N-端, 并与 GluA-2 启动子组成融合基因,
在转基因水稻未成熟种子中的GUS转录本要明显高
于不含此信号肽编码序列的转基因水稻(图 2-b), 说
明这一序列的存在可增强外源基因的转录。Boehm
等[25]的研究指出, 菜豆肌动蛋白的内质网特异的信
号肽序列可增强大肠杆菌辅酶 Q在转基因烟草中的
转录与随后的表达量。Wright 等[26]利用水稻谷蛋白
Gt3 的信号肽序列将人细胞巨化病毒的糖蛋白 B 成
功地定位在转基因烟草种子中的蛋白贮藏囊泡中。
由此可见, 包括谷蛋白 GluA-2等在内的多数贮藏蛋
白的信号肽序列对于在转基因植物中外源蛋白的表
达与沉积是有积极作用的。
但在本研究获得的含 GluA-2 信号肽编码序列
的转基因水稻植株中, 却检测不到或只检测到极微
弱的 GUS活性, 可能与以下两点有关: (1)含信号肽
编码序列的GUS转录本在翻译后形成了仍含信号肽
序列的 GUS融合蛋白, 但该信号肽序列不能被正常
剪除下来, 因而影响了 GUS蛋白在随后的加工过程
(如糖基化等), 进而影响了它的酶活性。Coleman 等[4]
的研究发现在玉米的 fleury-2突变体中, 信号肽序列
不能从-玉米醇溶蛋白(-zein, 与水稻醇溶蛋白具
有极高的同源性, 属于同一类植物贮藏蛋白)的前体
上剪切下来, 从而影响了它的加工过程, 因此在该
突变体中的-玉米醇溶蛋白的量明显减少, 与其相
应的蛋白体的量也减少。(2)在GUS前体蛋白形成后,
由于有信号肽序列的存在, 使 GUS融合蛋白进入内
质网的内腔中, 并在这里进行加工, 最后像醇溶蛋
白一样沉积到蛋白体中, 从而影响了其酶活性的发
挥。Choi等[3]的研究指出, 将水稻醇溶蛋白基因中的
信号肽编码序列除去, 可有正常的醇溶蛋白转录本
产生, 但却检测不到最后的蛋白。因此, 他们认为信
号肽序列对于醇溶蛋白的稳定及其定位是非常重要
的。由此, 我们可推测, 不含信号肽序列的 GUS 蛋
白可能没有进入内质网腔内 , 而仍留在细胞质中 ,
从而能被检测出来; 而当加上信号肽序列后, 它进
入内质网腔中, 就很难被检测出来。此外, 本实验室
利用相似的表达策略, 利用 GluA-2信号肽指导一些
分子量较小的外源蛋白在水稻胚乳中表达, 结果显
示确可显著提高外源蛋白的表达量, 而且所表达出
的外源蛋白仍具有预期的活性 (结果待发表 )。但
是, 究竟是什么原因导致这种表达现象, 尚需进一
步试验证实。
利用转基因技术提高植物抗逆性、增加产量和
改善品质等已成为现代农业生物技术研究开发的重
点与热点[27-29]。尤其是近年来, 利用植物这一廉价
生产系统作为生物反应器, 来大量生产重组的编码
具重要功能的异源蛋白如医用活性多肽或疫苗、抗
体等, 是当前植物基因工程发展的一个重要领域之
一[30-34]。但是, 在植物生物反应器研究中存在一个
较为突出的问题, 即目标蛋白的表达量极低, 某些
蛋白还不能稳定积累下来[30-31]。因此, 建立高效稳
定的外源蛋白表达技术体系历来是该领域研究的重
点与难点。细胞代谢合成的蛋白质在植物与动物中
贮存的方式有所不同, 要实现外源重组蛋白在转基
因植物细胞中高效表达与稳定积累, 需要遵循与植
物本身蛋白一致的表达与贮存规律。其中关键技术
之一便是要应用受体植物来源的基因表达调控元件
和目标蛋白靶向序列。因此, 在以水稻种子或胚乳
为目标器官表达外源蛋白时, 使用像谷蛋白这样的
胚乳特异性表达基因的启动子及其 N-端信号肽编码
序列, 是实现目标蛋白在水稻种子组织中高效表达
的有效途径。
4 结论
克隆了水稻谷蛋白GluA-2基因的启动子及其信
号肽编码序列。结果表明, 融合 GluA-2信号肽编码
序列可显著提高 GUS基因在水稻胚乳中的转录, 进
一步可显著提高外源蛋白在转基因水稻胚乳中的积
累。相关结果对于水稻品质改良基因工程研究以及
以水稻种子作为生物反应器高效表达外源蛋白具有
重要的指导作用。
References
[1] Li X, Wu Y, Zhang D Z, Gallikin J W, Franceschi V R, Okita T W.
Rice prolamine protein body biogenesis: a BiP mediated process.
Science, 1993, 242: 1054–1056
[2] Okita T W, Li X, Roberts M W. Targeting of mRNAs to domains
of the endoplasmic reticulum. Trends Cell Biol, 1994, 4: 91–96
[3] Choi S B, Wang C, Muench D G, Ozawa K, Franceschi V R, Wu
Y, Okita T W. Messenger RNA targeting of rice seed storage pro-
teins to specific ER subdomains. Nature, 2000, 407: 765–767
[4] Coleman C E, Lopes M A, Gillikei J W, Boston R S, Larkins B A.
A defective signal peptide in the maize high-lysine mutant
fleury-2. Proc Natl Acad Sic USA, 1995, 92: 6828–6831
[5] Boehm R, Susanne S, Klaus S, Li S M, Lutz H D. Active expres-
sion of the ubiA gene from E. coli in tobacco: influence of plant
ER-specific signal peptides on the expression of a membrane-
530 作 物 学 报 第 41卷

bound prenyltransferase in plant cells. Transgenic Res, 2000, 9:
477–486
[6] Yamagata H, Sugimoto T, Tanaka K, Kasai Z. Biosynthesis of
storage proteins in developing rice seeds. Plant Physiol, 1982,
70: 1094–1100
[7] 刘巧泉, 周丽慧, 王红梅, 顾铭洪. 水稻种子贮藏蛋白合成的
分子生物学研究进展. 分子植物育种, 2008, 6: 1–15
Liu Q Q, Zhou L H, Wang H M, Gu M H. Advances on biosyn-
thesis of rice seed storage proteins in molecular biology. Mol
Plant Breed, 2008, 6: 1–15 (in Chinese with English abstract)
[8] Ren Y L, Wang Y H, Liu F, Zhou K N, Ding Y, Zhou F, Wang Y,
Liu K, Gan L, Ma W W, Han X H, Zhang X, Guo X P, Wu F Q,
Cheng Z J, Wang J L, Lei C L, Lin Q B, Jiang L, Wu C Y, Bao Y
Q, Wang H Y, Wan J M. GLUTELIN PRECURSOR
ACCUMULATION3 encodes a regulator of post-Golgi vesicular
traffic essential for vacuolar protein sorting in rice endosperm.
Plant Cell, 2014, 26: 410–425
[9] Zhao W M, Gatehouse J A, Boulter D. The purification and par-
tial amino acid sequence of a polypeptide from the glutelin frac-
tion of rice grains: homology to pea legumin. FEBS Lett, 1983,
162: 96–102
[10] Wen T N, Luthe D S. Biochemical characterization of rice glute-
lin. Plant Physiol, 1985, 78: 172–177
[11] Takaiwa F, Oono K, Wing D, Kato A. Sequence of three
members and expression of a new major subfamily of glutelin
genes from rice. Plant Mol Biol, 1991, 17: 875–885
[12] Okita T W, Hwang Y S, Hnilo J, Kim W T, Aryan A P, Larson
R, Krishnan H B. Structure and expression of the rice glutelin
multigene family. J Biol Chem, 1989, 264: 12573–12581
[13] Takaiwa F, Ebinuma H, Kikuchi S, Oono K. Nucleotide se-
quence of a rice glutelin gene. FEBS Lett, 1987, 221: 43–47
[14] Takaiwa F, Kikuchi S, Oono K. A rice glutelin family: a major
type of glutelin mRNAs can be divided into two classes. Mol Gen
Genet, 1987, 208: 15–22
[15] Takaiwa F, Oono K. Genomic DNA sequences of two new genes
for new storage protein glutelin in rice. Jpn J Genet, 1991, 66:
161–171
[16] 刘巧泉, 于恒秀, 张文娟, 龚志云, 顾铭洪. 番茄 rbcS3A 启动
子控制的外源基因在转基因水稻中的表达特性. 植物生理与
分子生物学学报, 2007, 33: 251–257
Liu Q Q, Yu H X, Zhang W J, Gong Z Y, Gu M H. Expression of
the GUS fusion gene controlled by the tomato rbcS3A promoter
in transgenic rice. J Plant Physiol Mol Biol, 2007, 33: 251–257
(in Chinese with English abstract)
[17] 刘巧泉, 张景六, 王宗阳, 洪孟民, 顾铭洪. 根癌农杆菌介导
的水稻高效转化系统的建立 , 植物生理学报 , 1998, 24:
259–271
Liu Q Q, Zhang J L, Wang Z Y, Hong M M, Gu M H. A highly effi-
cient transformation mediated by Agrobacterium in rice. Acta Phyto-
physiol Sin, 1998, 24: 259–271 (in Chinese with English abstract)
[18] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA. Nucl Acid Res, 1980, 8: 4321–4325
[19] 郑霏琴, 王宗阳, 高继平. 水稻胚乳中核糖核酸的分离. 植物
生理学通讯, 1993, 29: 438–440
Zheng F Q, Wang Z Y, Gao J P. Isolation of nucleic acids from
rice endosperm. Plant Physiol Commun, 1993, 29: 438–440 (in
Chinese with English abstract)
[20] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: a Labo-
ratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989
[21] Bradford H M. A rapid and sensitive method for the quantifica-
tion of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein-dye binding. Anal Biochem, 1976, 72: 248–254
[22] Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene
fusion system. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5: 387–405
[23] Fukuda M, Wen L, Satoh-Cruz M, Kawagoe Y, Nagamura Y,
Okita T W, Washida H, Sugino A, Ishino S, Ishino Y, Ogawa M,
Sunada M, Ueda T, Kumamaru T. A guanine nucleotide exchange
factor for Rab5 proteins is essential for intracellular transport of
the proglutelin from the Golgi apparatus to the protein storage
vacuole in rice endosperm. Plant Physiol, 2013, 162: 663–674
[24] Mitsukawa N, Konishi R, Uchiki M, Masumura T, Tanaka K.
Molecular cloning and characterization of a cysteine-rich
16.6-kDa prolamin in rice seeds. Biosci Biotechnol Biochem,
1999, 63: 1851–1858
[25] Boehm R, Susanne S, Klaus S, Li S M, Lutz H D. Active expres-
sion of the ubiA gene from E. coli in tobacco: influence of plant
ER-specific signal peptides on the expression of a mem-
brane-bound prenyltransferase in plant cells. Transgenic Res,
2000, 9: 477–486
[26] Wright K E, Prior F, Sardana R, Altosaar I, Dudani A K, Ganz P
R, Tackaberry E S. Sorting of glycoprotein B from human cy-
tomegalovirus to protein storage vesicles in seeds of transgenic
tobacco. Transgenic Res, 2001, 10: 177–181
[27] 范云六, 张春义. 迎接21世纪农作物生物技术的挑战, 生物技
术通报, 1999, (5): 1–6
Fan Y L, Zhang C Y. Greeting the challenges of crop biotechno-
logy in the 21st century. Biotechnol Inf, 1999, (5): 1–6 (in Chi-
nese with English abstract)
[28] Ye X D, Al-Babili S, Klöti A, Zhang J, Lucca P, Beyer P, Pot-
rykus I. Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosyn-
thetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm. Science,
2000, 287: 303–305
[29] Sun S S M, Liu Q Q. Transgenic approaches to improve the nutri-
tional quality of plant proteins. In Vitro Cell Dev Biol-Plant, 2004,
40: 155–162
[30] Fischer R, Stoger E, Schillberg S, Christou P, Twyman R M.
Plant-based production of biopharmaceuticals. Curr Opin Plant
Biol, 2004, 7: 152–158
[31] Rybicki E P. Plant-made vaccines for humans and animals. Plant
Biotech J, 2010, 8: 620–637
[32] Yang Z Q, Liu Q Q, Pan Z M, Yu H X, Jiao X A. Expression of
the fusion glycoprotein of newcasstle disease virus in transgenic
rice and its immunogenicity in mice. Vaccine, 2007, 25: 591–598
[33] Cheung S C K, Liu L Z, Sun S S M, Liu Q Q, Lan L L, Chan J,
Tong P. Inhibition of human MCF-7 breast cancer cells and
HT-29 colon cancer cells by rice-produced recombinant human
insulin-like growth binding protein-3 (rhIGFBP-3). PLoS One,
2013, 8: e77516
[34] Bundó M, Montesinos L, Izquierdo E, Campo S, Mieulet D,
Guiderdoni E, Rossignol M, Badosa E, Montesinos E, San
Segundo B, Coca M. Production of cecropin A antimicrobial
peptide in rice seed endosperm. BMC Plant Biol, 2014, 14:
102