全 文 ：第26卷 第5期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 5
2000 年9月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA Sep. , 2000
甘薯贮藏蛋白基因启动子和信号肽编码区克隆及序列分析X
陈克贵　王海燕　张义正XX
(四川大学生命科学学院　四川成都 610064)
提　要　根据已知的甘薯块根贮藏蛋白A 基因序列, 设计和合成了两对 PCR 引物, 从南薯88基因组
中分别扩增出该基因的启动子和启动子加信号肽编码区两种DNA 片段, 并测定了它们的DNA 序列。
将测定的序列与 GenBank 中的甘薯贮藏蛋白基因的相应序列进行同源性分析, 结果发现, 其中既有与
GenBank 中甘薯贮藏蛋白基因启动子完全相同的片段, 也有发生了较大变异的片段, 这些变异涉及到
调控表达的顺式作用元件。在信号肽编码区, 虽存在碱基序列变异, 但比启动子区更保守, 特别是原
肽编码区未发现碱基变异。
关键词　甘薯; 贮藏蛋白基因; 启动子; 信号肽编码区; PCR; 序列分析
Clon ing and Sequence Ana lysis of the Promoter and Signa l Peptide-
coding Reg ion in Sporam in Gene from Ipom oea ba ta tas
CH EN Ke2Gui　WAN G H ai2Yan　ZHAN G Yi2Zheng
(College of L if e S cience, S ichuan U niversity , Chengd u, S ichuan 610064)
Abstract　Two DNA fragm en ts, p romoter (fragm en t 1) and p romoter w ith signal pep tide2
coding sequence (fragm en t 2) of spo ram in from sw eet po tato N ah shu 88, a w idely cultivated
variety in Ch ina, w ere amp lified by the po lym erase chain reaction ( PCR ). T he amp lified
fragm en ts w ere cloned and then sequenced. Sequence comparison show ed that the fragm en t 1
sequence w as almost iden tical to the co rresponding region of spo ram in gene, gSPO 2A 1, but
differen t from that of gSPOR 5231. T he sequence of fragm en t 2, including som e cis regulato ry
elem en ts, w as differen t from the co rresponding region of gSPO 2A 1 and gSPOR 5231.
Comparison of signal pep tide2coding sequence among fragm en t 2, gSPO 2A 1 and gSPOR 5231
show ed 8 nucleo tides changed, w h ich appeared in the region of p re2segm en t, no t in the region of
p ro2segm en t. T hese results indicated that the 5′2flank ing region of spo ram in genes w as m uch
conserved, but there w as som e variation, especially in the p romoter region, w h ich m aybe p lay
som e ro le in gene exp ression.
Key words　 Ip om oea batatas; Spo ram in gene; P romoter; Signal pep tide2coding region; PCR;
Sequence analysis
甘薯贮藏蛋白 ( spo ram in) 是甘薯 ( Ip om oea batatas L am ) 块根主要的贮藏蛋白质, 占块根
可溶性蛋白质80% [ 1 ] , 位于液泡[ 2 ]。成熟的贮藏蛋白分子量为20 kD [ 3 ]。从已克隆的甘薯贮藏
X
XX 通讯联系人
收稿日期: 1999205206, 接受日期: 1999210214
四川省“九五”农业生物技术育种攻关资助项目

蛋白基因的核苷酸序列分析发现, 贮藏蛋白基因存在一个基因家族, 该家族可分为A 和B 两
个亚族, 两亚族基因间的核苷酸同源性为80% , 而亚族内基因的同源性大于90% [ 3, 4 ] , 基因中
无内含子[ 5 ]。在六倍体甘薯的染色体组中, 约有60个贮藏蛋白基因[ 5 ]。与其它液泡蛋白不一
样, 甘薯贮藏蛋白并不是糖蛋白[ 1 ] , 它在膜结合的核糖体上合成比成熟蛋白多37个 (A 亚族)
或35个 (B 亚族)氨基酸残基的前体, 包括N 末端疏水的信号序列、16个氨基酸的原肽附加片
段和成熟肽[ 3, 4, 6 ]。
目前对甘薯贮藏蛋白如何定位到达液泡形成成熟蛋白的研究, 已取得了明显进展[ 2, 7, 8 ]。
对该基因的表达调控研究发现: 在甘薯贮藏蛋白基因5′2端上游存在保守的蔗糖盒 ( suc
box) [ 9, 10 ] , 核蛋白因子 SPF1可以结合到甘薯贮藏蛋白基因5′2端上游的 SP8a (A CT GT GTA )
和 SP8b (TA CTA T T ) 序列[ 11, 12 ] , 对基因表达有调控作用。作为基因家族中的不同基因是否
表达水平存在着不同, 其表达有无时空差异等问题, 还未见研究结果报道, 故有必要对甘薯
贮藏蛋白基因家族各基因5′2端序列进行进一步研究。基于这一目的, 本研究采用 PCR 方法
扩增, 克隆到多个甘薯贮藏蛋白基因5′2端序列, 并进行了序列同源性分析。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
甘薯品种南薯88为四川省南充地区农科所培育, 是近年来大面积推广的栽培品种。大肠
杆菌菌株XL 12B lue[ 13 ]和质粒 pU C19[ 14 ]为本室保存。
聚合酶链式反应 (PCR ) 试剂盒及各种限制性内切酶购自德国Boeh ringer M annheim 公
司。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　甘薯总DNA 的制备　　取甘薯叶片作材料, 按Roger 所述的方法[ 15 ]提取总DNA。
1. 2. 2　PCR 扩增　　根据 PCR 试剂盒 (德国Boeh ringer M annheim 公司) 说明书设计 PCR
反应。总体积50 LL , 其中模板DNA 100ng, dN T P 0. 2 mmolö L , 引物浓度2 Lmolö L。将各组
分混合均匀, 在美国M J R esearch 公司 PTC2100型 PCR 仪上进行反应: 94℃ 1 m in, 58℃ 1
m in, 72℃ 1. 5 m in, 经30个循环后再72℃延伸8 m in。
1. 2. 3 　PCR 产物克隆　　获得的 PCR 产物, 先用 PCR 纯化试剂盒 (德国 Boeh ringer
M annheim 公司) 纯化, 再经 H ind ¸ 和B am H É 酶切, 最后将其克隆到 pU C19的 H ind ¸ 和
B am H É 位点。
1. 2. 4　DNA 序列测定和分析　　应用 Sanger 双脱氧核苷酸链终止法, 在 Pharm acia AL F
Exp ress 全自动测序仪上进行双链DNA 测序, 测定的序列用DNA S IS 软件分析。
1. 2. 5　其它DNA 操作方法　　质粒DNA 的制备、酶切、转化参照 Sam brook 等主编《分子
克隆实验指南》[ 16 ]的方法, 按本室规范化操作进行。
2　结果和讨论
2. 1　甘薯贮藏蛋白基因启动子和信号肽编码区的 PCR 扩增和克隆
根据H atto ri等已发表的甘薯贮藏蛋白A 基因核苷酸序列[ 5 ] , 设计并合成如下引物:
　　　　　F (正向引物) : 5′2CGAA GCT TCA T T GGA CA CT T GGA CGG23′
　　　　　R 1 (反向引物) : 5′2CCA GGGA TCCA T GGT GGCA GA T GA GA 23′
5955期　　　　　　陈克贵等: 甘薯贮藏蛋白基因启动子和信号肽编码区克隆及序列分析　　　　　　　　

　　　　　　　R 2 (反向引物) : 5′2A T TA GGA TCCA T GGCGGGT TCGT GT GT G23′
在正向引物中设计了一个H ind¸ 酶切位点 (下横线序列) , 在反向引物中设计了一个B am H É
酶切位点 (下横线序列) , 以便克隆到 pU C19的多克隆位点区。
图1　　甘薯贮藏蛋白基因5′2
端片段的 PCR 扩增
F ig. 1　　The PCR fragm ents of 5′flank ing
region of sporam in gene from
Ipom oea batatas
1. 负对照; 2. 扩增的启动子片段;
3. 扩增的启动子加信号肽编码区序列片段;
4. DNA 分子量标准物 (KE coR É ö H ind¸ )
1. negative contro l; 2. fragm ent of p romoter;
3. fragm ent of p romoter w ith signal2pep tide
coding region; 4. DNA m arker
(KE coR É ö H ind¸ )
　　F 和R 1组成一对引物, 用于扩增甘薯贮藏蛋白基因
启动子序列 (包括起始密码子A T G) ; F 和 R 2组成另一
对引物, 用于扩增该基因启动子和信号肽编码区。PCR
扩增结果如图1所示, F 和 R 1引物扩增出约0. 4 kb 的片
段 (图1第2道) , F 和R 2引物扩增出约0. 5 kb 的片段 (图1
第3道) , 未加DNA 摸板的对照没有扩增 (图1第1道)。
将 PCR 扩增产物用 PCR 纯化试剂盒纯化后, 经
H ind¸ 和B am H É 完全酶切, 与H ind¸ 和B am H É 酶切
pU C19载体连接, 转化大肠杆菌XL 21 blue。将得到的转
化子用牙签逐个接种到加有X2Gal 的LM [ 16 ]培养基上培
养, 筛选出白色菌落, 接种白色菌落, 培养提取质粒
DNA 并电泳检查, 有插入片段的重组质粒经 H ind¸ 和
B am H É 酶切鉴定, 共获得6个重组子, 其中4个是有0. 4
kb 片段插入的重组质粒; 2个是有0. 5 kb 片段插入的重
组质粒。
2. 2　甘薯贮藏蛋白基因启动子和信号肽编码区的序列
分析
测定4个重组子中的插入片段核苷酸序列, 其中三个
为基因启动子区 (图2的 É 、˚ 、¸ ) , 另外一个包括基因
启动子和信号肽编码区片段 (图2的Ì )。三个基因启动子
区序列均为345 bp (不包括起始密码子A T G) , 片段 É 和
˚ 的序列完全一致, 并与国外报道甘薯贮藏蛋白基因
gSPO 2A 1 (GenBank accession num ber X13509, 图2˝ )相应区段一致, 而片段¸ 仅在- 39位上
碱基不一样, 不是C 而是 T。它们均含- 106位到- 99位的 TA TA 盒 (TA TAAA T T ) , - 252
位到- 248位的CA T 盒 (CAA TC) , - 247位到- 240位的 SP8a 盒 (A CT GT GTA ) , 还有4个蔗
糖诱导盒: 位于- 356到- 338的糖盒32 (CA CAAA TCA T T TCTA T TA T)、- 333到- 301的糖
盒31 (CCCAAA TCA T T TCT GT TA T)、- 195到- 168的糖盒2 (A CGA T GAAAA T TCT GAA 2
TA CAAAAA GAA )和- 113到- 79的糖盒1 (CCT TA TCTCT T GT T GTCTA TAAA T T GGA T2
GCA T GCA T GA GA GCCC)。片段 Ì 总长479 bp , 其中启动子长368 bp , 比上述三个片段长23
bp , 与三个片段同源性约为71% , 存在较大的差异。这些差异表现在: 第一, 位于- 78到- 74
位AA CA C 的重复突变使 TA TA 盒与转录起始位点间核苷酸增加了5 bp; 第二, 糖盒1中出
现了核苷酸的变异; 糖盒2已经消失; 第三、相连的 CA T 盒和 SP8a 盒也被插入的核苷酸分
开, 且 SP8a 盒3′2端最后一个碱基也由A 变成了C; 第四、虽然糖盒31未发生改变, 但糖盒32
却已失去。
为了更多了解甘薯贮藏蛋白基因启动子的变异, 图2中列举了另一甘薯贮藏蛋白基因
gSPOR 5231 (GenBank accession num ber U 12436) 启动子的序列 (图2˛ )。该基因相应片段长
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338 bp , 比前述各片段均短, 与É 、˚ 和¸ 片段的同源性为83% 左右, 与Ì 片段的同源性约为
80% , 其主要差异是: 第一、TA TA 盒更靠近转录起始位点; 第二、糖盒1已完全不见; 第三、
糖盒2 内的碱基序列也有一定变异; 第四、糖盒32也已失去。
从上述结果分析可以看出, 甘薯贮藏蛋白基因启动子既有很强的保守性, 也有较大的变
异性。特别是本研究与其他人的研究, 虽然使用了不同的品种, 但却克隆到序列完全相同的
启动子片段, 这种情况出现在基因5′2端非编码区是少见的。另一方面, 本研究在同一品种中
也克隆到了较大变异的片段, 在甘薯贮藏蛋白基因家族中, 它们可能对基因表达的时空特异
性起作用。结合基因 gSPOR 5231序列, 在糖盒中序列的变异, 对受糖调控的甘薯贮藏蛋白基
因[ 17, 18 ]的表达会有一定影响, 而且 TA TA 盒位置的变化, 也会对基因的表达起着某种作
用[ 19 ]。
再来看甘薯贮藏蛋白基因信号肽编码区序列。把所测片段 Ì 序列与已发表基因 gSPO 2A 1
和 gSPOR 5231的信号肽编码区进行比较 (图2) , 在111个核苷酸中共有8处发生碱基突变, 而
且均在前肽编码的21个氨基酸区段内, 既有转换也有颠换, 原肽区段无一碱基突变。其中片
段 Ì 的18位C 变 G, 24位和33位的 T 变C (在片段˛ 的24位发生同样变异) , 60位的A 变C;
片段˛ 的21位A 变 T , 51位的C 变 G, 但这些变化均发生在密码子的第三位, 不会引起氨基
酸变异; 片段˛ 的10位和38位的C 变 T , 发生在密码子的第一和第二位, 导致亮氨酸和丝氨
酸变为苯丙氨酸。因此, 来自南薯88的甘薯贮藏蛋白基因信号肽氨基酸序列与基因 gSPO 2A 1
信号肽完全相同, 与 gSPOR 5231的信号肽有两个氨基酸差别。由此看来, 尽管三者在5′2端启
动子区有较大的变异, 而在信号肽区变异则较小, 特别是原肽编码区段十分保守。
探明甘薯贮藏蛋白基因及其表达调控, 不仅在理论上对该基因家族有更深入的了解, 而
且对改良甘薯的品质具有重要的实际价值。本研究仅是一个初步的探讨, 其结果是很有意义
的, 值得更深入的研究。
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