全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(4): 745−750 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31271756, 31171619)和高等学校学科创新引智计划(111计划)项目(B12006)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 梁颖, E-mail: yliang@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: shuwenwang520@163.com
Received(收稿日期): 2013-07-03; Accepted(接受日期): 2014-01-12; Published online(网络出版日期): 2014-02-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140214.1018.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00745
BnMAPK1超量表达提高甘蓝型油菜菌核病抗性
王淑文 陆俊杏 万华方 翁昌梅 王 珍 李加纳 卢 坤 梁 颖*
西南大学农学与生物科技学院 / 重庆市油菜工程技术研究中心 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400715
摘 要: 植物 MAPKs (mitogen-activated protein kinases)在多种生物和非生物胁迫中起重要作用。课题组前期克隆了甘
蓝型油菜 BnMAPK1 基因, 并获得 BnMAPK1 超量表达植株。本文以甘蓝型油菜中油 821DH 系为对照, 以超量表达
BnMAPK1 的转基因油菜为试材, 采用离体叶片接种的方法, 测定染病叶片病斑的大小及病斑周围叶片的草酸含量, 并
用 qRT-PCR检测转基因植株 4个病程相关蛋白(OXO、Cu/Zn-SOD、PR2、PR3)编码基因在核盘菌胁迫下的相对表达动
态变化。结果表明, 甘蓝型油菜 BnMAPK1超量表达可显著抑制核盘菌对离体叶片的侵染, 控制染病叶片内草酸毒素的
积累, 可能可以解除核盘菌对 OXO表达的负调控, 使另外 3个与病程相关蛋白基因(Cu/Zn-SOD、PR2、PR3)表达上调。
表明 BnMAPK1超量表达可有效提高油菜菌核病抗性。
关键词: BnMAPK1; 甘蓝型油菜; 菌核病; 抗性; 病程相关基因
Overexpression of BnMAPK1 Enhances Resistance to Sclerotinia sclerotiorum
in Brassica napus
WANG Shu-Wen, LU Jun-Xing, WAN Hua-Fang, WENG Chang-Mei, WANG Zhen, LI Jia-Na, LU Kun, and
LIANG Ying*
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University / Chongqing Rapeseed Engineering & Technology Research Center / Engineering
Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400715, China
Abstract: Plant MAPKs (mitogen-activated protein kinases) play an important role in defense to biotic and abiotic stresses. In our
previous studies, BnMAPK1 was cloned in Brassica napus and transgenic oilseed rape plants overexpressing BnMAPK1 were
obtained. In this study, B. napus ZY821DH line was used as control and the corresponding transgenic plants overexpressing
BnMAPK1 were used as experimental materials. The resistance to S. sclerotiorum and oxalic acid content were tested by using
detached leaves inoculated with the pathogen. The dynamic changes of the relative expression of four pathogenesis-related genes,
OXO, Cu/Zn-SOD, PR2, and PR3 were detected in the leaves inoculated with the pathogen. The results showed that the
overexpression of BnMAPK1 significantly inhibited the invasion of the pathogen, controlled the accumulation of oxalic acid in the
inoculated leaves, and maybe finally relieved the negative regulation of OXO expression caused by the pathogen and up-regulated
the expression of the other three genes, Cu/Zn-SOD, PR2, and PR3. The results indicated that overexpression of BnMAPK1 can
effectively improve the resistance to S. sclerotiorum in oilseed rape.
Keywords: BnMAPK1; Brassica napus; Sclerotinia rot; Resistance; Pathogenesis-related genes
促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein
kinases, MAPK)级联反应是真核生物信号传递网络中的
重要途径之一。在植物中, MAPK除与许多生命活动有关
外, 在应对冷、热、氧化、紫外线、干旱、病原菌侵害等
多种非生物和生物胁迫方面也起着重要作用[1]。近年来对
植物MAPK功能的研究已逐步深入 , 越来越多的研究表
明, MAPKs在植物抗病防卫中起重要作用, 在多种植物中
发现了大量MAPK家族成员 , 并不同程度地研究了其功
能, 研究最深入的是拟南芥的MAPK1。近年来对其他植物
的MAPK1也有相关研究, 许多研究均表明MAPK1有助于
提高植株的抗逆性[2]。如Mizoguchui等[3]研究表明拟南芥
AtMAPK1的表达水平在盐胁迫处理后会增强。谷令坤 [4]
研究发现玉米ZmOSMAPK1能够被干旱、高盐、机械损伤
诱导表达。而至今还未见对油菜MAPK1的研究报道。
746 作 物 学 报 第 40卷


油菜(Brassica napus)作为一种重要的油料作物 , 在
我国乃至世界均占有重要的地位。但每年菌核病的危害,
严重降低了油菜的产量和品质[5]。菌核病是影响我国油菜
生产的主要因子之一, 在我国各油菜产区, 特别是长江中
下游产区, 表现得尤为突出。尽管也采取了一些化学防治
措施但未能从根本上解决问题, 近年来, 培育高抗油菜品
种和寻找有效抗性材料已成为研究者们的主要目标 , 但
在油菜菌核病抗源筛选上仍未找到理想的免疫材料。目前,
发掘油菜中与菌核病抗性相关的基因并通过转基因方法
提高该病害的抗性也已为研究热点。
本研究组前期以甘蓝型油菜中油821DH系为试材 ,
克隆了BnMAPK1, 并研究了BnMAPK1基因的表达特性及
其在逆境因子诱导下的转录表达特征。同时还构建了以
CaMV 35S为启动子, 超量表达BnMAPK1的载体, 转化甘
蓝型油菜获得转基因株系 , 并对超量表达转基因株系进
行分子鉴定和表型鉴定。本研究在此基础上, 以甘蓝型油
菜中油821DH系(对照)和转基因BnMAPK1超量表达植株
为材料 , 调查接种核盘菌后转基因植株和对照之间的抗
病性差异 , 染病叶片草酸含量差异以及草酸氧化酶
(OXO)、超氧化物歧化酶 (Cu/Zn-SOD)、β-1,3-葡聚糖酶
(PR2)和几丁质酶(PR3)编码基因的相对表达差异。探讨
BnMAPK1基因在油菜抗菌核病方面的作用及机制, 以期
从油菜中挖掘更多提高抗病性的相关基因 , 为油菜的分
子育种和分子设计提供理论依据 , 也为其他植物的
MAPK1研究提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于2012年在重庆市油菜工程技术研究中心进行。
甘蓝型油菜中油821DH系(对照)和转基因821DH植株的2
个株系 (ov1, ov2)均由重庆市油菜工程技术研究中心提
供。于温室种植并按常规栽培管理材料。核盘菌由重庆市
油菜工程技术研究中心分离、保存。参照万华方等[6]的方
法培养、活化以及接种核盘菌。
1.2 离体叶片抗菌核病鉴定
供试材料长至12片真叶时, 取倒数第3片叶放入保鲜
盒迅速带回实验室, 参照Mei等 [7]的方法, 将菌丝块菌面
贴于叶面主叶脉两侧, 保持接种环境内温度23℃, 相对湿
度90%。接种36 h后, 测量病斑的长径和短径。根据公式S
= π × a × b/4计算病斑面积, 其中a、b分别为病斑长径(cm)
和短径(cm)。每个处理设置3次重复。
1.3 叶片草酸含量测定
接种 0、6和 12 h后分别用无菌打孔器(内径 1.1 cm)
沿菌丝块周围在叶片打孔取样, 接种 24 h和 36 h后的叶
片去掉病斑后, 再用无菌打孔器沿病斑周围在叶片打孔。
称量后放入研钵加入 0.5 mol L–1的盐酸 3 mL, 研磨至匀
浆, 转入试管, 超声波处理 15 min, 加入 3 mL 去离子水
静置过夜, 14 000 × g离心 20 min, 将上清液转入离心管。
采用高效液相色谱法(HPLC)[8]测定草酸含量, 重复 3次。
在 VenusilASBC18 (4.6 mm × 250.0 mm, 5 µm)上, 选
用 0.04 mol L–1 的 KH2PO4-H3PO4 缓冲液(pH 2.4)采用
Waters2998 二极管数组紫外检测器于 214 nm 检测, 不连
续梯度洗脱, 柱温 35℃, 进样量 20 µL, 检测时间 20 min。
1.4 总 RNA提取
接种核盘菌0、6、12、24和36 h后去除病斑, 取其周
围约100 mg叶片, 于液氮中迅速研磨成粉末, 并用试剂盒
RNAprep pure Plant Kit (天根生化科技(北京)有限公司)提
取总RNA, 用RNase-free DNase I (Fermentas公司 )去除
DNA杂质。用Thermo NanoDrop 2000c微量紫外分光光度
计测定RNA浓度, 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的
完整性。
1.5 总 cDNA第 1链合成
用cDNA反转录试剂盒 (iScript cDNA Synthesis Kit,
Bio-Rad), 按照说明书合成总cDNA第1链。以20 μL反应体
系 [5×iScript Reaction Mix 4 μL、 iScript Reverse Tran-
scriptase 1 μL、RNA模板(1 μg总RNA) 11 μL、Nuclease-free
water 4 μL]进行反转录 , 反应程序为25 5 min℃ , 42 ℃
30 min, 85 5 min℃ , 4 10 min℃ 。将获得的cDNA稀释50倍,
–20℃保存用于qRT-PCR分析。
1.6 引物设计和 qRT-PCR
参照 NCBI 数据库中相关基因的编码序列, 用软件
Geneious 4.85 设计引物。所用的引物及内参基因 Actin7
和 UBC21 的序列见表 1。用 qRT-PCR 试剂盒 (SsoA-
dvantanced SYBRT Green Supermix kit, Bio-Rad) 于
Bio-Rad CFX96 Real-time System 上进行实时荧光定量
PCR分析, 10 μL反应体系(SsoAdvantanced SYBRT Green
Supermix 5 μL、RNase/DNase-free water 2 μL、上下游引
物各 0.25 μL, cDNA 2.5 μL)。扩增反应程序为 95 30 s℃ ,
95 5 s℃ , 61 30 s℃ , 65 5 s℃ , 40个循环(根据不同引物调
整退火温度)。每个取样点设 3 次技术重复, 采用 2−ΔΔCT
法分析确定基因的相对表达量。
1.7 统计分析
采用Microsoft Excel 2003作图, SPSS13.0软件进行方
差分析。
2 结果与分析
2.1 BnMAPK1超量表达提高甘蓝型油菜菌核病抗性
采用叶片离体接种进行菌核病抗性鉴定, 接种 36 h
后, 转基因植株和对照都有可见菌斑, 其大小明显不同,
对照的菌斑为深褐色且有穿透叶片的迹象 , 而转基因植
株的菌斑为白色且没有穿透叶片的迹象(图 1)。统计病斑
大小由(图 2)可见, 转基因油菜离体叶片病斑显著小于对
照。叶片菌核病抗性鉴定方差分析结果表明, 转基因植株
和对照对菌核病的抗性存在极显著差异(P<0.01)。说明转
基因油菜的抗菌核病能力显著提高, BnMAPK1 在提高油
菜抗菌核病性中起作用。
第 4期 王淑文等: BnMAPK1超量表达提高甘蓝型油菜菌核病抗性 747


表 1 qRT-PCR所用引物
Table 1 Primers for qRT-PCR
基因名
Gene name
参考序列登录号
Accession number of reference sequence
正向引物序列
Forward primer (5′–3′)
反向引物序列
Reverse primer (5′–3′)
OXO AY884024 TCCTCGACGGCTCTATCACC GTCTTGACTGTAGCAGGCGG
Cu/ZnSOD AY970822.1 GGTTGCATGTCTACCGGTCC TGGACAACAACAGCCCTTCC
PR2 DQ359126.1 ATCTCCGAAAAGGCCAGGGA TACCATTTACCGCATCGCCC
PR3 M95835 ACAGCACCAGACGGACCATA CGTTGGAGACAAGGTCAGGG
Acin7 EV116054 CTGGAATTGCTGACCGTATGAG ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG
UBC21 EV086936 CCTCTGCAGCCTCCTCAAGT CATATCTCCCCTGTCTTGAAATGC


图 1 离体叶片接种 36 h后呈现的病斑大小
Fig. 1 Difference of lesion on the detached leaves after
inoculation with S. sclerotiorum for 36 hours

图 2 离体叶片接种核盘菌 36 h后病斑的差异比较
Fig. 2 Comparison of lesion on the detached leaves after
inoculation with S. sclerotiorum for 36 hours
标有不同字母的材料间差异极显著(P < 0.01)。
Bars superscripted by different letters are significantly different
among the lines at P < 0.01.

2.2 BnMAPK1超量表达对油菜染病叶片草酸含量的影响
由图 3 可见, 转基因植株病斑周围叶片组织的草酸含
量在接种前显著低于对照植株, 接种 6 h 后两者均出现升
高现象, 但是, 转基因植株草酸含量升高的幅度显著低于
对照植株。24 h转基因植株叶片的草酸含量已恢复到正常
水平, 而对照植株叶片草酸含量在 36 h 才恢复至本底水
平。说明转基因植株能更快地降低染病叶片内草酸的积累量,
暗示 BnMAPK1 可能通过抑制油菜罹病组织内草酸的积累量,
减少草酸对植株的伤害, 进而提高油菜的抗病性。
2.3 BnMAPK1 超量表达对油菜抗病关键酶编码基因表
达的影响
2.3.1 OXO的相对表达量动态变化 如图 4-a、表 2所
示, 草酸氧化酶编码基因 OXO 的相对表达量在转基因植
株和对照间及其与接种时间的互作效应均达到极显著水
平(P < 0.01)。接种前(0 h), 转基因植株中 OXO的相对表

图 3 离体叶片接种核盘菌后病斑周围叶片草酸含量的比较
Fig. 3 Comparison of oxalic acid content around the lesion on
the detached leaves inoculated by S. sclerotiorum

达量略低于对照植株。接种后 , 转基因植株和对照中的
OXO的相对表达量均逐渐降低 , 但转基因植株降低的幅
度小于对照植株, 且显著高于对照的表达量。到接种 36 h
后, 该基因的相对表达量在转基因植株中又显著上调, 而
对照中仍表现为下降趋势。此时转基因植株OXO表达量是
对照植株的30倍。表明, 核盘菌可能对OXO的转录有抑制
作用, 而BnMAPK1可降低或部分解除其抑制作用。说明
BnMAPK1基因可能通过介导抗病基因OXO的表达来改进
油菜的抗病性。
2.3.2 Cu/Zn-SOD的相对表达量动态变化 对超氧化
物歧化酶编码基因(Cu/Zn-SOD)相对表达量动态变化及方
差分析(表2)显示, 转基因植株和对照间及其与接种时间
的互作效应均达极显著水平(P < 0.01)。如图4-b所示, 接
种前 , 转基因植株中Cu/Zn-SOD的相对表达量略高于对
照。接种6 h, 转基因植株和对照的Cu/Zn-SOD相对表达量
均下降, 接种12 h后, 又表现上升趋势且转基因植株上升
速度较快, 到接种36 h后转基因植株该基因表达量已高于
对照6倍。表明BnMAPK1基因可诱导抗病相关基因Cu/Zn-
SOD的上调表达, 从而提高油菜的抗病性。
2.3.3 PR3相对表达量动态变化 如图4-c所示, 接种
前, 转基因植株和对照中的几丁质酶编码基因PR3的相对
表达水平都很低。随接种时间的延长, 转基因植株和对照
中PR3的相对表达水平逐渐上升 , 接种36 h后达最高值 ,
此时转基因植株的表达量极显著高于对照(P<0.01) (表2)。
可见, 核盘菌可诱导PR3表达, 且在转基因植株中表现更
突出 , 表明BnMAPK1基因介导了抗病相关基因PR3的诱
导表达。
748 作 物 学 报 第 40卷


2.3.4 PR2相对表达量动态变化 如图4-d所示 , 接
种核盘菌前(0 h), 转基因植株和对照植株中β-1,3-葡聚
糖酶编码基因PR2的相对表达量甚微。接种后均有不同
程度的小幅增加 , 36 h后转基因植株中PR2的相对表达
量急剧上升 , 且远远大于对照植株中该基因的表达量。
方差分析结果表明 , 转基因植株和对照间PR2的相对表
达差异达到极显著水平 , 转基因植株和对照与接种时
间的互作效应也达到极显著水平 (P<0.01) (表2)。说明
BnMAPK1可介导抗真菌蛋白β-1,3-葡聚糖编码的基因
PR2的上调表达。
综上所述, 在核盘菌胁迫下 BnMAPK1基因介导抗病
相关基因 Cu/Zn-SOD、PR2 和 PR3 的表达水平显著上调,
同时, 可能可以解除抑制或诱导 OXO 的转录表达, 从而
提高了油菜的抗病性。

图 4 接种菌核病菌的叶片中酶编码基因 OXO (a)、Cu/Zn-SOD (b)、PR3 (c)和 PR2 (d)的相对表达
Fig. 4 Relative expression of OXO (a), Cu/Zn-SOD (b), PR3 (c), and PR2 (d) in leaves inoculated by S. sclerotiorum
标有不同字母的材料间差异极显著(P < 0.01)。
Bars superscripted by different letters are significantly different among the lines at P < 0.01.

表 2 酶编码基因相对表达量动态变化方差分析
Table 2 Dynamics analysis of relative expression of the genes encoding four enzymes in the leaf inoculated by S. sclerotiorum
F值 F-value 来源
Source
自由度
df OXO Cu/Zn-SOD PR2 PR3
材料 Material 2 10.042** 1224.750** 2707.901** 787.454**
时间 Time 4 469.507** 4447.958** 11453.726** 35573.894**
材料×时间 Material × time 8 13.002** 878.185** 7979.590** 594.885**
** 表示在 P < 0.01水平差异极显著。** Significant difference at P < 0.01.

3 讨论
植物MAPK基因分为A、B、C、D 4个亚族, 目前关于
植物C和D亚族MAPK的研究较少 , 功能分析相对欠缺 ,
且对植物C亚族MAPK1的研究更少 , 即使是在拟南芥中
也不明确。已有研究表明 , 草酸是菌核病主要的致病因
子 [9]。草酸作为一种菌核病的毒素参与致病性已有大量研
究, Andreas等[10]的研究表明草酸可以加快核盘菌致病的
过程, Rai和Dhawan[11]证实了油菜菌核病中草酸毒素的存
在, 刘胜毅等 [12]研究表明油菜对菌核病的抗性和对草酸
的抗性是高度一致的。吴纯仁等[13]通过对草酸毒素在罹
病组织内积累和分布的初步研究发现 , 组织内草酸的积
累与病害的严重程度相一致。不同感病程度的罹病植物体
内毒素的积累量及分布均有显著性差异, 易感品种(系)内
积累了较多的草酸且能扩散至病斑相邻的健康区域。赵丹
丹等 [14]的研究表明 , 受菌核病诱导后 , 随着病斑的不断
扩大, 罹病组织内的草酸含量开始上升, 且相同时间内低
抗品种的草酸积累量要显著高于对应的高抗品种。许多学
者通过试验已证明 , 油菜对草酸的抗性与对病原菌抗性
显著一致, 所以草酸可以用来鉴定油菜对菌核病抗性。本
研究发现转基因植株在受核盘菌诱导后 , 染病叶片内草
酸的积累量极显著少于对照, 说明BnMAPK1可抑制油菜
第 4期 王淑文等: BnMAPK1超量表达提高甘蓝型油菜菌核病抗性 749


叶片中草酸积累, 从而提高油菜抗病性。本研究中抗菌核
病性的鉴定结果也证实了该点。
草酸氧化酶是生物界最重要的草酸降解酶之一 , 它
氧化草酸生成的H2O2能抵制致病菌的入侵使植物获得系
统抗性[15-16]。草酸氧化酶催化草酸转化为H2O2和CO2来降
解草酸的毒性, 延缓病原真菌的侵染, 在植物发育、胁迫及
抗病防御中起着重要作用。目前在油菜[17-18]、荷包豆[19]、大
豆 [20]、花生[21]等多种植物中已有利用草酸氧化酶(OXO)
改良菌核病抗性的报道。核盘菌分泌的草酸在植物体内的
积累、分解和运输以及调控涉及很多复杂的过程和机制。
本研究发现BnMAPK1可以解除核盘菌侵染对OXO转录表
达的抑制作用 , 从而使罹病组织草酸的清除能力维持在
一定水平, 减轻病害对油菜的伤害。
Cu/Zn超氧化物歧化酶在真核生物的SOD中含量最高,
是清除植物体中活性氧(ROS)的主要抗氧化酶之一, 对减
轻植物逆境胁迫下活性氧伤害有重要作用 , 是植物的重
要防御酶[22-23]。SOD在抗病中的作用已有许多研究, 其中
包括小麦斑点病[24]、黄瓜霜霉病[25]、小麦白粉病[26]等, 研
究发现感染病害的植株体内SOD活性都有所增强。杨鸯鸯
等[27]发现甘蓝型油菜中Cu/Zn-SOD基因在接种菌核病后,
抗病材料中的表达量要显著高于感病材料。本研究发现转
基因植株在接种菌核病前后Cu/Zn-SOD基因的表达量均
显著高于对照 , 且BnMAPK1基因介导病害胁迫下Cu/Zn-
SOD基因的诱导表达, 进而提高油菜的抗病性。
当植物受到病原菌及其他逆境胁迫时 , 会产生大量
的病程相关蛋白(PRs), 这些蛋白是由各种病原体和相关
逆境胁迫因子诱导产生的 , 它们与植物的防卫反应密切
相关。虽然许多 PR 蛋白的具体生物功能还未知, 但多数
表现出抗菌防御反应[28]。几丁质酶和 β-1,3-葡聚糖酶, 分
别属于 PR2 和 PR3 类, 这两类蛋白是目前研究报道最多
的与抗真菌有关的蛋白[29]。β-1,3-葡聚糖与几丁质为大多
数真菌细胞壁的主要成分, 他们可被 β-1,3-葡聚糖酶与几
丁质酶水解[30]。本研究发现, 核盘菌可显著诱导转基因植
株中 PR2和 PR3的上调表达, 表明 BnMAPK1基因参与油
菜抗菌核病响应, 并介导抗病防御蛋白的表达, 增强油菜
的抗病能力。
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