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Analysis of DNA Methylation Patterns in Resynthesized Brassica napus and Diploid Parents

人工合成甘蓝型油菜及其亲本的甲基化变异模式分析



全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(4): 513524 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本项目由国家重点基础研究计划(973计划)项目(2015CB150201), 中国和江苏省博士后基金(2014M561719, 2015T80591, 1401078B)资助。
This study was supported by the National Key Basic Research Program of China (2015CB150201), China and Jiangsu Postdoctoral Program
(2014M561719, 2015T80591, 1401078B).
 通讯作者(Corresponding author): 蒋金金, E-mail: jjjiang@yzu.edu.cn, Tel: 0514-87997303
第一作者联系方式: E-mail: 18505143324@163.com, Tel: 18505413324
Received(收稿日期): 2015-08-27; Accepted(接受日期): 2016-01-11; Published online(网络出版日期): 2016-01-25.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160125.1622.014.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00513
人工合成甘蓝型油菜及其亲本的甲基化变异模式分析
谢 涛 戎 浩 蒋金金* 孔月琴 冉丽萍 吴 健 王幼平
扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州 225009
摘 要: 甘蓝型油菜作为多倍体起源和发生的历史较短, 遗传背景较为狭窄, 人工合成甘蓝型油菜可作为植物多倍
化研究的优选模型, 本文以人工合成的甘蓝型油菜为材料, 通过 HPLC 分析发现白菜型油菜和甘蓝的甲基化率分别
为 8.33%和 15.88%, 2个杂种株系的全基因组甲基化水平介于双亲之间, 分别为 10.29%和 12.83%。MSAP分析发现
杂种 F1代及其亲本的甲基化水平存在明显差异(白菜型油菜<杂种 F1<甘蓝), 杂种 F1代的甲基化变异(23.71%)中来自
A、C 基因组的变异分别占 6.60%和 10.16%。MSAP 差异性条带的序列分析发现多倍化过程中与甲基化变化相关的
基因参与了多种生物学过程, 且差异甲基化基因在人工合成甘蓝型油菜及其亲本间的表达差异与甲基化修饰模式是
一致的。本研究为了解甘蓝型油菜多倍化过程中发生的表观变异奠定了基础。
关键词: 甘蓝型油菜; 人工合成种; 多倍化; 甲基化
Analysis of DNA Methylation Patterns in Resynthesized Brassica napus and
Diploid Parents
XIE Tao, RONG Hao, JIANG Jin-Jin*, KONG Yue-Qin, RAN Li-Ping, WU Jian, and WANG You-Ping
College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Abstract: The genetic background of Brassica napus, one of the most important oil crops in China, is relatively narrow due to the
short history of its polyploid origin. Resynthesized B. napus provides an optimal model for researches on plant polyploidization.
In the present study, we compared the DNA methylation levels in synthesized B. napus (F1 generation) and diploid parents using
high-performance liquid chromatography (HPLC) and DNA methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) analysis.
HPLC analysis indicated methylation rates of 8.33% and 15.88% in B. rapa and B. oleracea, respectively. While the methylation
rate of two hybrids was 10.29% and 12.83%, which were in-between of the parents’ values. MSAP analysis proved the different
methylation levels in F1 generation and diploids, with the lowest and highest methylation levels identified in B. rapa and B. ole-
racea, respectively. Variance of the DNA methylation in F1 was 23.71%, among which 6.60% and 10.16% were inherited from A
and C genome, respectively. Sequence analysis of MSAP polymorphic fragments indicated genes involved in multiple molecular
functions were changed during polyploidization. Expression analysis of these genes agreed to the corresponding methylation
changes. This study provides preliminary basis for understanding epigenetic variations during B. napus polyploidization.
Keywords: Bassica napus; Resynthesized species; Polyploidization; DNA methylation
多倍体化是植物进化的重要原动力, 被子植物
中约 70%的植物在进化过程中经历了至少一次多倍
化事件[1]。近年来通过基因组研究和比较基因组序
列分析发现, 很多先前认为的典型二倍体植物(如拟
南芥、水稻、大豆、玉米)究其来源也是古多倍体经
过一系列演化而形成的[2]。通过研究植物多倍体有
助于开发利用更多具有经济价值的多倍体植物资
源。芸薹属(Brassica)是十字花科(Brassicaceae)中最
为重要的一个属, 其中包括很多重要的经济作物。
Nagahararu[3]证实该属包括白菜型油菜(B. rapa, AA,
514 作 物 学 报 第 42卷


2n = 20)、黑芥(B. nigra, BB, 2n = 16)和甘蓝(B. ole-
racea, CC, 2n = 18) 3个二倍体基本种, 以及由 3个
基本种通过杂交和自然加倍形成的甘蓝型油菜(B.
napus, AACC, 2n = 38)、埃塞俄比亚芥(B. carinata,
BBCC, 2n = 34)和芥菜型油菜 (B. juncea, AABB,
2n = 36) 3个异源四倍体种。其中甘蓝型油菜的起源
和驯化历史较短, 但现已成为世界上仅次于大豆的
第二大油料作物[4]。然而, 狭窄的遗传基础也限制了
甘蓝型油菜的发展[5]。白菜型油菜和甘蓝的品种较
多, 且农艺性状变异较大, 利用白菜型油菜、甘蓝对
甘蓝型油菜进行改良是一个重要的育种途径[6-7]。通
过人工合成甘蓝型油菜可以对其多倍化形成机制进
行研究, 这也是拓宽甘蓝型油菜遗传基础的重要途
径之一[8-10]。目前已有很多关于人工合成甘蓝型油菜
的报道, 且这些人工合成甘蓝型油菜在早期世代具
有很多优异的农艺性状[8,11]。
植物多倍体基因组中来自不同亲本的大量重复
基因在多倍化过程中会发生基因沉默或产生新的功
能基因等[8,12-13]。研究表明, 异源多倍体油菜、小麦、
黄瓜等的基因组在多倍化过程中均发生了大量变化,
以维持新形成多倍体基因组的稳定性, 包括基因的
选择性丢失或沉默[14-15]、染色体重排[16]等。此外, 异
源多倍体基因组的稳定性还有赖于表观遗传修饰, 目
前多倍体表观遗传现象中研究最透彻的是甲基化[17]。
研究发现, 很多异源多倍体的重复及低拷贝序列的
甲基化状态和基因表达与亲本基因组存在很大差异[18]。
DNA 甲基化除了与人工合成异源多倍体中的快速
变化密切相关, 也参与新合成异源多倍体的稳定及
进化[19-21]。Lukens等[18]对新合成甘蓝型油菜 S0代表
观遗传变异分析发现, 48%的 CpG 甲基化位点在亲
本之间存在差异, 人工合成多倍体中存在甲基化位
点的基因组偏好性; Xu等[22]通过甲基化敏感扩增多
态性(MSAP)分析发现, 甘蓝型油菜异源多倍体化过
程中, 杂种后代与亲本相比有 6.84%基因发生甲基
化变异 , 其中 1.94%的变异与多倍化过程相关 ;
Gaeta等[8]发现人工合成甘蓝型油菜 S0代中 A、C基
因组的甲基化变异是一致的, 但随后的 5个世代中A
基因组特异的甲基化变异远高于 C 基因组, 这表明
异源多倍体的甲基化修饰存在基因组偏好性。此外,
研究发现人工合成甘蓝型油菜中发生表观修饰的变
异是非常广泛的, 包括反转录转座子、编码基因、
非编码 DNA。Xu 等[22]认为异源多倍化过程中的甲
基化变异可以在全基因组范围内发生, 且 19%的甲
基化修饰发生在转座子区域, 这表明异源多倍体过
程伴随着对反转座子频繁的表观遗传修饰作用。此
外, Gaeta等[8]发现大多数 S0代的甲基化变异在随后
的 S5代中得以保持, 但也有一部分甲基化修饰未能
稳定遗传。
本实验室前期以白菜型油菜为母本、甘蓝为父
本, 通过胚胎挽救的方法获得了人工合成甘蓝型油
菜, 可作为研究甘蓝型油菜多倍化的实验材料。该
多倍体具有分枝部位降低、分枝数多等优良性状。
本研究拟通过高效液相色谱(HPLC)和 MSAP 技术,
比较分析人工合成甘蓝型油菜 F1代、二倍体亲本的
甲基化水平, 为了解甘蓝型油菜多倍化过程中发生
的表观变异奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
白菜型油菜(Brassica rapa, AA, 2n = 20)品种扬
州青、甘蓝(B. oleracea, CC, 2n = 18)品种永绿 7号
由江苏省里下河地区农业科学研究所提供, 由上述
二倍体杂交而来的人工合成甘蓝型油菜 F1 代 (B.
napus, AACC, 2n = 38)由本实验室创制并保存。
1.2 用 HPLC法分析材料全基因组 DNA甲基化
水平
取母本扬州青、父本永绿 7 号、人工合成甘蓝
型油菜 F1代的苗期叶片, 每个品种取 3 个单株作为
重复, 通过 CTAB 法[23]提取全基因组 DNA。参照
Demeulemeester等[24]的方法, 向装有 50 µg DNA的
玻璃管中加入 300 µL高氯酸, 沸水浴 1 h裂解, 然
后用 1 mol L–1 KOH溶液将 pH值调整至 3~5, 在形
成 KClO4沉淀后取上清液, 13 523×g离心 5 min后,
吸取上清液待测。室温下将 DNA裂解液通过自动加
样器进样至 Agilent 1200 型高效液相色谱仪(USA)
的 Alltima C18色谱柱(5 µm, 250.0 mm × 4.6 mm)中,
柱温箱温度为 40℃, 以 10%甲醇、0.1 mol L–1戊烷
磺酸钠和 0.2%三乙胺的混合液(pH 4.0)为流动相 ,
洗脱速度为 0.8 mL min–1, 紫外检测器检测波长为
273 nm。以胞嘧啶(C)和 5-MeC标样为对照, 通过计
算 5-MeC 摩尔数/(5-MeC 摩尔数+C 摩尔数)的百分
比检测基因组DNA中 5-MeC的含量(DNA甲基化水
平), 每个样品重复 3次。
1.3 人工合成甘蓝型油菜及其亲本的 MSAP 分

同上所述, 通过 CTAB 法提取母本扬州青、父
第 4期 谢 涛等: 人工合成甘蓝型油菜及其亲本的甲基化变异模式分析 515


本永绿 7号、人工合成甘蓝型油菜 F1代的全基因组
DNA, 每个试验材料取 3株重复的 DNA进行混池。
参考 Xu等[22]的 MSAP分析方法稍作修改。用 EcoR
I (15 U)/Msp I (10 U)和 EcoR I (15 U) /Hpa II (10 U)
两组限制性内切酶对每个样品分别双酶切。MSAP
分析所用接头、预扩增、选择扩增引物见表 1。酶
切产物与 10 pmol EcoR I接头和 10 pmol Hpa II/Msp
I接头连接。利用表 1中的预扩增引物对上述连接产
物预扩后, 以预扩增产物为模板、表 1 中的选择性
扩增引物 PCR 扩增。扩增产物经 8%聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离检测, 统计分析条带。MSAP 条带用“+”
和“–”分别代表“有带”和“无带”, 据此可以将条带分
为(+, +)、(+, –)、(–, +)和(–, –) 4种类型。
1.4 甲基化差异条带的克隆与测序
将 MSAP 检测的差异片段切下、装至 EP 管内,
加入 200 µL TE, 浸泡 30 min, 弃上层液体, 重复同
样的操作 2次; 再加入 30 µL ddH2O, 煮沸 10 min,
然后用枪头捣碎胶块, 煮沸 10 min后, 1286×g离心
15 min, 上清液即为回收产物。胶回收产物经
pMD19-T Vector (TaKaRa, Code: D102A)进行 TA克
隆后, 利用相应的选扩引物对单克隆进行 PCR检测,
选取阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司
测序。对所得序列在甘蓝型油菜基因组数据库
(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/) 中 进 行
同源性检索。
1.5 甲基化差异条带的 qRT-PCR分析
采用 RNAiso plus 试剂盒(TaKaRa)提取母本扬
州青、父本永绿 7号、人工合成甘蓝型油菜 F1代苗
期叶片的总 RNA。20~50 μg 总 RNA 中加入 6 μL
10×DNase I 缓冲剂 (TaKaRa)、 4 μL DNase I
(RNase-free, 5 U μL–1) (TaKaRa)、0.8 μL RNase抑制
剂 (40 U μL–1)进行基因组 DNA 消化。通过
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche)
合成 cDNA。qRT-PCR反应体系为 20 μL, 包括 1 μL
cDNA、正反引物(表 2)各 0.3 μmol L–1、10 μL FastStart
Universal SYBR Green Master (ROX, Roche)。反应程
序为 50℃ 2 min, 95℃ 10 min; 40个循环反应 95℃
15 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s。使用 96孔板(Bio-Rad
Laboratories)于 ABI 7500 System (Applied Biosystems)
上进行 qRT-PCR 反应。内参为甘蓝型油菜 β-actin
(NCBI AF111812), 以 2–ΔΔCt法分析各基因的相对表
达量。

表 1 MSAP分析所用接头和引物序列
Table 1 The sequences of adapters and primers in MSAP analysis
EcoR I
引物序列
Primer sequence (5–3) Hpa II/Msp I
引物序列
Primer sequence (5–3)
Adapter
-CTCGTAGACTGCGTACC
AATTGGTACGCAGTCTAC
Adapter
GACGATGAGTCTAGAA
CGTTCTAGACTCATC
E-pre GACTGCGTACCAATTCA HM-pre GATGAGTCTAGAACGGT
E01 GACTGCGTACCAATTCATA HM31 GATGAGTCTAGAACGGTAA
E02 GACTGCGTACCAATTCATG HM32 GATGAGTCTAGAACGGTAG
E03 GACTGCGTACCAATTCATC HM33 GATGAGTCTAGAACGGTAC
E04 GACTGCGTACCAATTCAGA HM34 GATGAGTCTAGAACGGTAT
E05 GACTGCGTACCAATTCAGC HM35 GATGAGTCTAGAACGGTGA
E06 GACTGCGTACCAATTCAGT HM36 GATGAGTCTAGAACGGTGT
E07 GACTGCGTACCAATTCACA HM37 GATGAGTCTAGAACGGTGG
E08 GACTGCGTACCAATTCACG HM38 GATGAGTCTAGAACGGTGC
E09 GACTGCGTACCAATTCACT HM39 GATGAGTCTAGAACGGTCA
E10 GACTGCGTACCAATTCACC HM310 GATGAGTCTAGAACGGTCT
E11 GACTGCGTACCAATTCATT HM311 GATGAGTCTAGAACGGTCG
E12 GACTGCGTACCAATTCAGG HM312 GATGAGTCTAGAACGGTCC
E13 GACTGCGTACCAATTCAAG HM313 GATGAGTCTAGAACGGTTA
E14 GACTGCGTACCAATTCAAC HM314 GATGAGTCTAGAACGGTTA
E15 GACTGCGTACCAATTCAAT HM315 GATGAGTCTAGAACGGTTC
E16 GACTGCGTACCAATTCAAA HM316 GATGAGTCTAGAACGGTTT

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表 2 qRT-PCR分析所用引物
Table 2 Primers for qRT-PCR analysis
引物
Primer
上游序列
Forward sequence (5–3)
下游序列
Forward sequence (5–3)
BnaA07g13310 CTATGGACCAAGAAGACAGAACA AGACTGGCTACGAGCATCACT
BnaA10g10810 CTCCGAGCCTTCACCAGT CCCAACAAATCTCCGACCA
BnaA09g00650 GCAAGAAGGTGGACTGGAC GATTTGAGACCGATGGGAT
BnaA02g36850 TCTCCTTTGCCTTCTCACA GCTTATGCCTAAACAACACC
BnaC04g11130 TAGTGAAACTCTCCCCCGA CATCCTTCGCTCCCACA
BnaC03g20950 CTATGGACCAAGAAGACAGAACA AGACTGGCTACGAGCATCACT
BnaC02g13410 TCAGCGTGTTGTGGAAGTG AAGGAGATGAGTATTGCGAGT
BnaA09g00810 TCCGCCTCCACAATCTC CCTTCTTGCGACAAACTCC
BnaA05g28160 GTCTGGACGATGGTGCC TAGCGTTTTTGAGGTGTAA
BnaA08g16460 CTATTTTCAGTCGCTTTTC TTCTCCTTTCCCAGTCCC
BnaC07g04810 GTGTAAAGCCTGGCGAGAT ACGATGGCATAAGTGTTCCTA
BnaA05g27520 CTCCGTTAGCCACAACTTTC CTATCCACCCTCCACCATCT
BnaA10g30090 GTAGCAAACACCGTCCTCG CATTCACCTCCATACGCACT
BnaA05g21100 CGTGGATGAGAAGGTGATT AAAGAGTAGGAGGTTTATTAGGC
BnaA02g22580 CTGGCTCCTCAGAACAAACA CAGCAATGGACCCGACA
BnaC05g11240 CGAACTATTGACGCTACTA TCCACCATAAACTTCACGCTCT
β-actin TCTTCCTCACGCTATCCTCCG AGCCGTCTCCAGCTCTTGC

2 结果与分析
2.1 人工合成甘蓝型油菜 F1 代及其亲本的全基
因组甲基化水平分析
以胞嘧啶/5-甲基胞嘧啶为标准品, 通过 HPLC
技术对人工合成甘蓝型油菜 F1代、二倍体亲本的全
基因组甲基化水平分析(图 1), 发现扬州青的全基因
组甲基化率为 8.33%, 永绿 7 号的甲基化率为
15.88%; 而新合成的异源四倍体甘蓝型油菜 F1代 2
个株系 (F1-1、 F1-2)的甲基化率分别为 10.29%和
12.83% (图 2), 都与亲本存在显著差异。杂种后代的
甲基化水平相对于扬州青呈上升趋势, 但未达到永
绿 7号的甲基化水平。
不同生物基因组中 DNA 甲基化胞嘧啶所占比
率存在较大的差异, 某些动物如线虫中不含甲基化
胞嘧啶, 昆虫中占 0~3%, 哺乳类和鸟类占 5%, 两
栖类和鱼类占 10%, 但在有些植物中能达到 30%。
对于同种生物的不同组织和器官, 或者同一组织的
不同发育阶段, 甲基化胞嘧啶所占的比率也可能存
在差异[25]。DNA甲基化胞嘧啶的分布存在种属特异
性以及组织特异性, 并可随生物发育阶段的不同而
发生改变[26-27]。本研究中, 白菜型油菜扬州青以及
甘蓝永绿 7号是芸薹属的 2个二倍体物种, 而由这 2
个亲本杂交所获得的甘蓝型油菜是属于芸薹属异源
四倍体物种。利用 HPLC 对二倍体白菜型油菜、甘
蓝及其杂种 F1 代的同一发育阶段、同一组织进行
DNA 甲基化分析, 结果显示三者的 DNA 甲基化率
存在明显的差异, 且 A 基因组的全基因组甲基化率
明显小于 C 基因组的甲基化率, 而人工合成甘蓝型
油菜的甲基化率高于母本白菜型油菜、低于父本甘
蓝, 这可能是由于杂种植株的基因组同时包含了 A、
C 两套基因组, 同源染色体组在形成多倍体的过程
中发生了复杂的表观遗传修饰, 以维持多倍体基因
组的稳定性。
2.2 人工合成甘蓝型油菜 F1代及其亲本的MSAP
分析
选用 68对引物对扬州青、合成种 F1代(2.1中甲
基化比率较高的株系)、永绿 7 号进行 MSAP 分析,
共统计 1181个条带, 根据条带的不同类型可分为 7
大类(图 3), a 类, 片段类型同 A 基因组(136 条), 包
括 9个亚类; b类, 片段类型同 C基因组(107条), 也
包括 9 个亚类; c 类, 包括所有的其他叠加类型(658
条), 共 3个亚类; d类, 包括 3个亚类, 只有 A基因
组条带发生变化(78条); e类, 包括 3个亚类, 只有 C
基因组发生变化(120条); f类, 包括 3个亚类, A和 C
基因组条带都发生了变化(25条), 其中一个类型条
带较弱未显示; g 类, 包括 3 个亚类, 甲基化变化不
属于 A 和 C 基因组, 即出现了新增条带(57条)。
第 4期 谢 涛等: 人工合成甘蓝型油菜及其亲本的甲基化变异模式分析 517



图 1 高效液相图谱鉴定全基因组甲基化水平
Fig. 1 Methylation level of whole genome by HPLC analysis
A: 甲基化标准品; B: 待测样品; 白色箭头: 胞嘧啶峰; 黑色箭头: 5-甲基胞嘧啶峰。
A: methylation standards; B: sample for analysis; White arrow: cytosine peak; Black arrow: 5-methylcytosine peak.


图 2 杂种 F1代及亲本的甲基化水平
Fig. 2 DNA methylation rate in synthesized B. napus (F1) and
parents
标以不同字母的柱值在 0.05水平上差异显著, n = 3。
Bars superscripted by different letters are significantly different at
the 0.05 probability level, n = 3.

根据甲基化变异类型可将上述 7 大类归结为 2 种类
型: ①甲基化叠加型, 包括 a、b、c三个大类; ②甲
基化变化型: 包括 d、e、f、g 四种。综上, 杂种 F1
的甲基化变化率为 23.71%, 其余 76.29%只是亲本条
带的简单叠加, A 基因组的甲基化变异为 6.60%, C
基因组的变化(10.16%)明显高于 A基因组。此外, M
位点(全甲基化)变化率占总变化的 28.21%, 而 H 位
点(半甲基化)占 40%, 2个位点都发生变化的比率为
31.79% (表 3)。杂种 F1代的 DNA甲基化类型发生变
化的比率占 23.71%。
根据甲基化水平差异对所有 MSAP 条带统计发
现, 扬州青、永绿 7 号及杂种植株 F1所扩增总条带
数差异很小 , 扬州青的总甲基化率最低 (20.34%),
永绿 7 号的总甲基化率最高(22.44%), 杂种植株 F1
的总甲基化率介于两者之间(21.40%)。其中全甲基
化率与该趋势一致, 半甲基化率则是杂种植株中最
高, 扬州青次之, 永绿 7 号最低(表 4)。扬州青和杂
种 F1代植株的半甲基化率高于全甲基化率, 而永绿
7 号的全甲基化率高于半甲基化率, 由此推测前者
基因组 CCGG位点发生甲基化的方式主要是以单链
外侧胞嘧啶甲基化(mCCGG)为主, 后者基因组主要
以双链内部胞嘧啶甲基化(CmCGG)为主。
2.3 MSAP差异条带的克隆与定量分析
对 MSAP 分析的多态性片段进行 TA 克隆、测
序, 共获得 19个 MSAP差异条带的序列信息, 将测
序结果在甘蓝型油菜数据库 (http://www.brassica.
info/)中进行基因的同源性比对, 比对结果在拟南芥
数据库(http://www.arabidopsis.org/)中进行基因的功
能比对, 推测差异条带的具体功能信息(表 5)。由比
518 作 物 学 报 第 42卷


对信息可知, 甘蓝型油菜人工合成过程中所涉及的
基因包括半胱氨酸/组氨酸 C1域家族蛋白、RING/U
盒蛋白超家族、CCT修饰家族蛋白、类 GDSL脂肪
酶/乙酰水解酶蛋白超家族、F-盒/类 RNI/类 FBD 结
构域蛋白质、液泡蛋白排序 55 (VPS55)家族蛋白、
丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白、蛋白激酶家族蛋白、
类 FRIGIDA家族蛋白、类丝氨酸羧肽酶 50、类 TRAF
蛋白超家族, 以及 IAA氨基酸、蛋白激酶 APK2b、
KCS8、类 SABP2 (水杨酸甲酯酯酶)蛋白的编码基因。
对上述测序成功的 MSAP 差异片段在人工合成
甘蓝型油菜(F1 代)及其二倍体亲本中的表达量分析
(图 4)发现, Bn1、Bn4、Bn7、Bn8、Bn10等在杂种
F1代植株中发生去甲基化修饰的基因, 在杂种 F1中
的表达量高于双亲或介于两亲本之间; Bn14、Bn15、
Bn16、Bn18 等在杂种植株中发生高甲基化的基因,
在杂种植株中的表达量均介于两亲本之间。Bn1 的
同源基因编码半胱氨酸/组氨酸 C1 域家族蛋白, 是
一种锌指结构域。该蛋白可通过与 RNA和 DNA结
合, 参与调控植物细胞的凋亡和应激反应(如抗病反
应)[28]。该基因在杂种 F1 代与亲本相比表现为低甲
基化修饰, 但该基因在杂种 F1代的表达水平介于双
亲之间, 且亲本AA中Bn1的表达量最高, 推测亲本
AA对外源病菌(如野油菜黄单胞菌)的抗性可能高于
父本 CC, 且杂种 F1代的抗性介于双亲之间。Bn4的
同源基因同样编码半胱氨酸/组氨酸 C1域家族蛋白,
但该基因在杂种 F1 代的表达量显著高于父本 CC,
且其中株系 F1-1中 Bn4的表达量高于母本 AA。通过
对杂种后代中 Bn1/Bn4 的表达变化分析表明, 异源
四倍体中相关抗性基因的表达水平发生了变化, 这
对于甘蓝型油菜的品质改良有重要的意义。但杂种
后代的这种基因表达变异是否优于现有甘蓝型油菜
品种还有待后续研究。Bn7 在杂种 F1代和亲本之间
的甲基化修饰模式、基因表达变化与 Bn1是一致的。
Bn8的同源基因编码类 GDSL脂肪酶/乙酰水解酶蛋
白超家族 , 该基因在甘蓝型油菜的非生物胁迫应
答、生物胁迫应答、以及种子发育和脂质代谢中发
挥着不可忽视的重要作用[29]。Bn8在杂种 F1代与亲
本相比表现为低甲基化修饰, 且该基因在母本 AA
中的表达量最高, 杂种 F1代中的表达量略高于父本
CC。Bn10的同源基因编码 F-box结构域蛋白, 对植
物调节蛋白的降解起着重要的调控作用, 在一些重
要的信号传导系统和信号通路中发挥重要的功能[30]。
Bn10 在杂种 F1代与亲本相比表现为去甲基化修饰,
且其在 F1代的表达水平介于双亲之间, 亲本 AA 中

图 3 人工合成甘蓝型油菜 F1代植株及其亲本的甲基化条带类型
Fig. 3 DNA methylation patterns in resynthesized B. napus (F1) and diploid parents
a1~a9: 来自 A基因组(白菜)的片段; b1~b9: 来自 C基因组(甘蓝)的片段; c1~c3: 所有其他 MSAP条带叠加类型; d1~d3: 只有 A基因
组发生改变的条带; e1~e3: 只有 C基因组发生改变的条带; f1~f2: 来自 A和 C基因组的条带; g1~g3: 杂种后代特异的甲基化条带。
a1–a9: fragments inherited from A genome (B. rapa); b1–b9: fragments inherited from C genome (B. oleracea); c1–c3: the other additive
patterns of MSAP profiles; d1–d3: A genome-specific methylation changes; e1–e3: C genome-specific methylation changes;
f1–f2: methylation changes derived from both A and C genomes; g1–g3: hybrid specific methylation changes.
第 4期 谢 涛等: 人工合成甘蓝型油菜及其亲本的甲基化变异模式分析 519


表 3 人工合成甘蓝型油菜 F1代植株及其二倍体亲本的甲基化模式
Table 3 Patterns of methylation in resynthesized B. napus (F1) and its diploid parents
母本
Maternal parent (AA)
杂种 F1代
F1 generation (AACC)
父本
Male parent (CC)
条带类型
Type of
fragments M H M H M H
条带数
Number of
fragments
条带数及百分比
Number and
percentage of
fragments
a1 + + + + – – 16
a2 + – + – – – 14
a3 – + – + – – 31
a4 + + + + + – 34
a5 + + + + – + 24
a6 + – + – – + 1
a7 + – + – + + 2
a8 – + – + + – 3
a9 – + – + + + 11
136 (11.52%)

b1 – – + + + + 28
b2 – – + - + – 20
b3 – – – + – + 17
b4 – + + + + + 12
b5 + – + + + + 6
b6 – + + – + – 1
b7 + + + – + – 9
b8 + – – + – + 4
b9 + + – + – + 10
107 (9.06%)

c1 + + + + + + 620
c2 + – + – + – 11
c3 – + – + – + 27
658 (55.72%)

d1 + – – – – – 16
d2 – + – – – – 30
d3 + + – – – – 32
78 (6.60%)

e1 – – – – + – 38
e2 – – – – – + 41
e3 – – – – + + 41
120 (10.16%)

f1 + – – – + – 12
f2 – + – – – + 10
f3 + + – – + + 3
25 (2.12%)

g1 – – + – – – 13
g2 – – – + – – 31
g3 – – + + – – 13
57 (4.83%)
甲基化条带类型同图 3。Type of methylation fragments corresponds with that given in Fig. 3.
520 作 物 学 报 第 42卷


表 4 人工合成甘蓝型油菜 F1代植株及其亲本的 DNA甲基化水平
Table 4 DNA methylation level in resynthesized B. napus (F1) and diploid parents
材料
Material
总扩增条带数
Number of fragments
全甲基化条
带数 NyHF
全甲基化率
HyR (%)
半甲基化条
带数 NeHF
半甲基化率
HeR (%)
总甲基化条
带数 NMF
总甲基化率
TMR (%)
AA 939 66 7.03 125 13.31 191 20.34
CC 985 128 12.99 93 9.44 221 22.44
F1 958 71 7.41 134 13.99 205 21.40
HyR: hypermethylation rate; NeHF: number of hemimethylated fragments; HeR: hemimethylation rate; NMF: number of methylated
fragments; TMR: total methylation rate.

图 4 人工合成甘蓝型油菜 F1代及其亲本的甲基化差异片段的 qRT-PCR分析
Fig. 4 qRT-PCR analysis of genes with different methylation patterns in resynthesized B. napus (F1) and diploid parents
标以不同字母的柱值在 0.05水平上差异显著, n = 3。
Bars superscribed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level, n = 3.

的表达量最高。最近有研究报道, 很多与昼夜调节
相关的基因在白菜型油菜的全基因三倍化过程中得
到了选择性的保留, 但编码 F-box 蛋白的基因家族
(ZEITLUPE)却是例外[31]。Bn14编码丝氨酸蛋白酶抑
制剂家族蛋白, 前人研究发现过表达丝氨酸蛋白酶
抑制基因(如 MTI-2)可以提高甘蓝型油菜对小菜蛾
的抵御能力[32]。本研究发现杂种 F1代中 Bn14 与亲
本相比发生超甲基化修饰, 其在杂种 F1代的表达量
显著低于父本 CC, 与母本 AA 无显著差异, 由此推
测, 父本 CC 对某些生物胁迫的抵御能力可能优于
母本 AA 和杂种后代。Bn15 编码类 FRIGIDA 家族
蛋白, 最新研究发现, 该基因可以在长日照条件下通
过调节开花基因的表达延迟拟南芥的开花时间[33]。
本研究发现杂种 F1代中该基因的表达水平明显高于
第 4期 谢 涛等: 人工合成甘蓝型油菜及其亲本的甲基化变异模式分析 521



522 作 物 学 报 第 42卷


父本 CC, 但低于母本 AA。该基因在不同材料中的
表达差异是否与它们的花期差异有关还有待进一步
研究。Bn16 编码蛋白激酶家族蛋白, 参与的生物学
功能比较广泛, 其在 F1 代表现为超甲基化修饰, 且
在 F1中的表达量介于双亲之间。Bn18编码类丝氨酸
羧肽酶 50, 该蛋白的脂肪酰转移酶可以催化油菜籽
中芥子酸酯类化合物的形成[34]。本研究发现该基因
在杂种 F1中发生超甲基化修饰, 其在父本 CC 中的
表达量最高, 杂种株系 F1-1中 Bn18的表达量介于双
亲之间。
3 讨论
异源四倍体甘蓝型油菜是研究植物多倍化的良
好模型, 但天然多倍体的遗传背景不清晰, 通过人
工合成甘蓝型油菜可以对其多倍化形成机制进行研
究[10]。目前, 已有很多关于人工合成甘蓝型油菜的
报道, 且这些人工合成甘蓝型油菜在早期世代具有
很多优异的农艺性状[8]。本实验通过 HPLC 技术分
析, 发现杂种后代(10.29%和 12.83%)的甲基化水平
介于母本扬州青(8.33%)和父本永绿 7 号(15.88%)之
间; MSAP 分析发现, 扬州青(20.34%)、永绿 7 号
(22.44%)及杂种植株 F1 (21.40%)的总甲基化率差异
很小。在植物基因组中, 胞嘧啶甲基化通常发生在
CAG、CTG和 CCG位点, HPLC分析所检测的是全
基因组水平的胞嘧啶甲基化; 而 MSAP 分析只能揭
示 CG 或部分 CCG 位点的甲基化修饰, 无法揭示
CAG 和 CTG 三核苷酸残基中胞嘧啶的甲基化程度
以及其他碱基的胸嘧啶甲基化水平。此外, MSAP中
每一个酶切和扩增位点可能包括同一序列的多个重
复。因此, MSAP分析得到的 DNA甲基化水平往往
低于实际情况[35]。此外, 杂种 F1代的 DNA 甲基化
类型发生变化的比率占 23.71%, 这有别于前人的研
究。Lukens等[18]发现甘蓝型油菜中 48.0% CpG甲基
化位点发生改变; 而Xu等[25]研究发现玫瑰离体分化
的甲基化变化率是 6.8%。异源四倍体拟南芥中甲基
化模式变化比率占 8.3%[36]; 异源四倍体小麦中该比
率是 6.9%[21]; 水稻栽培种杂交后代中 4.1%甲基化
位点发生变化 [37]; 而高狐草×小麦属间杂种的不同
株系的甲基化变化率在 1.6%~9.2%之间[38]; 米草杂
种中则有高达 30%的变化比率[39]。Shaked等[21]研究
发现, 小麦和甘蓝型油菜多倍体中的甲基化变异存
在基因组偏好性。甘蓝型油菜中甲基化变异的基因
组偏好性表现为: 若杂种细胞质来自 A 基因组, 则
甲基化优先出现于 C基因组, 反之亦然[8,25]。本研究
的统计结果也发现杂种 F1代种源自母本白菜型油菜
的甲基化变化(6.6%)低于 C 基因组甲基化(10.16%),
这与前人的研究结果是一致的。
我们通过对 MSAP 分析所获甲基化修饰基因进
行表达分析, 发现多个基因在 F1代中的表达量介于
双亲之间, 这可能与多倍化过程中的遗传修饰和表
观遗传修饰相关。Gaete等[40]认为甲基化修饰并不是
引起人工合成甘蓝型油菜(S0 代)基因组水平基因表
达变异的主要机制, 而多倍化过程中的基因重组是
引起基因表达变异的主要原因。本文所发现 F1代基
因表达水平介于双亲之间, 这除了与甲基化修饰相
关外, 可能与多倍化过程中的染色体重组、基因片
段的丢失、转座等相关。此外, 杂种 F1代中基因表达
水平高于亲本 AA 或 CC, 据此推测杂种后代的某些
性状优于亲本 AA 或 CC, 这种杂种植株与任一亲本
相比具有优势、或杂种后代某些性状优于双亲均值的
现象也属于杂种优势[41], 具有一定的应用价值。
4 结论
发现大量在多倍化过程中发生甲基化修饰变异
的条带, 这些基因在杂种后代及双亲之间均存在表
达差异, 为了解甘蓝型油菜多倍化过程中发生的表
观变异奠定了基础。
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