全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(4): 600−610 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由“十二五”农村领域国家科技计划课题(2011AA100501), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-3-2-47), 国家自然科学
基金项目(31171538, 30900896)和西北农林科技大学唐仲英育种基金项目(A212020912)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 高翔, E-mail: gx@nwsuaf.edu.cn; 赵万春, E-mail: zhaowc2009@hotmail.com
第一作者联系方式: E-mail: yanghua.northwest@gmail.com
Received(收稿日期): 2013-12-05; Accepted(接受日期): 2014-01-12; Published online(网络出版日期): 2014-02-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140214.1018.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00600
簇毛麦新型 HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定
杨 华 1 高 翔 1,2,* 陈其皎 1 赵万春 1,* 董 剑 1,2 李晓燕 1
1 西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2陕西省小麦工程技术研究中心 / 陕西省小麦新品种培育研究中心, 陕西杨凌
712100
摘 要: 利用设计的 HMW-GS特异引物, 从簇毛麦 TA10220中克隆到 6条 HMW-GS基因序列(1.0~1.7 kb, GenBank
登录号为KF887414~KF887419), 比普通小麦HMW-GS基因序列小, 其中KF887414~KF887417为能正常表达的基因,
KF887418和 KF887419是编码区出现终止信号的假基因。综合推导氨基酸的序列分析以及基于编码蛋白全序列、N-
端和 C-端域的进化树分析, 认为 KF887414 属于 y 型 HMW-GS, KF887415~KF887419 的氨基酸序列同时具有 x 和 y
型的结构特征。将具有完整编码区的 4个基因在宿主菌 Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3)中经 IPTG诱导表达, 通
过 SDS-PAGE 分析表达的蛋白质和种子提取的 HMW-GS, 经 Western blot 进一步检测表达产物, 证明蛋白质表达成
功。通过 His-Trap HP柱纯化表达蛋白, 回收产物经 SDS-PAGE分析后, 低温冷冻干燥备用。将冷冻干燥的回收产物
加入中国春基础面粉中, 利用微量掺粉试验通过测定粉质参数来鉴定簇毛麦来源的 HMW-GS对面粉品质的影响, 结
果表明, 簇毛麦来源的 4个 HMW-GS对于面粉加工品质具有显著的正向效应。
关键词: 簇毛麦; 高分子量谷蛋白亚基; 原核表达; 掺粉实验
Isolation, Characterization and Farinograph Analysis of Novel HMW-GSs
from Dasypyrum villosum
YANG Hua1, GAO Xiang1,2,*, CHEN Qi-Jiao1, ZHAO Wan-Chun1,*, DONG Jian1,2, and LI Xiao-Yan1
1 College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Wheat Engineering Research Center of Shaanxi Province / New Varie-
ties Cultivation of Wheat Engineering Research Center of Shaanxi Province, Yangling 712100, China
Abstract: Dasypyrum villosum carrying many novel HMW-GS alleles is an important genetic resource for wheat protein im-
provement. In this study, we isolated six HMW-GS genes from D. villosum TA10220 (1.0–1.7 kb, GenBank accession numbers:
KF887414–KF887419), which were substantially smaller than those from common wheat, using a pair of specific primers. An
in-frame stop codon was found in the coding sequences of KF887418 and KF887419 and thus these genes might be pseudogenes.
The comprehensive analysis of deduced amino acid sequence, and phylogenetic and evolutionary analyses of full sequence, N-
and C-terminal domains revealed that KF887414 was closely related to y-type HMW-GS, but KF887415–KF887419 had struc-
tural characteristics of both x- and y-types. DNA fragments of KF887414–KF887417 were subcloned into the pEASY-E2 expres-
sion vector and expressed in Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3) cell under IPTG induction. The four genes were successfully
expressed in E. coli system according to SDS-PAGE analysis (both the expressed protein and HMW-GS isolated from seed) and
western-blotting assay. The fusion protein was purified and recovered by His-Trap affinity chromatography and low temperature
cryodesiccation, and then integrated into the control flour by using a 4 g Micro-dough LAB Farinograph. Results showed that the
four HMW-GSs originated from D. villosum had positive effects on dough quality property.
Keywords: Dasypyrum villosum; High-molecular-weight glutenin subunits (HMW-GS); Prokaryotic expression; Farinograph
小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子
量谷蛋白亚基(LMW-GS)通过分子内和分子间二硫
键形成聚合蛋白 , 从而影响面粉的加工品质 [1]。
HMW-GS影响面团的弹性和面包的加工品质[2-3]。编
第 4期 杨 华等: 簇毛麦新型 HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定 601


码 HMW-GS (60~120 kD)的基因位于第 1部分同源
群染色体 1A、1B 和 1D 长臂上[4-9], 每个位点由 2
个紧密连锁的基因组成, 其中较大的基因编码 x 型
HMW-GS 的合成, 较小的基因编码 y 型 HMW-GS
的合成[9-10]。HMW-GS 具有高度保守的 5’和 3’端序
列, 编码区内部不存在内含子[11-12]。HMW-GS 典型
的结构由 4 部分组成, 分别是信号肽(蛋白质加工过
程被删除)、高度保守的 N-端和 C-端以及中间重复
区[2-3]。x和 y型 HMW-GS主要区别在于半胱氨酸残
基的个数和位置, 中间重复区重复单元的类型, 其
中六肽以 PGQGQQ、九肽以 GYYPTS/PLQQ的保守
形式出现在所有 x、y 型亚基中, 而三肽以 GQQ 的
保守形式只存在在 x 型亚基中[2-3]; 多数的半胱氨酸
残基存在于 N-端保守区, y型的有 5个, 并且第 3和
第 4 个相邻, x 型的有 3 个; C-端都只有 1 个; 但是
1By9、1Dy10和 1Dy12近 C-端的中间重复区多了 1
个半胱氨酸残基, 而 1Dx5 近 N-端的中间重复区多
了 1个半胱氨酸残基[3]。
簇毛麦(Dasypyrum villosum, 2n = 14, VV)属于
禾本科小麦亚族簇毛麦属, 为一年生二倍体异花授
粉草本植物, 具有抗多种病害、品质优良、抗旱耐
寒、密穗、多花及分蘖能力强等特性, 还带有提高
籽粒蛋白质含量、赖氨酸含量和面筋强度的基因 ,
是普通小麦遗传改良优异的三级基因源[13-14]。簇毛
麦 1V 染色体对小麦加工品质具有正效应, 可以显
著提高面筋的强度, 是位于 1V 染色体上 Glu-V1、
Gli-V1和 Glu-V13位点的作用[15-18]。其中 1V染色体
上有: 编码 HMW-GS 的 Glu-V1 位点, 编码贫硫(ω
型)和富硫(γ 型)醇溶蛋白基因 Gli-V1 位点和编码低
分子谷蛋白 Glu-V3位点[15-20]。
利用同源克隆技术, 一些研究者从簇毛麦中分
离到 HMW-GS编码基因及其启动子序列, 并发现了
没有功能的假基因[20-24]。迄今, 尚缺乏对该基因家
族成员多样性、序列特征、以及加工品质特征方面
的深入报道。对簇毛麦 HMW-GS基因序列和推导的
氨基酸序列分析, 可为进一步了解簇毛麦 HMW-GS
与普通小麦 HMW-GS的关系提供依据, 而且原核体
外表达和功能鉴定有助于验证簇毛麦 HMW-GS 对
小麦籽粒品质和加工品质的影响。
1 材料与方法
1.1 HMW-GS提取及 SDS-PAGE分析
参考段淑娥等[25]和 Verbruggen 等[26]的方法, 从
单粒种子中提取簇毛麦 TA10220 (美国堪萨斯州大
学小麦遗传资源研究中心提供) HMW-GS, 然后进
行 SDS-PAGE分析[25-26]。
1.2 目的基因的克隆与序列分析
以室内培养 2周的簇毛麦 TA10220幼嫩叶片为
材料, 采用微量 CTAB法提取基因组 DNA[27]。
根据 GenBank 公布的 HMW-GS 基因编码区的
保守序列设计 1对简并引物(hmw-F: 5-TCATCACC
CACAACACCGA-3; hmw-R: 5-TCACTGGCTRGC
CGACAAT-3), 以簇毛麦 TA10220的基因组DNA为
模板扩增目的基因。反应体系 25 μL, 包含 5×
PrimeSTAR buffer (Mg2+ plus) 5 μL, dNTP Mixture
(各 2.5 mmol L–1) 2 μL, 引物各 1 μL, DNA模板 1 μL,
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U μL–1, TaKaRa)
0.2 μL。PCR 反应条件为 94℃ 2 min; 98℃ 10 s,
68℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共 30个循环; 最后 72℃延
伸 10 min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 利用DNA凝
胶回收试剂盒(天根生化科技北京有限公司)回收目
的条带, 对回收的产物先进行末端加 A 反应, 其反
应体系 10 μL, 含回收产物 4 μL, 2 mmol L–1 dATP
0.8 μL, 10×PCR buffer 1 μL, Taq DNA polymerase
0.3 μL; 然后与克隆载体 pEASY-T1 (北京全式金生
物技术有限公司 )连接 , 转入克隆菌株 E. coli
Trans1-T1 (北京全式金生物技术有限公司)中, 使用
T7/SP6通用引物对白色菌落进行 PCR扩增, 筛选阳
性克隆, 由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。使
用 DNAMAN、MEGA5.0 及 NCBI 和 SignalP 4.1
Server 网站上的在线工具对所得序列进行核苷酸及
推导氨基酸序列分析。
1.3 目的基因的诱导表达与鉴定
根据测序结果设计 2对表达引物(hmwExF1: 5-
GAAGGTGGGGCCTCTGC-3, hmwExR1: 5-CTGG
CTGACCGACAATGC-3; hmwExF2: 5-GAAGGCG
AGGGCTCTGGG-3, hmwExR2: 5-CTGGCTGGCC
GACAATGC-3)。将表达引物扩增的目的基因与表
达载体 pEASY-E2 (北京全式金生物技术有限公司)
连接, 转入克隆菌株 E. coli Trans1-T1中, 在 LB固
体培养基(含 50 mg L–1 AMP)上筛选阳性克隆。用
T7F/hmwExR 或 hmwExF/T7R 引物筛选具有正确表
达方向的重组子, 经测序确定序列的正确性。提取
质粒, 转入表达菌株 E. coli Rosetta-gami B(DE3)(北
京全式金生物技术有限公司)中。挑取单个阳性克隆
至 LB液体培养基(含 50 mg L–1 AMP)中, 37℃过夜,
将培养物按 1∶100 接种至新鲜 LB 液体培养基(含
602 作 物 学 报 第 40卷


50 mg L–1 AMP)中, 37℃, 200转 min–1培养至菌液
OD600值为 0.5; 取 1 mL菌液作为阴性对照, 向剩余
菌液中加入 IPTG (1 mmol L–1), 37℃诱导 6 h, 12 000
× g离心 10 min收集菌体, 用 SDS-PAGE (12%分离
胶, 4%浓缩胶)分析蛋白表达结果。
1.4 表达产物的Western blot分析
处理后的蛋白样品经 12% SDS-PAGE, 马上电
转移至硝酸纤维素 (NC)膜 , 用新鲜配制的封闭液
(5%脱脂奶粉), 在室温摇床封闭 1 h, 弃封闭液; 以
鼠抗 His 抗体为一抗(1∶10 000), 室温孵育 1 h, 用
TBS和 TBST各洗膜 2次, 每次 15 min; HRP标记的
羊抗鼠 IgG 为二抗(1∶10 000), 用 TBS 和 TBST 各
洗膜 2次, 每次 15 min, 最后用 DAB显色试剂盒进
行化学发光显色。
1.5 目的蛋白的分离纯化
收集诱导表达菌液, 于 4℃ 12 000 × g 离心
10 min, 弃上清液, 加入 10 mL破碎缓冲液(pH 8.5,
50 mmol L–1 Tris-HCl, 2 mmol L–1 EDTA, 100 mmol
L–1 NaCl, 1 mg L–1溶菌酶)重悬菌体。冰浴 45 min后
超声破碎, 离心收集沉淀。沉淀经过预处理后过柱
纯化, 平衡缓冲液为 50 mmol L–1磷酸缓冲液(pH 7.4,
0.5 mol L–1 NaCl, 20 mmol L–1咪唑), 将洗脱缓冲液
为 50 mmol –1磷酸缓冲液(pH 7.4, 0.5 mol L–1 NaCl,
4 mol L–1脲, 500 mmol L–1咪唑), 收集的溶液透析
24 h, 低温冷冻干燥保存待用。用 SDS-PAGE (12%
分离胶, 4%浓缩胶)分析蛋白纯化结果。
1.6 目的蛋白的功能鉴定
用 4 g 全自动微型粉质仪(Micro-dough LAB,
Perten公司, 瑞典)测定粉质参数。参考国家标准《小
麦吸水量和面团揉和性能测定法——粉质仪法
(GB/T14614-93)》和 HMW-GS 功能的体外鉴定法,
设定如下程序。称基础面粉 4 g, 与 10 mg目的蛋白
混合, 加入适量水和 50 μg mL–1 DTT 0.25 mL, 揉和
0.5 min 后加入 200 μg mL–1 KIO3 0.25 mL, 反应
4 min, 记录粉质仪曲线。参考 Xu等[28]和 Chen等[29]
的描述分析粉质参数。
2 结果与分析
2.1 核苷酸序列分析
利 用 引 物 对 hmw-F/hmw-R 扩 增 簇 毛 麦
TA10220 基因组 DNA, 获得 1~2 kb 的目标条带(图
1)。回收该条带, 末端加 A, 连接至 pEASY-T1载体
上, 转化到大肠杆菌 Trans1-T1中, 经过菌落 PCR扩
增, 筛选出 43 个阳性克隆, 测序后通过序列比对,
得到 6 个非重复序列。用 NCBI 在线工具 BLASTn
对测序结果进行同源性分析, 表明测得 6 条序列与
数据库中已经公布的一年生簇毛麦(D. villosum)、多
年生簇毛麦(D. breviaristatum)、小麦及其亲缘植物
的 HMW-GS相似性很高。因此, 初步确定这 6个序
列为簇毛麦 HMW-GS 基因, 将序列提交 GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), 登录号为
KF887414至 KF887419。

图 1 2%琼脂糖凝胶电泳分析 PCR产物
Fig. 1 Amplified product separated on 2% agarose gel
M: 分子量标准 DM2000; Negative:
无 DNA模板的阴性对照; 箭头示目的带。
M: DNA marker DM2000; Negative: template DNA free;
the arrows show target bands.

2.2 推导的氨基酸序列分析
用 NCBI在线工具 ORF Finder分析克隆获得的
6条目标序列, KF887414、KF887415、KF887416和
KF887417具有完整的开放阅读框(表1), 编码区内无
内含子; KF887418 和 KF887419 同样具有完整的开
放阅读框 , 编码区内也没有内含子的存在 , 但在
KF887418编码氨基酸的第 323位和 KF887419编码
氨基酸的第 269位分别出现提前终止信号(图 2)。经
多次测序鉴定表明, 这 2个基因可能是假基因。
6条推导氨基酸序列均包括信号肽、N-端保守区、
中间重复区和 C-端保守区等 HMW-GS 典型的氨基
酸序列结构特征(图 2); 与小麦属 A、B 和 D、山羊
草属 C和 U、偃麦草属 E、黑麦 R和类大麦属 K染
色体组编码的 HMW-GS 氨基酸组成及结构特征相
似(表 2)。其中, 所有推测的氨基酸序列的信号肽均
由 21个氨基酸残基组成, 但在第 8、第 13、第 16和
第 18 氨基酸处分别出现 C/L、V、L 和 F 的多态性
位点, 但 SignalP 分析表明, 这些多肽性位点不影

第 4期 杨 华等: 簇毛麦新型 HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定 603


表 1 核苷酸序列和氨基酸序列特征
Table 1 Basic characteristics of nucleotide sequence and amino acid sequence
核苷酸序列 Nucleotide sequence 推导产物 Deduced amino acid sequence 登录号 1)
Accession
number 1)
序列长度
Length (bp)
开放阅读框位置
Position of ORF
氨基酸个数 2)
Size of putative protein 2)
分子量 2)
Molecular weight (kD) 2)
融合表达蛋白的分子量 3)
Molecular weight of fusion
protein product (kD) 3)
KF887414 1665 61–1665 bp 534 57.308 57.355
KF887415 1296 61–1296 bp 411 45.034 45.081
KF887416 1152 61–1152 bp 363 39.809 39.841
KF887417 1152 61–1152 bp 363 39.866 39.898
KF887418 1539 61–1539 bp 492 53.729 —
KF887419 1377 61–1377 bp 438 47.824 —
1)下画线表示假基因; 2)推导的氨基酸序列包括信号肽; 3)融合表达的蛋白没有信号肽, 但包含有 2.101 kD的 His-Tag标签。
1) The pseudogenes are underlined; 2) The deduced products contain signal peptides; 3) The expressed proteins without signal peptides
contain His-Tag of 2.101 kD.


图 2 KF887414、KF887415、KF887416、KF887417、KF887418和 KF887419推导氨基酸序列分析
Fig. 2 Deduced amino acid sequences of KF887414, KF887415, KF887416, KF887417, KF887418, and KF887419
604 作 物 学 报 第 40卷


表 2 不同来源的 HMW-GS的主要结构特征的比较
Table 2 A summary of properties of the primary structure of HMW-GS from Dasypyrum villosum in comparison
with some HMW-GS from common wheat and wheat-related grass
N-端保守区
N-terminal region
中间重复区
Repetitive region
C-端保守区
C-terminal region
总数
Total 亚基
Subunit
来源
Origin
登录号
Accession
number
编码区长度
Size of coding
sequence
(bp)
信号肽
Signal
peptide
Size (aa)
长度
Size (aa)
Cys
长度
Size (aa)
Cys
长度
Size (aa)
Cys
长度
Size (aa)
Cys
1Ax1 T. aestivum X61009 2490 21 86 3 681 0 42 1 830 4
1Bx7 T. aestivum X13927 2367 21 81 3 645 0 42 1 789 4
1Bx14 T. aestivum AY367771 2385 21 86 1 646 0 42 1 795 2
1Cx Ae. markgrafii AF476959 2385 21 86 3 646 0 42 1 795 4
1Dx2 T. aestivum X03346 2514 21 88 3 687 0 42 1 838 4
1Dx5 T. aestivum X12928 2517 21 89 3 687 1 42 1 839 5
1Ex2 T. elongatum EF204546 2049 21 89 3 531 0 42 1 683 4
1Kx C. delileana AY804128 2046 21 86 3 533 0 42 1 682 4
1Ux Ae. umbellulata AF476961 2976 21 86 3 843 0 42 1 992 4
1Rx S. cereale AJ314782 2343 21 86 3 632 0 42 1 781 4
1Ay T. aestivum X03042 1803 21 104 5 455 0 42 1 601 6
1By9 T. aestivum X61026 2115 21 104 5 538 1 42 1 705 7
1Cy Ae. markgrafii AF476960 1899 21 104 5 466 1 42 1 633 7
1Dy10 T. aestivum X12929 1944 21 104 5 481 1 42 1 648 7
1Dy12 T. aestivum BK006459 1974 21 104 5 491 1 42 1 658 7
1Ey T. elongatum AY280615 1524 21 105 5 340 1 42 1 508 7
1Ey2 T. elongatum EF204547 1236 21 105 5 244 1 42 1 412 7
1Ky C. delileana AY834230 1725 21 105 5 407 1 42 1 575 7
1Uy Ae. umbellulata AF476962 1965 21 104 5 488 1 42 1 655 7
1Ry S. cereale AJ314767 2121 21 104 5 540 1 42 2 707 8
1V D. villosum FJ600492 1494 21 105 5 330 0 42 1 498 6
1V D. villosum AY608740 1467 21 102 4 329 0 37 1 489 5
1V D. villosum KF887414 1602 21 102 5 369 1 42 1 534 7
1V D. villosum KF887415 1233 21 105 5 243 0 42 1 411 6
1V D. villosum KF887416 1089 21 102 5 198 0 42 1 363 6
1V D. villosum KF887417 1089 21 102 5 198 0 42 1 363 6
1V D. villosum KF887418 1476 21 102 5 327 0 42 1 492 6
1V D. villosum KF887419 1314 21 105 5 270 1 42 1 438 7
AgeloG6 A. elongatum AY263345 1425 21 104 5 308 0 42 1 475 6
AgeloG9 A. elongatum AY264065 1488 21 105 5 328 1 42 1 496 7
AgeloG10 A. elongatum DQ078274 1149 21 105 5 215 1 42 1 383 7

响其疏水性; 在 N-端保守区, KF887415 和 KF887419
由 105个氨基酸残基组成 , 与其相比 KF887414、
KF887416、KF887417和 KF887418的 N-端保守区由
102个氨基酸残基组成, 缺少 KGG这 3个氨基酸残
基, 表明这 6 条序列的 N-端保守区具有 y型 HMW-
GS 的特征; 在中间重复区, 六肽和九肽等高度保守
的结构单元重复出现, 但在 KF887415、KF887416、
KF887417、KF887418和 KF887419的中间重复区多
次出现类三肽 PGQ, 具有 x型 HMW-GS的中间重复
区特征, 而 KF887414仅具有 y型 HMW-GS中间重
复区的结构特征; 所推测的 6条序列的 C-端保守区
均由 42个氨基酸残基组成; KF887415、KF887416、
KF887417 和 KF887418 成熟的氨基酸序列(无信号
肽)具有 6个半胱氨酸残基, 而 KF887414和 KF887419
第 4期 杨 华等: 簇毛麦新型 HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定 605


有 7 个半胱氨酸残基, 其中, N-端保守区均有 5 个
半胱氨酸残基, 第 3和第 4个相邻, 符合 y型HMW-
GS 氨基酸序列 N-端保守区的特点, C-端保守区均
有 1个半胱氨酸残基, 但在中间重复区, KF887414
近 C-端保守区的第 420氨基酸处和 KF887419的近
N-端保守区的第 167氨基酸处为半胱氨酸残基(图 2
和表 2)。因此认为, KF887414属于 y型 HMW-GS,
而 KF887415~KF887419 为同时具有 x 和 y 型结构
特征的混合亚基。
2.3 系统进化树分析
利用MEGA5.1软件, 对来自 D. villosum的 6个
克隆序列与来自小麦、山羊草属、偃麦草属、黑麦、
类大麦属等不同基因组和已经公布的簇毛麦属 V染
色体组编码的 HMW-GS 氨基酸序列进行全序列、
N-端保守区和 C-端保守区聚类分析。在全序列聚类
图中, 本试验获得的 6个序列与 y型 HMW-GS的关
系较近, 与 x型HMW-GS的关系较远; 在 y型HMW-
GS类型中, 与小麦 A、B和 D、山羊草属的 C和 U、
偃麦草属 E、黑麦 R 和类大麦属 K 染色体组的亲缘
关系较远, 但与簇毛麦属 V染色体组的 HMW-GS同
属一支(图 3-A)。N-端保守区聚类图显示与全序列分
析结果相似(图 3-B), 但 C-端保守区分析结果略有不
同: 除 KF887414 外的各序列与 x 型 HMW-GS 的 C-
端保守区的亲缘关系较近, 其中又与簇毛麦 V 的关
系最近, 而与小麦 A、B和 D、山羊草属的 C和 U和
黑麦 R 染色体组的亲缘关系较远, KF887414 与 y 型
的 HMW-GS的关系较近, 尤其与小麦 D和山羊草属
U染色体组的亲缘关系较近(图 3-C)。

图 3 簇毛麦 HMW-GS编码的蛋白序列系统演化分析(Neighbor-joining进化树)
Fig. 3 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequence of HMW-GS from Dasypyrum villosum (Neighbor-joining tree)
A: 全序列; B: N-端保守区; C: C-端保守区。
A: full length sequence; B: N-terminal region; C: C-terminal region.

2.4 表达产物的 SDS-PAGE分析
由于 KF887418 和 KF887419 是序列内部有提
前终止信号的假基因, 所以未对其进行原核表达。
其他 4 个初步判定为有功能的基因, 根据目的序列
的完整编码区, 设计 2 对表达引物, 筛选表达基因
插入方向正确的阳性克隆并测序鉴定。然后加入
IPTG诱导 6 h, 表达载体和能够表达的基因的重组
质粒在 E. coli Rosetta-gami B(DE3) 中表达, 表达
载体上的 His标签的大小为 2.101 kD, 融合表达蛋
白产物的分子质量如表 1 所示, 与电泳检测的蛋白
质条带大小相似(图 4-A); 原核表达的蛋白质与来
源于种子的高分子谷蛋白亚基具有基本相同的迁
移率(图 4-B), 表明克隆的 HMW-GS 基因在大肠杆
菌中正确表达。
2.5 目的基因表达产物的Western blot分析
重组质粒经诱导产生的蛋白质条带与 His 抗体
产生特异杂交信号(图 5), 表明目的蛋白基因得到了
成功表达。
606 作 物 学 报 第 40卷



图 4 KF887414、KF887415、KF887416和 KF887417基因的诱导表达产物和种子 HMW-GS的 SDS-PAGE分析
Fig. 4 Analyses of expressed proteins of genes from KF887414 to KF887417 and comparison with seed HMW-GS using SDS-PAGE
M: 蛋白质分子质量标准 Marker II。A图中, 1、3、5和 7泳道为未诱导重组质粒表达产物; 2、4、6和 8泳道为经 IPTG诱导后的重
组质粒的表达产物; 箭头示基因的表达产物。B图中, 泳道 1为未诱导重组质粒表达产物; 2~5泳道为经 IPTG诱导后的重组质粒的
表达产物, 依次是 KF887414、KF887415、KF887416和 KF887417基因; 泳道 6为种子提取的 HMW-GS; 箭头示目的蛋白。
M: Protein ladder marker II. In panel A, lanes 1, 3, 5, and 7 show proteins of recombinant plasmid before induction and lanes 2, 4, 6, and 8
show proteins of recombinant plasmid after adding IPTG; the arrows show expression products. In panel B, lane 1 shows the protein of re-
combinant plasmid before induction; lanes 2, 3, 4, and 5 show proteins of recombinant plasmid KF887414, KF887415, KF887416, and
KF887417 after adding IPTG, respectively; lane 6 shows HMW-GS extracted from Dasypyrum villosum seed; the arrows show target proteins.


图 5 KF887414、KF887415、KF887416和 KF887417基因的
诱导表达产物 Western blot检测
Fig. 5 Western blotting assay of expressed proteins of genes
from KF887414 to KF887417
M: 蛋白质分子质量标准 Marker II。1、2、3和 4泳道分别为
KF887414、KF887415、KF887416和 KF887417基因经 IPTG诱
导后的表达产物; 箭头示基因的表达产物。
M: Protein ladder marker II; lanes 1, 2, 3, and 4 show proteins of
recombinant plasmid KF887414, KF887415, KF887416, and
KF887417 after adding IPTG, respectively; the arrows show target
proteins.

2.6 目的蛋白的纯化分析
诱导后的蛋白样品经蛋白提取和处理 , 用
His-Trap HP 柱亲和纯化目的蛋白, 回收蛋白溶液,
用 12% SDS-PAGE 检测, 得到单一条带, 大小与融
合表达产物的相似(图 6), 表明蛋白纯化成功。
2.7 目的蛋白质的功能鉴定
在 4 g 基础面粉中添加还原剂 DTT 和氧化剂
KIO3后, 得到粉质曲线及相应参数(图 7-A 和表 3);
利用氧化还原反应原理, 将纯化后的目的蛋白 10 mg
加入对照面粉, 得到粉质曲线图(图 7-B~E)和相关参
数(表 3)。与对照相比, 簇毛麦 HMW-GS 的加入引

图 6 KF887414、KF887415、KF887416和 KF887417基因的
诱导表达产物柱纯化
Fig. 6 Analyses of purification of expressed proteins of genes
from KF887414 to KF887417 using SDS-PAGE
M: 蛋白质分子质量标准 Marker II。1、2、3和 4泳道分别为
KF887414、KF887415、KF887416和 KF887417基因经 IPTG诱
导后的表达产物; 箭头示基因的表达产物。
M: Protein ladder marker II; lanes 1, 2, 3, and 4 show proteins of
recombinant plasmid KF887414, KF887415, KF887416, and
KF887417 after adding IPTG, respectively; the arrows show target
proteins.

起了粉质曲线和粉质参数变化, 其中, DvT、ST、DT
和 FQN都有不同程度的增加, 并且增幅均存在显著
或极显著差异; MTI 都有不同程度的下降, 降幅差
异显著或极显著; 与对照相比, 加入 KF887414 和
KF887415 基因表达产物的 DS 减小且差异显著, 而
加入 KF887416和 KF887417基因表达产物的 DS没
有变化; KF887414和 KF887415样品的 AT时间推后
并与对照差异显著 , KF887416 的 AT 无变化 , 而
KF887417的 AT提前并且变化极显著(图 7、图 8和
表 3)。
第 4期 杨 华等: 簇毛麦新型 HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定 607



图 7 簇毛麦来源的 HMW-GS对粉质曲线的影响
Fig. 7 Effects of HMW-GS from Dasypyrum villosum on farinograph parameters
A: 中国春添加 DTT、KIO3; B: 中国春添加 DTT、KIO3和 KF887414; C: 中国春添加 DTT、KIO3和 KF887415;
D: 中国春添加 DTT、KIO3和 KF887416; E: 中国春添加 DTT、KIO3和 KF887417。
A: Chinese Spring with DTT and KIO3; B: Chinese Spring with DTT, KIO3, and KF887414; C: Chinese Spring with DTT, KIO3, and
KF887415; D: Chinese Spring with DTT, KIO3, and KF887416; E: Chinese Spring with DTT, KIO3, and KF887417.

表 3 纯化蛋白亚基的粉质参数
Table 3 Farinograph parameters of purified HMW-GS from Dasypyrum villosum
添加物
Additive
形成时间
DvT (min)
稳定时间
ST (min)
弱化度
DS (FU)
机械耐力系数
MTI (FU)
及线时间
AT (min)
离线时间
DT (min)
粉质质量参数
FQN (mm)
DTT, KIO3 1.2 C 0.9 C 174.9 A 198 A 0.9 B 1.7 A 4.83 E
DTT, KIO3 KF887414 1.6 A 1.2 B 154.9 C 170 C 1.1 A 2.3 C 7.67 A
DTT, KIO3 KF887415 1.6 A 1.2 B 159.9 B 180 B 1.1 A 2.3 C 6.67 D
DTT, KIO3 KF887416 1.5 B 1.2 B 174.9 A 185 B 0.9 B 2.2 B 7.50 B
DTT, KIO3 KF887417 1.5 B 1.5 A 174.9 A 185 B 0.7 C 2.2 B 7.17 C
表中数据为 3次试验的平均值, 均值后大写字母表示 0.01差异显著水平。
Data are the average of triplicated micro-mixing experiments. Means marked with different letters are significantly different at P < 0.01.
DvT: development times; ST: stability time; DS: degree of time; MTI: mixing tolerance index; AT: arrival time; DT: departure time; FQN:
farinograph quality number.
608 作 物 学 报 第 40卷



图 8 添加 KF887414、KF887415、KF887416和 KF887417基
因表达蛋白的中国春与中国春(对照)粉质参数的比较
Fig. 8 Comparison of farinogragh parameters between Chi-
nese Spring (control) and Chinese Spring with expressed pro-
teins of KF887414, KF887415, KF887416, and KF887417
DvT: 形成时间; ST: 稳定时间; DS: 弱化度; MTI: 机械耐力系
数; AT: 及线时间; DT: 离线时间; FQN: 粉质质量参数。
DvT: development time; ST: stability time; DS: degree of time;
MTI: mixing tolerance index; AT: arrival time;
DT: departure time; FQN: farinograph quality number.
3 讨论
利用设计的 HMW-GS 特异引物 , 从簇毛麦
TA10220基因组中获得 43个阳性克隆, 鉴定出 6种
特异的编码序列。根据编码序列推断, KF887418和
KF887419分别在氨基酸第 323和第 269位处出现终
止密码(TGA), 推测可能是由于碱基的转换突变造
成的。关于贮藏蛋白编码序列的内部出现终止密码
的现象已有报道 , 由密码子 CAG (Gln)突变成
TAG(终止密码)或由 CAA (Gln)突变成 TAA (终止密
码)造成了 1Ay、1Ax、1Dx不能正常表达, 成为了假
基因, 由于碱基的转换突变引起的基因沉默同样也
存在于醇溶蛋白基因中[30-33]。Zhong和 Qualset[34]通
过提取种子全蛋白对 122 份来源不同的二倍体簇毛
麦 HMW-GS 分析表明 , 这些簇毛麦所编码的
HMW-GS均在中国春 1Dx2亚基和 1Dy12亚基之间。
理论上这 122份簇毛麦的HMW-GS亚基分子量也在
70~140 kD 之间, 但是该结论未经基因水平的验证,
同时通过提取种子的全蛋白来分析 HMW-GS 无法
排除种子醇溶蛋白和 LMW-GS对结论的影响。本研
究利用专门分离 HMW-GS 的方法提取种子
HMW-GS, 通过对提取条件的优化尽可能地排除醇
溶蛋白和 LMW-GS的影响。虽然其余 4个真基因的
表达蛋白分子量均小于 70 kD, 但是体外表达蛋白
质和种子来源的 HMW-GS 具有基本相同的迁移率
(图 4-B), 表明本研究所得到的 4条蛋白质来自簇毛
麦 TA10220, 并将这 6个基因序列根据类型划分为 1
个 y 型亚基和 5 个混合型亚基。显然, 来源于二倍
体簇毛麦 TA10220 的 HMW-GS 无论在亚基数目及
亚基类型上都与普通小麦存在显著差异, 该物种本
身的异花授粉特性所导致的高度异质可能对此产生
一定的影响[13-14], 而其分子机制尚需进一步研究。
HMW-GS 是影响加工品质重要的遗传因素, 簇
毛麦的 HMW-GS 多为普通小麦不具有的新亚基类
型, 并已证实对面筋质量有显著的正向效应。了解
簇毛麦 HMW-GS基因的分子特征, 对于进一步利用
新型 HMW-GS 基因改良普通小麦面筋质量具有一
定的意义。目前已从普通小麦及其亲缘属种中克隆
了众多 HMW-GS 基因 , 这些基因的分子量在
1.8~2.6 kb之间, 编码的蛋白质分子量在 60~140 kD
之间(表 2)。随着研究的深入以及对结构功能的认识,
发现一些小于 1.8 kb 的麦谷蛋白基因同样具有
HMW-GS 的特点[21-24,35-42]。本文利用同源克隆技术
克隆到的簇毛麦 HMW-GS基因小于 1.8 kb, 但其推
导氨基酸序列, 具有HMW-GS结构特点(图 2), 编码
区没有内含子, 具有 21个氨基酸残基的信号肽, 高
度保守的 N-和 C-端及中间重复区[11-12], 尽管分子量
较小, 也应该是 HMW-GS基因。这与前人所克隆的
簇毛麦 HMW-GS基因结果[20-24]较为一致。由于簇毛
麦与小麦的亲缘关系较远 , 传统的以大小区分
HMW-GS 的方法, 在簇毛麦研究分析上也许存在一
定的局限性。普通小麦 HMW-GS大小的分类方法不
适合对远缘材料的分类(表2), 即不能仅仅依据 SDS-
PAGE 上的迁移率区分。尤其在对利用簇毛麦等远
缘材料所创制的材料, 包括易位系、附加系鉴定的
时候, 不能仅仅靠蛋白质分子量大小进行染色体易
位片段的判断。
本研究得到的所有簇毛麦 HMW-GS 基因编码
的氨基酸序列, N-端保守区有 5个半胱氨酸残基, 并
且第 3 和第 4 位半胱氨酸残基相邻, 与报道的 y 型
HMW-GS的N-端保守区的特征一致(图 2和表 2); N-
进化树分析也表明该 6条推导的氨基酸序列的 N-端
保守区与 y 型关系较近与 x 型关系较远(图 3-B)。
KF887414 的中间重复区六肽 (PGQGQQ)和九肽
(GYYPTSP/LQQ)高度重复 , 不存在三肽(GQQ), 表
明 KF887414 基因编码的氨基酸序列具有 y 型
HMW-GS 的中间重复区的特征[2-3], 而 KF887415~
KF887419 除重复出现六肽 (PGQGQQ)和九肽
(GYYPTSP/LQQ)外 , 还具有类似三肽 (GQQ)PGQ,
第 4期 杨 华等: 簇毛麦新型 HMW-GS的序列分析及加工品质效应鉴定 609


表明这些序列的中间重复区具有典型的 x 型
HMW-GS 特征[2-3], 庞玉辉等[21]报道的 N-端保守区
具有 y型HMW-GS特征的簇毛麦高分子谷蛋白的中
间重复区也存在 PGQ、GQQ和 RGQ等三肽。本研
究中, 氨基酸序列的 C-端保守区具有一个半胱氨酸
残基。C-端进化树分析表明 KF887414 与 y 型亲缘
关系较近, 而 KF887415~KF887419与 x型关系较近
(图 3-C)。KF887414的近 C-端重复区多 1个半胱氨
酸残基, KF887419的近 N-端重复区多出 1个(图 2)。
以上分析表明, 某些簇毛麦 HMW-GS兼有普通小麦
来源的 x 和 y 型的一些结构特征, 此种现象可能是
簇毛麦物种本身的特异性所致。因此, 用以区分栽
培小麦 x和 y型 HMW-GS的分类方法需要进行适当
完善方能反映其亲缘关系较远的野生种属所具有的
同源亚基的属性。
利用微量掺粉试验可以直观地检测亚基的品质
效应, 簇毛麦 TA10220来源的 4个 HMW-GS的掺入
均使整个面团的空间结构经历了某些剧烈改变, 并
最终表现为粉质曲线图的明显变化(图 7): 面团的形
成时间延长, 表明上述亚基具有提高基础面粉面筋
质量的潜力; 稳定时间延长表明提高了面团的耐揉
性、韧性和面筋的强度; 离线时间延长表明面筋强
度或耐受过度搅拌的能力增强; 粉质质量参数显著
提高表明面团的综合质量具有显著的正向效应; 耐
搅拌指数降低说明面团的耐揉性提高(图 8和表 3)。
因此, 簇毛麦中的 HMW-GS对面团的品质有正向效
应。通过杂交育种的方式将簇毛麦的 HMW-GS基因
转入小麦, 对改良普通小麦的加工品质, 增加其遗
传多样性具有重要意义。
4 结论
克隆到 6个 HMW-GS基因序列, 均小于 1.8 kb,
其中 KF887418和KF887419是编码区具有终止信号
的假基因, 这 6个序列均具有 HMW-GS显著的结构
特征, 并且与已知的 HMW-GS 的亲缘关系较近; 其
中 KF887414 为 y 型 HMW-GS, 而其他序列均同时
具有 x 和 y 型 HMW-GS 结构特征。簇毛麦来源的
HMW-GS对面粉的加工品质有显著的正向效应。
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