全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(4): 581−590 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家“十二五”科技支撑计划项目(2012BAK17B03)和浙江省自然科学基金项目(Y3110334, LY13C020002, Y2090945)资助。
∗ 通讯作者(Corresponding author): 朱诚, E-mail: pzhch@cjlu.edu.cn, Tel: 0571-86914510
第一作者联系方式: E-mail: 21007016@zju.edu.cn
Received(收稿日期): 2013-09-09; Accepted(接受日期): 2014-01-12; Published online(网络出版日期): 2014-02-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140214.1016.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00581
两个水稻品种镉积累相关基因表达及其分子调控机制
黄志熊 1,2 王飞娟 2 蒋 晗 2 李志兰 3 丁艳菲 2 江 琼 2
陶月良 4 朱 诚 1,2,*
1 浙江大学生命科学学院 / 生理生化国家重点实验室, 浙江杭州 310058; 2 中国计量学院生命科学学院 / 浙江省生物计量及检验检
疫技术重点实验室, 浙江杭州 310018; 3 浙江省自然科学基金委员会, 浙江杭州 310012; 4 温州大学生命与环境科学学院, 浙江温州
325035
摘 要: 内源小干扰 RNAs (small interfering RNAs, siRNAs)和 DNA甲基化在植物生长发育和适应环境胁迫中调控基
因的表达。对于植物来说, 镉(Cadmium, Cd)是一种非必需且具有毒性的元素。为研究 DNA甲基化和 siRNAs在水稻
(Oryza sativa L.) Cd积累相关基因表达调控方面的作用, 比较了 Cd高积累品种(秀水 110)和 Cd低积累品种(秀水 11)
中 Cd 积累相关基因的表达情况。结果表明, 在秀水 110 和秀水 11 叶片中, 除植物 Cd 抗性蛋白(plant cadmium re-
sistance protein, PCR)基因家族成员 OsPCR1的表达水平呈现出显著的差异外, 其他 Cd积累相关基因的表达水平不存
在显著的差异。说明 OsPCR1基因可能参与调控水稻体内 Cd的积累。利用荧光实时定量 PCR (qRT-PCR)技术研究了
水稻叶片中 siRNA表达水平在水稻 5个不同生长发育期中的变化情况。数据显示水稻叶片中与 OsPCR1基因外显子
2 匹配的 siRNA 的丰度和 OsPCR1 基因的表达水平呈负相关。进一步利用 McrBC-qRT-PCR 技术研究 OsPCR1 基因
外显子 2甲基化水平在水稻 5个不同生长发育期中的变化情况表明, 在 Cd处理条件下水稻叶片中 OsPCR1基因外显
子 2甲基化水平和该基因的表达水平也呈负相关。说明, 在水稻体内 Cd积累的过程中, 该 siRNA和 OsPCR1基因外
显子 2甲基化可能参与调控 OsPCR1基因的表达。这些结果对于研究 OsPCR1基因的功能和培育 Cd低积累水稻品种
具有重要的理论指导意义。
关键词: siRNA; DNA甲基化; OsPCR1; 水稻; Cd积累
Comparison of Cadmium-Accumulation-Associated Genes Expression and
Molecular Regulation Mechanism between Two Rice Cultivars (Oryza sativa L.
subspecies japonica)
HUANG Zhi-Xiong1,2, WANG Fei-Juan2, JIANG Han2, LI Zhi-Lan3, DING Yan-Fei2, JIANG Qiong2, TAO
Yue-Liang4, and ZHU Cheng1,2,*
1 State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Zhejiang
Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection and Quarantine, College of Life Sciences, China Jiliang University, Hangzhou 310018,
China; 3 Nature Science Foundation Committee of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China; 4 College of Life and Environment Sciences, Wen-
zhou University, Wenzhou 325035, China
Abstract: In plants, as in other eukaryotes, endogenous small interfering RNAs (siRNAs), a class of small non-coding RNAs, and
DNA methylation regulate gene expression in developmental processes and adaptating to environmental stresses, including Cd
stress. Cadmium (Cd) is a non-essential heavy metal and highly toxic to plants. To investigate the regulatory role of siRNAs and
DNA methylation on genes involved in heavy metals transport, we compared these genes’ expression profiles between a high
Cd-accumulating rice (Oryza sativa L. subspecies japonica) cultivar (Xiushui 11) and a low Cd-accumulating rice cultivar
(Xiushui 110). At five rice development stages investigated, the difference of these genes expression level between the two rice
cultivars was not significant except OsPCR1, indicating OsPCR1 may be important in Cd transport in rice. Furthermore, quantita-
582 作 物 学 报 第 40卷


tive real time PCR (qRT-PCR) was performed to examine the expression level of a siRNA matched OsPCR1 second exon. Results
indicated that the expression level of the siRNA negatively correlated with OsPCR1 expression level at the five stages. In addition,
McrBC-qRT-PCR technology was used to determine DNA methylation level, showing that OsPCR1 expression level also nega-
tively correlated with OsPCR1 second exon methylation level. These results of regulatory roles of siRNA and DNA methylation
on OsPCR1 expression will contribute to the studies on OsPCR1 function and rice breeding for low Cd accumulation.
Keywords: siRNA; DNA methylation; OsPCR1; Rice (Oryza sativa L.); Cadmium accumulation
镉(cadmium, Cd)是一种毒性极强的重金属[1]。
近年来, 熔炼、采矿和含 Cd化肥的施用等造成大量
农田 Cd污染[2]。水稻根系易从土壤中吸收 Cd, 并向
地上部分转移后积累在稻米中, 造成稻米Cd含量超
标[1,3]。Cd可通过食物链进入人体, 对人类健康造成
严重威胁[4]。
研究认为, Cd转运子和 Cd2+螯合蛋白参与水稻
体内 Cd 的积累[5-9]。OsLCD 基因在水稻根部维管束
和叶片韧皮部伴胞中表达, 参与稻米中 Cd的积累[7]。
OsLCT1基因在水稻叶片和节的维管组织中表达[1]。
OsLCT1 蛋白是定位于细胞膜的蛋白, 参与 Cd 从细
胞内部向外界的排放[1]。植物体内编码 Cd2+螯合蛋
白的基因, 如金属硫蛋白基因 OsMT1、富含半胱氨
酸多肽基因 OsDCT1 和植物螯合肽基因 OsPCs, 参
与其体内 Cd2+的螯合和转移[5,10]。
近年来的研究证实植物 Cd 抗性蛋白 (plant
cadmium resistance protein, PCR)和植物 Cd抗性相关,
它含有 CCXXXCPC 保守氨基酸序列, 属于膜蛋白
家族[11]。该蛋白家族成员通常形成同源聚合体, 参
与 Cd2+从细胞内部向外界的转移[8-9,12], 尤其在植物
根部对 Cd2+的排放和 Cd 从植物地下部向地上部的
转移过程中发挥重要作用[9,12]。
虽报道有大量的Cd积累相关基因, 但其表达的
分子调控机制尚不明确。和其他真核生物一样, 在
应对环境胁迫过程中, 包括重金属胁迫, 在植物中
基因的表达受到内源小干扰 RNA 的调控 [13-17]。
siRNAs 是通过 RNA 酶 III 家族成员 DICER 剪切双
链 RNA 形成的一类长度为 20~25 个核甘酸(nt)具有
基因沉默作用的 RNA 双链单位[18]。siRNAs 的一条
链选择性结合到 Argonaute (AGO)蛋白从而形成
RNA 介导的沉默复合物 (RNA-induced silencing
complex, RISC)[19], AGO剪切与 siRNA互补配对的
靶 mRNA [20], 最终导致靶基因沉默而失活[18]。
植物 siRNAs与 DNA甲基化相关[21]。胞嘧啶甲
基化修饰是一种基因沉默机制, 真核生物常用它失活
自私 DNA重复序列(包括转座子)来保护基因组[22]。现
已发现植物在发育和适应环境胁迫的过程中也使用
DNA甲基化来调控内源基因的表达[21-27]。在很多生
物的发育过程中, 转录的基因在基因本体区域(外显
子区域或者内含子区域)和启动子区域都出现高水
平的 DNA 甲基化[28-32], 而且 DNA 甲基化是高度动
态的[33]。DNA甲基化水平的动态变化参与基因的表
达调控。
本研究采用 qRT-PCR技术比较了不同生长发育
期Cd高积累水稻品种(秀水 110)和Cd低积累水稻品
种(秀水 11)叶片中Cd积累相关基因的表达情况来阐
述水稻体内 Cd 积累的分子调控机制。研究表明 2
个水稻品种叶片中除 OsPCR1外, 其他 Cd积累相关
基因的表达不存在显著的差异。结果分析表明, 和
OsPCR1 基因第 2 个外显子区域匹配的 siRNA 和该
外显子区域的DNA甲基可能共同调控OsPCR1基因
的表达。
1 材料与方法
1.1 材料及培养条件
水稻品种秀水 11 (Oryza sativa L. subsp. japoni-
ca cv. Xiushui 11)和秀水 110 (Oryza sativa L. subsp.
japonica cv. Xiushui 110)。在含有 3.62 mg kg–1 Cd污
染条件下种植的秀水 110中, 稻米中 Cd的浓度比秀
水 11 高 10.38 倍[34]。这里定义稻米中 Cd 浓度高的
水稻品种为 Cd 高积累水稻品种, 稻米中 Cd 浓度低
的水稻品种为 Cd低积累水稻品种。秸秆中 Cd的浓
度和稻米中 Cd 的浓度具有极显著的相关性[34]。两
品种的 Cd积累模式不同, 在苗期秀水 11叶片中 Cd
含量高于秀水110 [35], 而在成熟期秀水 11叶片中Cd
含量低于秀水 110 [34]。
选取成熟饱满的水稻种子, 用 5%的次氯酸钠溶
液消毒 15 min, 无菌水漂洗数次, 37℃黑暗培养箱中
催芽 2 d 至种子露白。将露白的种子播于泡沫网纱
浮板上 , 于在 13 h/11 h (白天 /黑夜 )光周期、
28 /22 (℃ ℃ 白天/黑夜)温周期和 70%相对湿度可控培
养箱中培养。用 1/2培养液培养 2周, 将水稻幼苗移
至含 3 L全培养液的直径为 15 cm的塑料桶中。每
桶种 16 穴, 每穴 1 株, 用塑料板分隔各穴。用海绵
固定水稻苗, 使其垂直生长。每周换 1次培养液, 调
节 pH值至 5.4~5.5之间。
第 4期 黄志熊等: 两个水稻品种镉积累相关基因表达及其分子调控机制 583


1.2 Cd处理
在培养箱中培养 30 d 之后, 用 10 μmol L–1
CdCl2处理 60 d 测定水稻体内 Cd 积累情况。在培
养箱中培养 30 d后, 用 5 μmol L–1 CdCl2处理直到
营养生长期(Cd 处理后 1 d)、抽穗前期(Cd 处理后
35 d)、抽穗期(Cd处理后 60 d)、成熟期(Cd处理后
105 d)和完全成熟期(Cd 处理后 130 d)分析水稻叶
片中基因表达、siRNA 和 DNA 甲基化。设置对照
组, 除不加 CdCl2外, 其他实验条件与 Cd处理组完
全一致。
1.3 Cd含量测定
取叶片在 105℃杀青 2 h, 在 75℃烘 72 h。用
6 mL硝酸和 2 mL氢氟酸消解 400 mg叶片干样品。
用石墨炉原子吸收光谱仪(GF-AAS: SperctrAA7000
Shimadzu Inc., Japan)测定样品中 Cd的含量。
1.4 基因表达分析
用 TRIzol (Invitrogen, USA)试剂提取营养生长
期、抽穗前期、抽穗期、成熟期和完全成熟期水稻
倒二叶和倒三叶总 RNA。用 DNase I (TaKaRa, Japan)
去除 DNA。参照 Ding等[36]的方法合成 cDNA, 使用
oligo(dT)引物和 PremixScript (TaKaRa, Japan)逆转录
试剂盒进行逆转录, 然后用 SYBR Premix Ex Taq
(TaKaRa, Japan)在 Rotor gene Q (Qiagen, Shanghai,
China) qRT-PCR 仪检测系统检测, 最后以 OsUBQ5
为对照进行标准化定量。PCR条件为 95 1 min℃ 变
性, 然后 95 10 s℃ 、58 15 s℃ 、72 30 s℃ 进行 45个
循环。用 Pfaffl 法[37]计算相对表达丰度。所有试验
重复 3次以上。引物序列见表 1。

表 1 qRT-PCR所用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in qRT-PCR
基因
Gene
正向引物序列
Forward primer sequence (5–3)
反向引物序列
Reverse primer sequence (5–3)
位点 a
Locus a
OsUBQ5 GAAGGAGGAGGAAATCGAAC CTTCACAGAGGTGATGCTAAGG LOC_Os01g22490.1
OsPCR1 AACTGCGTCTACTCCTGCTTCT CCATCCGAGGTTCATGTCGAAG LOC_Os02g36940.1
OsLCT1 GAGTTCTTCGTCAGAGCTAC CAGTGCTGGATGACGAATTG LOC_Os06g38120.1
OsLCD CAAGGCCTCATGACTTGGTGT ACTTCTGCGAGTGTGAGCAA LOC_Os01g72670.1
OsPCR6 CCCGACGCGTATAACAAGTACAG ACGCATGTGATGAGACAGTTTCC LOC_Os02g52550.1
OsPCR9 AGATGCACCGTGAGCTCAAGAAC TGAGGGAGTTGTCATTCCTTCCA LOC_Os10g02300.1
OsMT1 ACACAGTGAGTTGCAGAGATGA TCCTGATCCTCCTTCCTCTTGTC LOC_Os11g47809.1
OsPCs ACACAGTGAGTTGCAGAGATGA CTCTCTTCTCGGCGTCAACTATG LOC_Os06g01260.1
OsDCT1 GCTAATCGAGATCAACCACACCA CTCTCTTCTCGGCGTCAACTATG LOC_Os03g45370.1
a位点来自 RGAP水稻基因组注释计划数据库(Rice Genome Annotation Project, RGAP: http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)。
a From Rice Genome Annotation Project (RGAP: http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml).

1.5 siRNA的分析
RNA 提取和 DNA 去除方法同1.4。设计针对
siRNA具有茎环结构的 RT引物(5′-GTCGTATCCAG
TGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATA
CGACCCTGCA-3′)[36]。该引物末端的6个碱基和
siRNA 的配对, 其余碱基形成颈环结构。颈环引物
和 siRNA杂交, 用 PremixScript (TaKaRa, Japan)逆转
录酶进行逆转录。专一的 siRNA前引物和后引物加
入到 PCR 反应管, 然后用 SYBR Premix Ex Taq
(TaKaRa, Japan)在 Rotor gene Q (Qiagen, Shanghai,
China) qRT-PCR 仪检测系统检测, 最后以 U6核小
RNA为对照进行标准化定量。PCR条件为 95 1 min℃
变性, 然后95 10 s℃ 、58 15 s℃ 、72 15 s℃ 进行45
个循环。用于 U6核小 RNA 逆转录的颈环引物为
5′-ATTTGGACCATTTCTCGATTTGT-3′。用于扩增
siRNA 的前引物是 5-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3,
后引物是5-AAAGCGGTCCCAGTACGGCCTGCA-3;
用于扩增 U6 snRNA 的前引物是5-CGATAAAAT
TGGAACGATACAGA-3, 后引物是 5-ATTTGGAC
CATTTCTCGATTTGT-3。用 Pfaffl法[37]计算相对表
达丰度。所有试验重复3次以上。
1.6 甲基化水平分析
采用 CTAB 法提取 1.4 中所描述叶片的基因组
DNA[38]。用 RNase A去除 RNA。参照 Teixeira等的
方法[39]检测 DNA甲基化水平。使用 McrBC酶(New
England Biolab)过夜(16 h)酶切基因组 DNA (1 μg),
该酶切割发生甲基化修饰的 DNA 形成 DNA 碎片,
然后在 65℃灭活 20 min。qRT-PCR使用相同量(5 ng)
584 作 物 学 报 第 40卷


经酶切和未经酶切的基因组 DNA, 然后用 SYBR
Premix Ex Taq (TaKaRa, Japan)在 Rotor gene Q
(Qiagen, Shanghai, China) qRT-PCR仪检测系统检测,
最后以未经酶切的基因组 DNA 为对照进行标准化
定量。PCR条件为 95 1 min℃ 变性, 然后 95 10 s℃ 、
58 15 s℃ 、72 30 s℃ 进行 45 个循环。用于扩增
OsPCR1 基因外显子 2 区域的专一性前引物是
5-GCTGCAACTGCGTCTACTCCTGCTT-3, 后引物
是 5-CGTGCCATCCGAGGTTCATGTCGAA-3。结
果以相对未甲基化 DNA 水平表示 , 用 Pfaffl 法计
算 [37]。所有试验重复 3次以上。
1.7 数据分析
数据以平均值±标准误表示, 3~8个独立重复试
验, 采用配对 t检验检测显著性水平。P<0.05表示差
异显著, P<0.01表示差异非常显著, P<0.001表示差
异极其显著。
2 结果与分析
2.1 Cd处理条件下秀水 110和秀水 11叶片中Cd
积累相关基因表达水平的差异
秀水 110叶片中 Cd的含量为 30.9±0.8 mg kg–1,
而秀水 11叶片中 Cd的含量为 23.5±0.3 mg kg–1 (P<
0.001, t检验)。为研究水稻体内 Cd积累的分子调控机
制, 采用 qRT-PCR 方法对编码 Cd 转运子和 Cd2+螯
合蛋白的基因进行了表达检测。根据水稻发育的形
态学特征, 可将它们人为划分 5个阶段, 即营养生长期
(0~31 d)、抽穗前期(32~65 d)、抽穗期(66~90 d)、成熟
期(91~135 d)和完全成熟期(136~160 d)。由表 2、表 3
和图 1 可见, 在 Cd 处理条件下, OsMT1、OsDCT1、
OsLCD、OsPCs、OsPCR6、OsPCR9 和 OsLCT1 基因
表达水平的差异不显著(P>0.05), 而OsPCR1基因表达
水平的差异显著(P<0.05)。说明, OsPCR1基因可能参
与水稻体内 Cd积累的调控。

表 2 5 μmol L–1 CdCl2处理 24 h后, 秀水 110和秀水 11叶片中 Cd积累相关基因的表达水平(营养生长期)(平均值±SE)
Table 2 Expression level of Cd-accumulation-associated genes in leaves of Xiushui 110 and Xiushui 11 after 24 h of
5 μmol L–1 CdCl2 treatment (vegetative stage) (mean ± SE)
位点
Locus
秀水 110
Xiushui 110
秀水 11
Xiushui 11
位点
Locus
秀水 110
Xiushui 110
秀水 11
Xiushui 11
OsPCR1 0.81±0.12 1.71±0.08*** OsLCT1 1.49±0.30 1.05±0.11
OsPCR6 1.12±0.30 1.19±0.24 OsDCT1 1.30±0.44 1.00±0.16
OsPCR9 0.50±0.27 0.61±0.14 OsPCs 1.45±0.25 1.47±0.25
OsLCD 1.37±0.50 0.90±0.03 OsMT1 0.98±0.17 0.58±0.06
***表示秀水 110和秀水 11之间具有极显著的差异(P<0.001, t检验); 数据以 OsUBQ5为内参进行标准化定量, 以各自秀水 110的
样本为参照, n = 3~8。
*** represents a significant difference between Xiushui11 and Xiushui110 (P<0.001, t-test); The data were normalized with OsUBQ5 as
reference and relative to the Xiushui110 samples respectively, n = 3 to n = 8.


表 3 5 μmol L–1 CdCl2处理 60 d后秀水 110和秀水 11叶片中
Cd积累相关基因的表达水平(抽穗期)(平均值±SE)
Table 3 Expression level of Cd-accumulation-associated genes
in leaves of Xiushui 110 and Xiushui 11 after 60 days of 5 μmol
L–1 CdCl2 treatment (pre-heading stage) (mean ± SE)
位点
Locus
秀水 110
Xiushui 110
秀水 11
Xiushui 11
OsPCR1 1.60±0.23 0.75±0.09**
OsLCT1 2.45±1.14 0.49±0.04
OsDCT1 1.52±0.62 0.54±0.08
**表示秀水 110和秀水 11之间具有显著的差异(P<0.01, t检
验)。数据以 OsUBQ5 为内参进行标准化定量, 以各自秀水 110
的样本为参照, n = 3~8。
** represents a significant difference between Xiushui 11 and
Xiushui 110 (P<0.01, t-test). The data were normalized with OsUBQ5
as reference and relative to the Xiushui 110 samples respectively, n = 3
to n = 8.

2.2 水稻叶片中与 OsPCR1基因外显子 2匹配的
siRNA对 OsPCR1基因表达的调控作用
为研究 OsPCR1基因表达调控的分子调控机制,
通过RGAP和谷类小 RNA数据库(Cereal Small RNA
Database, CSRDB)[40] 分 析 发 现 , smRNA92891
(siRNA: 5-GCGGTCCCAGTACGGCCTGCAGG-3)
在 OsPCR1基因的外显子 2对应的 mRNA存在潜在
靶向位点。由图 1和图 2可见, 在 Cd处理条件下, 营
养生长期、抽穗前期和完全成熟期水稻叶片中 ,
siRNA 的表达水平与各自相对应时期 OsPCR1 基因
的表达水平呈负相关 (siRNA 的低水平表达对应
OsPCR1 基因的高水平表达)。并且由图 3 可见, 在
Cd处理条件下, 秀水 110叶片中, OsPCR1基因表达
水平的时间变化曲线和该 siRNA表达水平的时间变
第 4期 黄志熊等: 两个水稻品种镉积累相关基因表达及其分子调控机制 585



图 1 不同生长发育期的秀水 110和秀水 11叶片中 OsPCR1基因的表达水平
Fig. 1 OsPCR1 expression in leaves of Xiushui 110 and Xiushui 11 at five developmental stages of rice
提取(A)营养生长期(5 μmol L–1 Cd处理 1 d)、(B)抽穗前期(5 μmol L–1 Cd处理 35 d)、(C)抽穗期(5 μmol L–1 Cd处理 60 d)、(D)成熟期
(5 μmol L–1 Cd处理 105 d)和(E)完全成熟期(5 μmol L–1 Cd处理 130 d)水稻品种倒数第 2叶和第 3叶总 RNA, 没有 Cd处理的样本为对
照组。利用 qRT-PCR检测 OsPCR1基因表达水平。数据以 OsUBQ5为内参进行标准化定量, 以各自秀水 110的样本为参照, 以平均
值±标准误表示(mean ± SE) (n = 3~8)。星号表示秀水 110和秀水 11之间具有显著差异(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; t检验)。
Cd+: 5 μmol L–1 CdCl2处理; Cd−: 对照。
RNA was isolated from the penultimate and antepenultimate leaves of the two cultivars at different development stages, including (A) vege-
tative stage, (B) pre-heading stage, (C) heading stage, (D) maturity stage, and (E) full-ripe stage. Cultivars at these stages were treated with 5
μmol L–1 CdCl2 for 1 d, 35 d, 60 d, 105 d, and 130 d, respectively, and cultivars without CdCl2 treatment were used as control. OsPCR1 ex-
pression was determined by qRT-PCR. Relative OsPCR1 mRNA expression was normalized with OsUBQ5 as reference and relative to the
Xiushui 110 samples, respectively. The data are presented as mean ± SE (n = 3 to n = 8). Asterisks represent a significant difference between
Xiushui 11 and Xiushui 110 (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; t-test). Cd+: with 5 μmol L–1 CdCl2 treatment; Cd–: control.

化曲线是完全相反的(OsPCR1 基因表达水平的上升
和该 siRNA 表达水平的下降同时发生)。图 3 提示,
在 Cd处理条件下的秀水 11中, OsPCR1基因表达水
平的时间变化曲线和该 siRNA表达水平的时间变化
曲线虽然不是完全相反的, 但是呈现出互补性。表
明该 siRNA可能参与调控 OsPCR1基因的表达。
在对照条件下 , 除了抽穗期 , 水稻叶片中该
siRNA 的表达水平和 OsPCR1 基因的表达水平没有
呈现出负相关性之外 , 其他时期均呈现出负相关
性。并且由图 3 可见, 对照条件下的两个水稻品种
叶片中, OsPCR1基因和该 siRNA表达水平的时间变
化曲线也呈现出互补性。由于 siRNA 的积累和
mRNA 的降解都是量变的过程, 所以对照条件下的
抽穗期 siRNA和 OsPCR1 mRNA没有呈现出负相关
性可能是由于该 siRNA 积累速率较慢(图 1-C、图
2-C、图 3-C和 D)。Cd处理条件下的抽穗期和成熟
期 siRNA和 OsPCR1 mRNA没有呈现出负相关性可
能是由于转录水平的调控(比如 DNA甲基化)(图 1-C,
D和图 2-C, D)。在 Cd处理条件下, 由于两个水稻品
种中 siRNA 的水平在这两个时期无显著的差异(图
2-C, D), 所以 siRNA在转录后水平对 OsPCR1的调
控不明显, 而转录水平的调控(比如 DNA 甲基化)对
586 作 物 学 报 第 40卷



图 2 不同生长发育期的秀水 110和秀水 11叶片中 siRNA基因的表达水平
Fig. 2 siRNA expression in leaves of Xiushui 110 and Xiushui 11 at five developmental stages of rice
利用 qRT-PCR技术检测水稻品种倒数第 2叶和第 3叶总 siRNA表达水平。数据以 U6核小 RNA为内参进行标准化定量, 以各自秀水
110的样本为参照(定义为 1), 以平均值±标准误表示(mean ± SE) (n = 3~4)。A~E对应时期, 标注及缩写同图 1。
qRT-PCR was performed to detect the expression of the siRNA in the penultimate and antepenultimate leaves of the two cultivars. Relative
expression of siRNA in the leaves of Xiushui 11 was normalized to that in the leaves of Xiushui 110, which is defined as 1. U6 small nuclear
RNA was used for normalization. The data are presented as mean ± SE. (n = 3 and n = 4). The stages in individual figure, symbols and
abbreviation are the same as those given in Fig. 1.

基因的表达调控影响更大。表明该 siRNA的积累很
可能在转录后降解了 OsPCR1基因 mRNA从而参与
调控 OsPCR1基因的表达。
2.3 水稻叶片中 OsPCR1基因外显子 2甲基化对
OsPCR1基因表达的调控作用
为检测水稻中 OsPCR1 基因表达的差异是否由
于 DNA 甲基化的调节, 分析了秀水 110 和秀水 11
叶片中 OsPCR1 基因外显子 2 甲基化水平在水稻 5
个不同生长发育期中的变化情况。由图 1 和图 4 可
见, 在 Cd处理条件下, DNA甲基化水平与各自相对
应时期水稻叶片中 OsPCR1 基因的表达水平呈负相
关(DNA 的高水平甲基化对应 OsPCR1 基因的低水
平表达)。并且由图 3-A 和 B 可见, 在 Cd 处理条件
下, 秀水 11和秀水 110叶片中, DNA甲基化水平的
时间变化曲线和 OsPCR1 基因表达水平的时间变化
曲线基本呈现出互补性。表明甲基化可能参与调控
OsPCR1基因的表达。
而在对照条件下, 不同生长发育期水稻叶片中
OsPCR1基因外显子 2甲基化水平(图 4)与各自相对
应时期的OsPCR1基因的表达水平(图 1)没有负相关
性。且对照条件下水稻叶片中, DNA 甲基化水平的
时间变化曲线和 OsPCR1 基因表达水平的时间变化
曲线没有互补性(图 3)。由于 siRNA 对基因的表达
调控发生在转录后水平, 而DNA甲基化对基因表达
的调控发生在转录水平; 并且在对照条件下, 各生
长时期 2个水稻品种间该 siRNA的量存在显著差异
(图 2-A, B, C, E)。所以这可能是由于 siRNA 对
OsPCR1 基因在转录后水平表达的调控掩盖了 DNA
甲基化对 OsPCR1 基因在转录水平表达的调控。由
图 3-A 可见, 当该 siRNA 丰度降低到低水平时,
DNA 甲基化的程度逐渐缓和并且不再发生大的变
化。而由图 3-A、B和 C可见, 当该 siRNA积累时,
第 4期 黄志熊等: 两个水稻品种镉积累相关基因表达及其分子调控机制 587



图 3 不同生长发育期的秀水 110和秀水 11叶片中 OsPCR1基因、siRNA的表达水平和 DNA甲基化水平
Fig. 3 OsPCR1 expression level, siRNA expression level, and OsPCR1 exon 2 methylation level in leaves of (A) Xiushui 110 and (B)
Xiushui 11 at five developmental stages of rice
提取 5个不同生长发育期秀水 110和秀水 11倒数第 2和第 3叶基因组 DNA和总 RNA。利用 McrBC-qRT-PCR检测 OsPCR1外显子 2
甲基化水平, qRT-PCR检测 OsPCR1基因表达水平和 siRNA表达水平。相对 OsPCR1外显子 2甲基化水平的数据校准到等量未经酶切
的基因组 DNA。OsPCR1基因的表达水平校准到 OsUBQ5。siRNA的表达水平校准到 U6小核仁 RNA。所有数据以各自营养生长期
的样本为参照, 以平均值±标准误表示(mean ± SE) (n=3~8)。OsPCR1: OsPCR1相对表达水平; siRNA: siRNA相对表达水平; Unme:
OsPCR1外显子 2相对未甲基化水平。标注及缩写同图 1。
Genomic DNA and total RNA were isolated from leaves previously described in Fig. 1 legend. OsPCR1 exon 2 methylation, OsPCR1 and
siRNA expressions were determined by the methods of McrBC-qRT-PCR and qRT-PCR, respectively. Relative unmethylated OsPCR1 exon 2
level, OsPCR1 mRNA and siRNA expressions were normalized to equal amounts of undigested DNA samples, OsUBQ5 and U6 small nuclear
RNA, respectively and relative to the vegetative samples. The data are presented as mean ± SE (n = 3 to n = 8). OsPCR1: relative OsPCR1
expression level; siRNA: relative siRNA level; Unme: relative unmethylated OsPCR1 exon 2 level. Symbols and abbreviation are the same as
those given in Fig. 1.
588 作 物 学 报 第 40卷



图 4 不同生长发育期的秀水 110和秀水 11叶片中 OsPCR1基因外显子 2甲基化水平
Fig. 4 OsPCR1 exon 2 methylation in leaves of Xiushui 110 and Xiushui 11 at five developmental stages of rice
提取 5个不同生长发育期秀水 110和秀水 11倒数第 2和第 3叶基因组 DNA。利用特异性的引物和 McrBC-qRT-PCR技术检测 OsPCR1
基因外显子 2甲基化水平。数据校准到等量未经酶切的 DNA样本, 以各自秀水 110的样本为参照(定义为 1), 以平均值±标准误表示
(mean ± SE) (n = 3~4)。A~E对应时期, 标注及缩写同图 1。
Genomic DNA was isolated from leaves described in Fig. 1 legend. OsPCR1 exon 2 methylation was determined by the methods of
McrBC-qRT-PCR with specific primers. The data were normalized to equal amount of undigested DNA samples and relative to Xiushui 110
samples, respectively. The data are presented as means ± SE (n = 3 and n = 4). The stages in individual figure, symbols and abbreviation are
the same as those given in Fig. 1.

DNA甲基化的程度会发生大的变化。说明 siRNA的
积累和 DNA 甲基化的动态变化是同时发生的。该
siRNA 的积累可能直接或间接地影响 OsPCR1 基因
外显子 2区域的 DNA甲基化水平; OsPCR1基因外
显子 2 甲基化和该 siRNA 可能同时参与调控
OsPCR1基因的表达。
3 讨论
许多 Cd积累相关基因参与调节植物体内 Cd的
转移和积累 [5-9]。本文研究表明 , 2个水稻品种中
OsMT1、OsDCT1、OsLCD、OsPCs、OsPCR6、OsPCR9
和 OsLCT1基因表达水平的差异不显著。暗示报道过
的 OsMT1、OsDCT1、OsLCD、OsPCs和 OsLCT1基
因可能没有直接导致秀水11和秀水110叶片中 Cd 积
累的差异。
PCR蛋白参与拟南芥体内 Cd从地下部到地上部
的运输[9,12]。水稻中 PCR 家族成员的功能尚不明确,
研究表明, 两个水稻品种间 OsPCR1基因表达水平差
异显著, 而 OsPCR6和 OsPCR9基因的表达水平差异
不显著。进一步的研究表明, 处于不同生长发育期的
2个水稻品种叶片中, OsPCR1 基因的表达水平始终呈
现出显著的差异。提示 PCR 基因家族成员 OsPCR6
和 OsPCR9与水稻叶片中 Cd积累的差异可能没有直
接关系。而 OsPCR1基因的表达差异可能与水稻叶片
中 Cd积累的差异相关。这为以后研究该基因在水稻
体内 Cd积累过程中的功能提供了理论依据。
植物体内的 siRNAs 参与发育过程和逆境胁迫
反映[13-17]。siRNAs通过与靶基因的特异性结合而达
到降解靶基因 mRNA的作用[18]。本实验表明, 各生
长发育期水稻叶片中 siRNA 的表达水平和 OsPCR1
第 4期 黄志熊等: 两个水稻品种镉积累相关基因表达及其分子调控机制 589


基因表达水平此消彼长。提示该 siRNA可能与 AGO
蛋白结合参与形成 RISC沉默复合体, 剪切 OsPCR1
基因的 mRNA, 从而在转录后水平上沉默 OsPCR1
基因的表达。说明 siRNA 在水稻体内 Cd 积累的过
程中发挥重要作用。
DNA 甲基化是一种表观遗传修饰标记, 在植物
的生长发育和逆境胁迫响应以及转座子的沉默和基
因的表达调控中都有重要作用[21-27]。在基因启动子
区域的 DNA 甲基化抑制基因的表达[41], 而基因编
码区域 DNA甲基化修饰的功能尚不明确[29,32,42]。为
此, 我们分析了水稻叶片中 OsPCR1 基因外显子 2
甲基化水平在各生长发育期的变化情况, 及DNA甲
基化水平和 OsPCR1 基因表达水平的相关性。结果
表明, 在 Cd 胁迫下, 水稻叶片中 OsPCR1 外显子 2
甲基化水平与 OsPCR1 基因的表达水平此消彼长。
提示OsPCR1外显子 2甲基化可能参与调控OsPCR1
基因的表达。基因编码区域 DNA甲基化修饰和基因
转录的延伸有关[43-45]。与此模型一致, 研究结果暗
示OsPCR1基因编码区域DNA甲基化修饰可能参与
调控 OsPCR1 基因转录的延伸。本试验表明在 Cd
胁迫和对照条件下的生长发育过程中, 水稻叶片中
OsPCR1基因外显子 2甲基化水平均出现动态变化。
而动态的基因外显子区域 DNA 甲基化可通过影响
基因转录物的选择性剪接来调控基因的表达[46-47]。
本研究结果同样表明 OsPCR1 外显子甲基化修饰也
可能通过参与转录产物的剪切来调控 OsPCR1 基因
的表达。说明在水稻体内 Cd积累过程中, DNA甲基
化修饰发挥重要作用。
4 结论
在 Cd 高积累和 Cd 低积累水稻品种叶片中 Cd
积累相关基因的表达水平差异不显著, 但 OsPCR1
基因表达水平呈现显著差异。说明 OsPCR1 基因可
能参与调控水稻体内 Cd的积累。这为后续研究该基
因的功能提供了理论依据。水稻叶片中与 OsPCR1
基因外显子区域匹配的 siRNA的丰度和 OsPCR1基
因的表达水平负相关, 且在Cd处理条件下的水稻叶
片中OsPCR1基因外显子区域DNA甲基化水平和该
基因的表达水平负相关。说明在水稻体内 Cd积累过
程中, 该 siRNA和 OsPCR1基因外显子区域 DNA甲
基化可能参与 OsPCR1基因表达的调控。
References
[1] Uraguchi S, Kamiya T, Sakamoto T, Kssai K, Sato Y, Nagamura
Y, Yoshida A, Kyozuka J, Ishikawa S, Fujiwara T. Low-affinity
cation transporter (OsLCT1) regulates cadmium transport into
rice grains. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108: 20959–20964
[2] Ueno D, Koyama E, Yamaji N, Ma J F. Physiological, genetic,
and molecular characterization of a high-Cd-accumulating rice
cultivars, Jarjan. J Exp Bot, 2011, 62: 2262–2272
[3] Uraguchi S, Mori S, Kuramata M, Kawasaki A, Arao T, Ishikawa
S. Root-to-shoot Cd translocation via the xylem is the major
process determining shoot and grain cadmium accumulation in
rice. J Exp Bot, 2009, 60: 2677–2688
[4] Takahashi R, Ishimaru Y, Senoura T, Shimo H, Ishikawa S, Arao
T, Nakanishi H, Nishizawa N K. The OsNRAMP1 iron trans-
porter is involved in Cd accumulation in rice. J Exp Bot, 2011, 62:
4843–4850
[5] Kuramata M, Masuya S, Takahashi Y, Kitagawa E, Inoue C,
Ishikawa S, Youssefian S, Kusano T. Novel cysteine-rich peptides
from Digitaria ciliaris and Oryza sativa enhance tolerance to
cadmium by limiting its cellular accumulation. Plant Cell Physiol,
2009, 50: 106–117
[6] Shen G M, Zhu C, Du Q Z. Genome-wide identification of
PHYTOCHELATIN and PHYTOCH_SYNTH domain-contain-
ing phytochelatin family from rice. Electronic J Biol, 2010,
6:73–79
[7] Shimo H, Ishimaru Y, An G, Yamakawa T, Nakanishi H, Nishi-
zawa N K. Low cadmium (LCD), a novel gene related to cad-
mium tolerance and accumulation in rice. J Exp Bot, 2011, 62:
5727–5734
[8] Song W Y, Choi K S, Alexis D A, Martinoia E, Lee Y. Brassica
juncea plant cadmium resistance 1 protein (BjPCR1) facilitates
the radial transport of calcium in the root. Proc Natl Acad Sci
USA, 2010, 108: 19808–19813
[9] Song W Y, Choi K S, Kim D Y, Geisler M, Park J, Vincenzetti V,
Schellenberg M, Kim S H, Lim Y P, Noh E W, Lee Y, Martinoia
E. Arabidopsis PCR2 is a zinc exporter involved in both zinc ex-
trusion and long-distance zinc transport. Plant Cell, 2010, 22:
2237–2252
[10] Cobbett C, Goldsbrough P. Phytochelatins and metallothioneins:
roles in heavy metal detoxification and homeostasis. Annu Rev
Plant Biol, 2002, 53: 159–182
[11] Song W Y, Hörtensteiner S, Tomioka R, Lee Y, Martinoia E.
Common functions or only phylogenetically related? The large
family of PLAC8 motif-containing/PCR genes. Mol Cells, 2011,
31: 1–7
[12] Song W Y, Martinoia E, Lee J, Kim D, Kim D Y, Vogt E, Shim D,
Choi K S, Hwang I, Lee Y. A novel family of cys-rich membrane
proteins mediates cadmium resistance in Arabidopsis. Plant
Physiol, 2004, 135: 1027–1039
[13] Borsani O, Zhu J, Verslues P E, Sunkar R, Zhu J K. Endogenous
siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts
regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell, 2005, 123:
1279–1291
[14] Carthew R W, Sontheimer E J. Origins and mechanisms of
miRNA and siRNAs. Cell, 2009, 136: 642–655
[15] Moldovan D, Spriggs A, Yang J, Pogson B J, Dennis E S, Wilson
I W. Hypoxia-responsive microRNAs and trans-acting small in-
terfering RNAs in Arabidopsis. J Exp Bot, 2010, 61: 165–177
[16] Yan Y, Zhang Y, Sun Z, Fu Y, Chen X, Fang R. Small RNAs from
MITE-derived stem-loop precursors regulate abscisic acid sig-
590 作 物 学 报 第 40卷


naling and abiotic stress responses in rice. Plant J, 2011, 65:
820–828
[17] Yao Y, Ni Z, Peng H, Sun F, Xin M, Sunkar R, Zhu J K, Sun Q.
Non-coding small RNAs responsive to abiotic stress in wheat
(Triticum aestivum L.). Funct Integr Genomic, 2010, 10: 187–190
[18] Kim V N, Han J, Siomi M C. Biogenesis of small RNAs in ani-
mals. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10: 126–139
[19] Hannon G J. RNA interference. Nature, 2002, 418: 244–251
[20] Song J J, Smith S K, Hannon G J, Joshua-Tor L. Crystal structure
of Argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science,
2004, 305: 1434–1437
[21] Law J A, Jacobsen S E. Establishing, maintaining and modifying
DNA methylation patterns in plants and animals. Nat Rev Genet,
2010, 11: 204–220
[22] Chan S W L, Henderson I R, Jacobsen S E. Gardening the ge-
nome: DNA methylation in Arabidopsis thaliana. Nat Rev Genet,
2005, 6: 351–360
[23] Boyko A, Blevins T, Yao Y, Golubov A, Bilichak A, Ilnytskyy Y,
Hollander J. Transgenerational adaptation of Arabidopsis to stress
requires DNA methylation and the function of dicer-like proteins.
PLoS One, 2010, 5: e9514
[24] Choi C S, Sano H. Abiotic-stress induces demethylation and
transcriptional activation of a gene encoding a glycerophos-
phodiesterase-like protein in tobacco plants. Mol Genet Genomics,
2007, 277: 589–600
[25] Greco M, Chiappetta A, Bruno L, Bitonti M B. In Posidonia
oceanica cadmium induces changes in DNA methylation and
chromatin patterning. J Exp Bot, 2012, 63: 695–709
[26] Verhoeven K J F, Jansen J J, Dijk P J, Biere A. Stress-induced
DNA methylation changes and their heritability in asexual dande-
lions. New Phytol, 2010, 185: 1108–1118
[27] Raj S, Brautigen K, Hamanishi E T, Wilkins O, Thomas B R,
Schroeder W, Mansfield S D, Plant A L, Campbell M M. Clone
history shapes populous drought response. Proc Natl Acad Sci
USA, 2011, 108: 12521–12526
[28] Ball M P, Li J B, Gao Y, Lee J H, LeProust E M, Park I H, Xie B,
Daley G Q, Church G M. Targeted and genome-scale strategies
reveal gene-body methylation signatures in human cells. Nat
Biotechnol, 2009, 27: 361–368
[29] Hellman A, Chess A. Gene Body-specific methylation on the ac-
tive X chromosome. Science, 2007, 315: 1141–1143
[30] Lister R, Pelizzola M, Dowen R H, Hawkins R D, Hon G,
Tonti-Filippini J, Nery J R, Lee L, Ye Z, Ngo Q M, Edsall L, An-
tosiewicz-Bourget J, Stewart R, Ruotti V, Millar A H, Thomson J
A, Ren B, Ecker J R. Human DNA methylomes at base resolution
show widespread epigenomic differences. Nature, 2009, 462:
315–322
[31] Kawanabe T, Fujimoto R, Sasaki T, Taylor J M, Dennis E S. A
comparison of transcriptome and epigenetic status between
closely related species in the genus Arabidopsis. Gene, 2012, 506:
301–309
[32] Zilberman D, Gehring M, Tran R K, Ballinger T, Henikoff S.
Genome-wide analysis of Arabidopsis thaliana DNA methylation
uncovers an interdependence between methylation and transcrip-
tion. Nat Genet, 2007, 39: 61–69
[33] Suzuki M M, Bird A. DNA methylation landscapes: provocative
insights from epigenomics. Nat Rev Genet, 2008, 9: 465–476
[34] He J, Zhu C, Ren Y, Yan Y, Jiang D. Genotypic variation in grain
cadmium concentration of lowland rice. J Plant Nutr Soil Sci,
2006, 169: 711–716
[35] 何俊瑜, 任艳芳, 朱诚, 蒋德安. 镉胁迫对不同水稻品种种子
萌发、幼苗生长和淀粉酶活性的影响. 中国水稻科学, 2008, 22:
399–404
He J Y, Ren Y F, Zhu C, Jiang D A. Effects of cadmium stress on
seed germination, seedling growth, and amylase activities in rice.
Chin J Rice Sci, 2008, 22: 399–404 (in Chinese with English ab-
stract)
[36] Ding Y, Chen Z, Zhu C. Microarray-based analysis of cad-
mium-responsive microRNAs in rice (Oryza sativa). J Exp Bot,
2011, 62: 3563–3573
[37] Pfaffl M W. A new mathematical model for relative quantification
in real-time RT-PCR. Nucl Acids Res, 2001, 29: e45
[38] Serra I A, Procaccini G, Intrieri M C, Migliaccio M, Mazzuca S,
Innocenti A M. Comparison of ISSR and SSR markers for analy-
sis of genetic diversity in the seagrass Posidonia oceanica. Ma-
rine Ecol Prog Ser, 2007, 338: 71–79
[39] Teixeira F K, Heredia F, Sarazin A, Roudier F, Boccara M, Ci-
audo C, Cruaud C, Poulain J, Berdasco M, Fraga M F, Voinnet O,
Wincker P, Esteller M, Colot V. A role for RNAi in the selective
correction of DNA methylation defects. Science, 2009, 323:
1600–1604
[40] Johnson C, Bowman L, Adai A T, Vance V, Sundaresan V.
CSRDB: a small RNA integrated database and browser resource
for cereals. Nucl Acids Res, 2007, 35: D829–D833
[41] Brandeis M, Ariel M, Cedar H. Dynamics of DNA methylation
during development. Bioessays, 1993, 15: 709–713
[42] 赵嵘, 胡丽玲, 孔繁强, 左爱军. PXR 基因外显子 3 甲基化与
肠癌细胞对 5 氟尿嘧啶的耐药性相关. 中国生物化学与分子
生物学报, 2013, 29: 63–69
Zhao R, Hu L L, Kong F Q, Zuo A J. Association between preg-
nane X receptor gene exon3 methylation with 5-fluorouracil re-
sistance of the colon cancer cells. Chin J Biochem Mol Biol, 2013,
29: 63–69 (in Chinese with English abstract)
[43] Hohn T, Corsten S, Rieke S, Muller M, Rothnie H. Methylation
of coding region alone inhibits gene expression in plant proto-
plasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 8334–8339
[44] Rountree M R, Selker E U. DNA methylation inhibits elongation
but not initiation of transcription in Neurospora crassa. Genes
Dev, 1997, 11: 2383–2395
[45] Xiao Z, Wang C, Mo D, Li J, Chen Y, Zhang Z, Cong P. Promoter
CpG methylation status in porcine Lyn is associated with its ex-
pression levels. Gene, 2012, 511: 73–78
[46] Foret S, Kucharski R, Pellegrini M, Feng S, Jacobsen S E, Rob-
inson G E, Maleszka R. DNA methylation dynamics, metabolic
fluxes, genesplicing, and alternative phenotypes in honey bees.
Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109: 4968–4973
[47] Shukla S, Kavak E, Gregory M, Imashimizu M, Shutinoski B,
Kashlev M, Oberdoerffer P, Sandberg R, Oberdoerffer S.
CTCF-promoted RNA polymerase II pausing links DNA methy-
lation to splicing. Nature, 2011, 479: 74–79