全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 381−389 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由山东省自然科学基金项目(ZR2009DM013)和山东省科技发展计划项目(2012GNC1101)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 单雷, E-mail: shlei1025@sina.com, Tel: 0531-83179435
Received(收稿日期): 2013-07-03; Accepted(接受日期): 2013-10-31; Published online(网络出版日期): 2014-01-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140116.1702.018.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00381
花生质体型酰基载体蛋白基因 5′侧翼调控序列的克隆与分析
单 雷 1,2,∗ 唐桂英 1 徐平丽 1 赵学彬 1,3 柳展基 1
1 山东省农业科学院生物技术研究中心 / 山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室, 山东济南 250100; 2 山东大学农学院, 山东济
南 250100; 3 山东师范大学生命科学学院, 山东济南 250014
摘 要: 采用染色体步移技术分别克隆 3 个花生质体型酰基载体蛋白(ACP)基因的 5′侧翼调控区序列, AhACP1、
AhACP4和 AhACP5基因 5′上游序列分别为 535、1400和 1180 bp; 利用 5′RACE方法确定了这 3个基因的转录起始
位点, 分别位于起始密码 ATG上游–71、–92和–71 bp处。利用生物信息学软件分析了花生 ACPs启动子区包含的主
要调控元件, 发现尽管花生 AhACP4和 AhACP5基因在根、茎、叶、花和不同发育期种子中的基本表达模式相似, 但
它们的启动子中包含各自特有的顺式元件 , AhACP4 启动子区包含根或芽顶端分生组织表达调控元件 WUS, 而
AhACP5启动子区则含有侧芽萌动和伸展所需的多个关键调控元件 E2FB、TELO BOX和 UP1, 推测它们的表达具有
组织和发育阶段特异性。在进化上, 花生 AhACP4与拟南芥 AtACP4可能为直系同源基因, 但它们的表达模式产生了
分歧, AhACP4为组成型表达, AtACP4主要在叶中表达; 与 AtACP4启动子相比, 花生 AhACP4启动子区中参与光调
控相关元件明显减少。
关键词: 质体型酰基载体蛋白; 启动子; 调控元件; 花生
Cloning and Analysis of 5′ Flanking Regions of Arachisis hypogaea L. Genes
Encoding Plastidial Acyl Carrier Protein
SHAN Lei1,2,*, TANG Gui-Ying1, XU Ping-Li1, ZHAO Xue-Bin1,3, and LIU Zhan-Ji1
1 Bio-Tech Research Centre, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Eco-
logy and Physiology, Jinan 250100, China; 2 College of Agriculture, Shandong University, Jinan 250100, China; 3 College of Life Science, Shandong
Normal University, Jinan 250014, China
Abstract: We cloned the 5′ flanking fragments of three peanut plastidial acyl carrier protein (ACP) genes AhACP1, AhACP4, and
AhACP5 by chromosome walking method, and the fragments sizes were 535, 1400, and 1180 bp, respectively. Using 5′ RACE (5′
Rapid Amplification of cDNA End), the transcription start sites of the three genes were localized on –71, –92, and –71 bp from the
translation initiation codon ATG, respectively. The crucial regulation elements in promoters of three peanut ACP genes and four
Arabidopsis ACP genes were further analyzed with softwares PLACE and PlantCARE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE;
http://bioinformatics.psb.ugebp.be/webtools/plantcare/html), showing that although AhACP4 and AhACP5 had similar expression
patterns in root, stem, leaf, flower and seed at different development stages, their promoter regions contained their specific
cis-elements. For instance, the promoter region of AhACP4 consisted of the regulation element WUS expressing in meristems of
root or shoot primordia while that of AhACP5 had several key regulation elements such as E2FB, TELO BOX, and UP1 required
in sprouting and expansion of axillary shoots, suggesting that their expression patterns may be various in different tissues and
development stages. This study also indicated that the expression profiles of orthologous genes peanut AhACP4 and Arabidopsis
AtACP4 diverged in evolution, and the AhACP4 gene expressed in a constitutive pattern while the AtACP4 expressed mainly in
leaf, and in comparison with the promoter region of AtACP4, that of AhACP4 contained fewer light regulation elements.
Keywords: Plastidial acyl carrier protein (ACP); Promoter; Regulation element; Peanut (Arachis hypogaea L.)
植物质体型酰基载体蛋白(acyl carrier protein, ACP)是一类小分子的酸性蛋白, 它作为辅因子在植
382 作 物 学 报 第 40卷


物脂肪酸合成途径的脂肪酸链延伸、还原及脱水过
程中起重要作用。通常植物体内含有多拷贝的质体
型 ACP基因, 编码不同的 ACP蛋白异构体。研究发
现, 部分基因为组成型表达, 执行看家基因的功能;
而其他基因具有组织器官或细胞类型特异性表达的
特性[1]。在拟南芥中, 至少含有 5 个质体型的 ACP,
ACP1在叶、根、种子中表达, 但在种子中的表达最
强; ACP2、ACP3为组成型表达; ACP4主要在叶中表
达; ACP5 推测为种子特异性表达, 但至今尚未被鉴
定[2]。其他植物如菠菜、大豆、油菜及萼距花中也
观察到多个异构体参与质体内脂肪酸合成[3-7]。尽管
ACP 在脂肪酸生物合成中的作用已较为明确, 但尚
不清楚植物体中为何需要多种异构体, 不同异构体
在功能上有哪些分工, 又是如何协同作用的。
启动子是基因的一个重要组成部分, 控制基因
表达(转录)的起始时间、空间和表达的程度。对其
表达模式的分析可以从一个侧面了解基因可能发
挥的功能。Baerson和 Lamppa[1]分析了拟南芥 ACP
A1 (AtACP2)基因的编码区上游 914 bp (包括 74 bp
5′ UTR区)调控区驱动的 GUS基因表达情况, 检测
发现转基因植株 GUS 活性为种子 > 根 > 幼叶 >
成熟叶 ; 且基因表达具一定的组织和细胞特异性 ,
如幼苗或成熟植株茎和根的顶端分生组织中表达
较强; 开花期胚珠、柱头表皮、花柱的引导组织和
维管束中均有表达; 不同发育期小孢子囊的绒毡层
中 GUS表达量较高[1]。进一步分析发现, 转录起始
位点上游–235 ~ –55区对基因在种子和根中的表达
具有较大影响, 这一区段缺失使根中表达降低 7倍,
同时这一区段也是花托、柱头、花粉绒毡层表达所
必需的 [8]。拟南芥不同 ACP 异构体基因 AtACP3
(Acl1.3)与 AtACP2 (Acl1.2)启动子分析发现, 这 2个
基因靠近转录起始位点上游 180 bp 区段同源性较
高, 而更上游的序列差异明显。它们在不同发育时
期各组织中的表达模式既有共同之处又有明显差
异[9]。
花生中目前已克隆了 AhACP1、AhACP4和
AhACP5 3个质体型 ACP 基因, RT-PCR 分析表明
AhACP1优先在种子中表达 , 其他组织中表达量较
低; AhACP4和 AhACP5为组成型表达, 在种子中表
达量略高于其他组织[10]。但尚未见对这些基因调控
区研究的报道。本研究克隆了这3个基因的5′侧翼调
控区序列, 用生物信息学的方法分析了调控区可能
存在的调控元件, 并与拟南芥同源基因的启动子序
列比较, 旨在为进一步分析启动子功能提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 花生(Arachis hypogaea L.)品种
鲁花 14 (LH14)由本实验室提供。以当年收获的花生
种子进行室内培苗, 12 d后, 取幼叶, 经液氮冷冻后
储存于–80℃冰箱以备提取 DNA。大田种植 LH14,
果针入土后 10 d开始取样, 每 10 d取一次直至种子
成熟。不同发育时期种子经液氮冷冻后 , 储存于
–80℃冰箱以备提取 RNA。
1.1.2 菌株及质粒 大肠杆菌(Escherichia coil)
DH5α由本实验室提供。pEASY-T3克隆载体为北京
全式金生物技术有限公司产品。
1.1.3 试剂 植物 DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶
DNA 回收试剂盒为北京天根生化科技有限公司产
品; DNase I、各种限制性内切酶由大连 TaKaRa生物
技术公司生产; BD GenomeWalker Universal Kit、BD
Advabpage 2 PCR Kit 和 GeneRacer Kit 分别为
Clontech公司和 Invitrogen公司产品; PCR扩增引物
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; DNA
序列测定由本单位测序中心完成。
1.2 ACPs基因 5′侧翼调控序列克隆
用植物 DNA 提取试剂盒提供的方法提取花生
幼叶的 DNA, 溶解于适量 TE (pH 8.0)缓冲液中。经
分光光度计定量和酶切、凝胶电泳检测, 分别取 2.5
μg DNA经 Dra I、EcoR V、Pvu II、Stu I内切酶酶
切、苯酚抽提纯化后, 溶解于 20 μL TE (pH 7.5)缓冲
液中。分别取 4 μL 酶切完全的 DNA, 按照 BD
GenomeWalker Universal Kit的要求连接上 Adaptor
(5-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGT
CGACGGCCCGGGCTGGT-3), 构建4个花生基因组
DNA 文库(LD、LE、LP、LS)。根据已获得的花生
ACPs基因的基因组序列, 分别设计 3个基因的 6个
3′端特异性引物 , 即 ACP1GSP1-2: 5-GCTTAACC
AGCTCAACATGACAACACT-3, ACP1GSP2-1: 5-G
ATTGAGATGGAGGTAGCTGTAAAGGA-3; ACP4G
SP1-1: 5-CACAGAGACTGCCCCAAATCTTGAACT
-3, ACP4GSP2-1: 5-TAAACAAGATGTATGTAGAA
CCTGGAG-3; ACP5GSP1-1: 5-AGAAAACGGCAG
CGAAATCAGTAACAG-3, ACP5GSP2-2: 5-GAGAT
GGAGTTTCCGGTAAGTGCATTT-3 (每个基因的 2
个特异引物为巢式 PCR引物)。分别以 4个基因组文
库为模板 , AP1 (5端接头引物 : 5-GTAATACGA
CTCACTATAGGGC-3)和GSP1为引物进行第 1轮扩
增, 扩增体系为 25 μL, 模板量为 1 μL, 扩增条件为
94 25 s, 72 3 min, 7℃ ℃ 个循环; 94 25 s, 65~67 ℃ ℃
第 3期 单 雷等: 花生质体型酰基载体蛋白基因 5′侧翼调控序列的克隆与分析 383


3 min, 32 个循环; 最后 67℃继续延伸 7 min。第 2
轮巢式 PCR模板为第 1轮 PCR适当稀释的产物 1 μL,
引物为 AP2 (5端巢式接头引物 : 5-ACTATAGG
GCACGCGTGGT-3)和 GSP2, 扩增体系和扩增条件
基本与第 1 轮 PCR 相同。1%琼脂糖电泳检测 PCR
结果。
挖取并回收第 2 轮 PCR 特异性扩增产物, 克隆
到 pEASY-T3载体中, 白色重组克隆经 EcoR I酶切
检测, 将片段大小符合要求的克隆用 ABI3730 测序
仪进行双向测序。
1.3 RNA提取和转录起始位点确定
用本实验室改进的 CTAB 法提取不同发育时期
种子的总 RNA[11], 经琼脂糖电泳检测 RNA 质量和
分光光度计定量后 , 等量混合储存于–80℃冰箱备
用。为防止RNA酶污染, 研钵、研锤、药匙均以 180℃
烘烤 6 h, 所用塑料制品用 0.1%的 DEPC水浸泡, 于
室温下过夜后, 高温灭菌处理。
用 Invitrogen公司 GeneRacer Kit提供的方法和
试剂, 取 5 μg混合好的 LH14种子总 RNA, 按照说
明书要求用碱性磷酸酶(CIP)将截断的 mRNA 或其
他非 mRNA5′端去磷酸化, 然后将抽提纯化并沉淀
的全长 mRNA 脱去帽子结构, 并连接上 RNA 接头
(GeneRacer RNA Oligo: 5-CGACUGGAGCACGAG
GACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3);
以此 RNA 为模板 , 用试剂盒提供的随机引物和
SurperScript III RT酶反转录合成 cDNA; 最终将合
成的 cDNA连接至载体 pCR4-TOPO中, 获得 LH14
不同发育时期种子全长 cDNA 文库。根据已获得的
花生 ACPs基因的 cDNA序列, 分别设计 3个基因的
3端特异性引物 , 引物序列为 ACP1TSS GSP1-1:
5-GAGGGCTTGGCGAGAGAGATGATT-3, ACP1TSS
GSP2-1 同 ACP1GSP2-1; ACP4TSS GSP1-1: 5-GA
GACTGCCCCAAATCTTGAACTAGC-3, ACP4TSS
GSP2-1: 5-CTGGAGGGTAGTCTTGCTACACAA-3;
ACP5TSSGSP1-1: 5-TTGATTCAGCTGAGAGAGG
AGAGG-3, ACP5TSSGSP2-1同 ACP5GSP2-2。以构
建的 cDNA文库为模板, 分别以各基因的GSP1引物
与 GeneRacer 5 Primer (5-CGACTGGAGCACGAG
GACACTGA-3)进行第 1 轮 PCR扩增, PCR体系参
照 BD Advabpage 2 PCR Kit要求, 扩增条件为 94 ℃
预变性 2 min; 94 30 s, 72 30 s, 5℃ ℃ 个循环; 94 30 ℃
s, 70 30℃ s, 5个循环; 94 30 s, 60~65 30 s,℃ ℃ 72 30 ℃
s, 20~25个循环; 最后 72℃继续延伸 7 min。第 1轮
PCR 产物经电泳检测后, 用适量缓冲液稀释, 用于
第 2轮巢式 PCR。取 1 μL第 1轮 PCR产物, 以各基
因 GSP2 引 物 和 GeneRacer 5 Nested Primer
(5-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3) 进
行第 2轮 PCR, 扩增条件为 94℃预变性 2 min; 94 ℃
30 s, 65 30 s, 68 30 s, 20~25℃ ℃ 个循环; 68℃继续延
伸 7 min。以 1.5%琼脂糖电泳检测 PCR结果。
挖取并回收第 2 轮 PCR 特异性扩增产物, 克隆
到 pEASY-T3载体中, 白色重组克隆经 EcoR I酶切
检测, 将片段大小符合要求的克隆用 ABI3730 测序
仪进行双向测序。
1.4 同源性分析和启动子序列分析
在 GenBank 数据库中查找拟南芥 ACPs 基因及
上游启动子序列, 应用 ClustalX V.1.83[12]和 MEGA
V.4[13]软件分析花生和拟南芥 ACPs的亲缘关系。应
用在线植物转录元件分析工具 PLACE (http://www.
dna.affrc.go.jp/PLACE/)、PlantCARE (http://bioinform
atics.psb.ugebp.be/webtools/plantcare/html/)分析花生
和拟南芥 ACP启动子序列。
2 结果与分析
2.1 花生 AhACPs基因 5′侧翼调控序列的克隆
利用构建的4个花生基因组文库 LD、LE、LP
和 LS, 以 ACPs基因特异引物为起点经2轮 PCR, 分
别获得特异性较好的扩增条带(图1)。回收特异性好、
片段较长的 PCR产物, 连接到 T载体 pEASY-T3中,
经测序证明获得的序列为 AhACP1、AhACP4和
AhACP5基因5′上游序列 , 其长度分别为535、1400
和1180 bp。
2.2 花生 AhACPs基因转录起始位点的确定
由于花生这3个质体型ACP基因都克隆自花生未
成熟种子 cDNA文库, 因此, 利用GeneRacer Kit重新
构建的花生未成熟种子全长 cDNA文库进行5′RACE,
分别克隆获得3个基因的特异性扩增片段(图2), 经测
序证明获得的序列为 AhACP1、AhACP4和 AhACP5
基因5′上游非编码区(5′UTR)序列, 去除5′引物序列
长度从 GSP2引物到可能的转录起始位点的长度分别
为103、170和116 bp, 转录起始位点分别位于这3个基
因起始密码 ATG上游–71、–92和–71 bp处。
2.3 花生 AhACPs基因启动子序列分析
应用 PLACE 软件对 AhACP1、AhACP4和
AhACP5基因5′上游调控区进行了分析。以往的研究
发现, AhACP1优先在种子中表达, 其他组织中表达
量较低; AhACP4和 AhACP5为组成型表达, 在种子
中表达量略高于其他组织[10]。也就是说, 这3个基因
在根、茎、叶、花和不同发育时期种子中的基本
384 作 物 学 报 第 40卷



图 1 花生 ACP基因 5′侧翼调控序列两轮 PCR扩增结果电泳检测
Fig. 1 PCR products of 5′ flanking regulation regions of peanut ACP genes
A, C, E: 第 1轮 PCR; B, D, F; 第 2轮 PCR。箭头所指条带为回收测序的 PCR产物。
A, C, E: products of the first round PCR; B, D, F: products of the second round PCR. The arrowheads showed the PCR fragments recycled for
sequencing.


图 2 5′ RACE确定 3个花生 ACP基因转录起始位点
Fig. 2 Localization of transcription start sites of three peanut
ACP genes by 5′ RACE

表达模式类似 , 但它们的启动子序列差异显著。
AhACP1和 AhACP4分别在转录起始位点上游–28 bp
和–24 bp处存在可能的 TATA框 TATATAAA、TTTTA,
而 AhACP5 基因可能的 TATA 框(TTATTT)位于–145
nt处。3个启动子序列中包含大量共有调控序列, 如
涉及光调控应答 GATA BOX、GT1 CONSENSUS、
IBOX CORE, 涉及干旱应答 CBF HV、MYC
CONSENSUS, 大多数储藏蛋白基因包含的 E BOX,
花粉特异性激活的调控元件 POLLEN1 LELAT52,
转录的抑制子 WRKY71OS、W BOX NTERF3等 21
种调控元件, 这些调控元件大多以多拷贝存在, 并
且散布在整个启动子中。3个启动子也各自包含一些
特异调控元件, 这些元件多以单拷贝或低拷贝形式
分布于远离核心启动子区(表 1), 如 AhACP4启动子
包含激素应答元件 ABRE AT CONSENSUS、S BOX
(脱落酸 ABA 应答), 光调控元件 LRE, 刺激素响应
元件 ELRE CORE, 以及特有的 WUS 和 XYLAT 元
件 ; AhACP5 启动子包含涉及调控胚胎晚期发育
ABA诱导表达的 DRE2 CORE元件、涉及正调控细
胞周期 G1至 S转换的元件 E2FB、以及根原基中激
活表达必需的 TELO BOX 元件和去除主茎上调表
达的大量基因中包含的 UP1 元件; AhACP1 因为克
隆获得的启动子序列较短, 仅预测到5个特有调控元件
(表 1)。尽管 AhACP4和 AhACP5的表达模式更加接
近, 但两者启动子共有的调控序列也很有限, 主要
包括种子中赤霉素应答所需的 CARE 元件、蔗糖和
激素应答元件 TATCCA、激素调控元件 REALPHA、
蔗糖抑制调控元件 SRE 涉及氧化磷酸化的 SITEII
元件。
2.4 花生和拟南芥质体型 ACPs基因的同源性分析
查询拟南芥已知的 5 个质体型 ACPs 的氨基酸
序列, 并分析它们与 3个花生质体型ACPs的亲缘关
第 3期 单 雷等: 花生质体型酰基载体蛋白基因 5′侧翼调控序列的克隆与分析 385


系, 结果表明, 拟南芥 AtACP4 与其他 4个拟南芥
ACPs基因在早期进化过程中就产生分歧, 致使该基
因与其他基因的同源性较低; 而它与花生 AhACP4
同源性较高, 它们在进化中可能为直系同源关系。
花生 3个 ACPs异构体中, AhACP1与 AhACP5亲缘
关系较近 , 它们序列相似性可达 75%, 而它们与
AhACP4 的序列一致性均为 55% (AhACP1 E 值为
2E–44, AhACP5 E值为 1E–42)。拟南芥 AtACP2和
AtACP3 同源性较高, 序列相似性为 94%; 它们与
AtACP1 和 AtACP5 处于不同的进化分支(图 3)。这
与 Li 等[10]对不同物种 ACP 同源异构体进化树分析
的结果基本一致。

图 3 花生和拟南芥不同 ACP异构体亲缘关系分析
Fig. 3 Phylogenetic relationships among different ACP
isoforms from peanut and Arabidopsis

2.5 拟南芥 AtACPs 基因 5′侧翼调控序列的获得
及序列分析
根据已知的拟南芥 AtACP1 (At3g05020.1)、
AtACP2 (At1g54580) 、 AtACP4 (At4g25050.1) 和
AtACP5 (At5g27200)的基因组序列在 NCBI网站查询起
始密码子 ATG 5′上游的序列, 获得上述 4 个基因的 5′
侧翼序列大小分别为 1249、1225、1173和 1000 bp。
应用 PLACE软件对拟南芥这 4个基因 5′上游调
控区分析发现, 这4个启动子序列中包含大量共有调
控序列, 其中 16种调控序列(表 2)也是花生 3个启动
子序列中共有的, 并且这些调控元件大多散布于启
动子区; 另预测到 10余种在 4个拟南芥 ACP基因启
动子中都存在但仅在部分花生 ACP基因启动子中存
在的调控序列, 如 G-box的耦合元件 CGACG, 种子
发育相关基因AGL15的结合位点CARGCW8GAT, 根
结 感 染 细 胞 中 激 活 表 达 的 启 动 子 含 有 的
Organ-Specific Elements (OSE)的一个保守基序
OSE1 ROOT NODULE, 涉及早期干旱应答 ABRE-
like序列 ABREL, 硫应答元件核心区 SURE CORE,
根毛特异性调控的顺式元件 RHERP 等, 这些调控
序列的拷贝数明显少于拟南芥和花生 ACP 启动子
共有调控序列的拷贝数, 有些甚至为单拷贝。拟南
芥这 4 个 ACP 启动子序列也包含各自特有的调控
序列 , AtACP1 启动子包含种子或胚乳特异性表达
的元件 PROXB、GCN4 motif和 LEAFY, 涉及旺盛
分裂的细胞或组织转录激活的调控元件 TE2F2 等;
AtACP2 启动子包含涉及激素调节的 MYB 转录因
子结合位点 CCA1、胚特异性表达调控的 DNA 结
合基序、果实中特异表达所需的增强子元件和参与
光信号调节的 SORLIP5 元件; AtACP4 启动子含有
光信号调控相关的 RBCS CONSENSUS、SORLIP4
和 SORLREP3, 涉及开花时间调控的 CARGAT
CONSENSUS元件等; AtACP5启动子包含调控基因
在萌发种子的子叶中高水平表达的 TGACGT motif、
涉及 JA诱导基因表达调控 T/G BOX、蔗糖应答元
件 SURE1和种子中具负调控作用的 S1F元件等(表
1)。这些基因特异性调控元件基本也是以单拷贝或
低拷贝形式存在。
3 讨论
植物基因的表达受多个层次的调节, 根据机体
生长、发育、繁殖及适应环境的需要, 有选择地按
一定程序适度表达。许多高等植物在长期进化过程
中通过多倍体化、基因复制等保障生存, 因此, 一些
维持植物生长、发育基本生物学过程的关键基因也
往往以多拷贝形式存在, 不同拷贝间或功能发生分
歧、或在不同的时间空间发挥作用。
ACP 是植物脂肪酸合成途径的重要辅因子, 参
与脂肪酸从头合成的整个过程。同时, 它也参与硬
脂酰基-ACP去饱和反应和质体类酰基转移反应。许
多植物中存在多个ACP异构体, 推测可能与ACP的
组织甚至器官特异性或发育阶段特异性活性有关。
棉花一个纤维特异性的 ACP, 它参与了纤维伸长过
程中膜脂的生物合成[14]。拟南芥 ACP A1 基因表达
的细胞或发育阶段特异性特征表明, 在植物发育的
某个阶段 ACP A1 基因需要保持较高的表达量以满
足所需脂肪酸合成, 如花粉粒的绒毡层需合成脂丰
富的“pollenkit”和“tryphines (含油层)”包裹在成熟花
粉粒的外层[1]。而在有些组织中多种 ACP同时表达,
不同ACP异构体可能具有不同的组织和发育表达模
式, 通过这种表达模式调控植物体内维持基本膜脂
生物合成和作为三酰基甘油贮藏脂肪酸生物合成之
386 作 物 学 报 第 40卷


表 1 花生和拟南芥不同 ACP基因启动子各自特有的调控元件
Table 1 Specific cis-elements in the promoter regions of different ACP genes from peanut and Arabidopsis
基因(启动子大小)
Gene (size of promoter)
调控元件
Regulation element
识别序列
Recognition sequence
位置(正义或反义链)
Localization (sense or antisense chain)
CMSRE1 TGGACGG –38 (–)
CRT/DRE GTCGAC –518 (+)(–)
GT1 MOTIF KWGTGRWAAWRW –68 (–)
UPR MOTIFII CCNNNNNNNNNNNNCCACG –522 (-)
AhACP1 (500 bp)
IRO2OS CACGTGG –185 (+)
ABRE AT CONSENSUS YACGTGGC –165 (–)
ELRE CORE TTGACC –1568 (+)
LRE ACGTGGCA –1803 (+)
P1BS GNATATNC –1366 (+)(–)
S BOX CACCTCCA –1333 (–)
WUS ATAg TTAATGG –1515 (–)
AhACP4 (2070 bp)
XYLAT ACAAAGAA –1256 (–)
DRE2 CORE ACCGAC –846 (+)
E2FB GCGGCAAA –276 (+)
GAGA8 GAGAGAGAGAGAGAGA –709 to –719 (–)
GCC CORE GCCGCC –813 (–), –277 (–)
TELO BOX AAACCCTAA –874 (–)
AhACP5 (1180 bp)
UP1 ATMSD GGCCCAWWW –543 (+), –554 (–)
GCN4 TGAGTCA –179 (+)
LEAFY ATAG CCAATGT –1007 (+)
MYB PLANT MACCWAMC –914(+), –659 (–), –264(–)
PROXB CAAACACC –929 (–)
AtACP1 (1249 bp)
TE2F2 ATTCCCGC –1210 (–)
AAGACGTAG AAGACGTAG –346 (+)
CCA1 AAMAATCT –376 (+), –151 (–)
SEF1 MOTIF ATATTTAWW –1203 (+)
SORLIP5 GAGTGAG –33 (–)
AtACP2 (1225 bp)
TGTCACA TGTCACA –1177 (+)
CARGAT CONSENSUS CCWWWWWWGG –444 (+)(–)
RBCS CONSENSUS AATCCAA –788 (–)
SEBF CONSST YTGTCWC –249 (+)
SORLIP4 GTATGATGG –384 (+)
AtACP4 (1173 bp)
SORLREP3 TGTATATAT –354 (–)
MYB1 GTTAGTT –505 (–)
S1F ATGGTATT –711 (–)
SURE1 AATAGAAAA –255 (–)
T/G BOX AACGTG –106 (+)
AtACP5 (1000 bp)
TGACGT TGACGT –904 (+)
花生 ACP基因启动子中调控元件的位置根据确定的转录起始位点 0计算; 拟南芥 ACP基因调控元件的位置以起始密码 ATG为 0
计算。
The localization of every regulatory element in the promoters of peanut ACP genes is determined by the position of transcription start
site ‘0’, while that in the promoters of Arabidopsis ACP genes is confirmed according to the position of ATG “0”. K: G/T; M: A/C; N:
A/T/C/G; R: A/G; W: A/T; Y: C/T.


第 3期 单 雷等: 花生质体型酰基载体蛋白基因 5′侧翼调控序列的克隆与分析 387


表 2 AhACPs和 AtACPs启动子区共有调控元件
Table 2 Common cis-elements in the promoters of AhACPs and AtACPs
调控元件
Regulation element
数量
Number
功能注释
Functional annotation
CACTFT 6a–32b 叶肉细胞表达模块(mesophyll expression module 1)的主要组分。
Tetranucleotide (CACT) is a key component of Mem1 (mesophyll expression module 1).
CCAAT BOX1 1–6 真核基因 5′非编码区共有序列。
Common sequence found in the 5-non-coding regions of eukaryotic genes.
CURE CORE 2–10 铜应答元件, 也涉及有氧应答。
Copper-response element, also involved in oxygen-response of some genes.
DOF CORE 6–38b Dof DNA结合蛋白结合 DNA所需的中心位点, 种子特异性表达必需的元件。
Core site required for binding of Dof proteins, also required for seed-specific expression.
E BOX 2a–18 大多数储藏蛋白基因启动子包含该元件。
The cis-elements in the promoter regions of most genes encoding the storage protein
GATA BOX 2–19 涉及基因光调控、高水平和组织特异性表达。
Required for high level, light regulated, and tissue specific expression.
GT1 CONSENSUS 5–22b Consensus GT-1 binding site存在于许多光调控基因启动子区。
Consensus GT-1 binding site in the promoter regions of many light-regulated genes.
IBOX CORE 1–8 光调控基因上游保守的序列。
Conserved sequence upstream of light-regulated genes.
MYB CORE 1a–6 涉及淹水胁迫应答。
Involved in responding to water stress.
MYC CONSENSUS AT 2a–18 在许多干旱应答基因如 rd22的启动子区含有 MYC识别位点。
MYC recognition site found in the promoters of the dehydration-responsive gene rd22 and many other genes.
OSE2 ROOT NODULE 2–9 根结感染细胞中激活表达的启动子含有的 organ-specific elements (OSE)的一个保守基序。
One of the consensus sequence motifs of organ-specific elements (OSE) characteristic of the promot-
ers activated in infected cells of root nodules.
POLLEN1 LELAT52 3–20b 花粉特异性激活的调控元件之一。
One of the co-dependent regulatory elements responsible for pollen specific activation.
WRKY71OS 1a–8 含 TGAC 中心位点的 W-box, 水稻 WRKY71 结合位点, 涉及赤霉素应答转录抑制子或病原相关
基因表达调控。
A core of TGAC-containing W-box; Binding site of rice WRKY71, a transcriptional repressor of the
gibberellin signaling pathway or the regulation of the pathogenesis-related genes.
a: 分析的最短启动子(AhACP1基因)包含的元件数目; b: 分析的最长启动子(AhACP4基因)包含的元件数目。
a: cis-element number in the shortest promoter (AhACP1 gene); b: cis-element number in the longest promoter (AhACP4 gene).

间的平衡[2]。拟南芥中 AtACP2和 AtACP3编码的蛋
白仅有 1个氨基酸的差异, 并且均为组成型表达, 但
它们呈现不同的组织和发育表达模式。营养组织中
AtACP2 主要在茎尖、根尖和次生分生组织中表达,
AtACP3 则在叶片(包括叶柄)和根(包括根毛)表达量
都较高; 开花期 AtACP2 仅在柱头的乳头状突起和
成熟花粉表达, AtACP3则在整个花器官均有较强表
达; 在种子发育过程中 AtACP2 在幼嫩种子中表达
量最高, 而 AtACP3从发育中期表达开始增加, 成熟
种子中表达量最高[9]。它们表达模式的差异主要是
由距离转录起始位点–180 bp 上游具有较大差异区
域中一些调控元件决定的。RT-PCR 分析表明,花生
AhACP4 和 AhACP5 在根、茎、叶、花和种子中的表
达模式非常接近, 但它们调控区序列存在很大差异。
AhACP4 启动子区包含根或芽顶端分生组织表达调控
元件WUS (TTAATGG)[15]; 而 AhACP5启动子区则含
有侧芽萌动和伸展所需的多个关键调控元件 E2FB
(GCGGCAAA)、TELO BOX (AAACCCTAA)和 UP1
(GGCCCAWWW)[16], 因此, 推测它们在不同组织或
发育阶段的表达模式可能存在差异。
亲缘关系分析表明 , 花生 AhACP4 与拟南芥
AtACP4可能是进化中的直系同源基因, 它们的启动
子区含有一些共同的调控元件, 如蔗糖和激素应答
的元件 SRE(TTATCC)、TATCCA 和光调控元件
IBOX (GATAAG)等。但不同物种间直系同源的基因
在进化过程中也往往产生功能上的变化。AhACP4
388 作 物 学 报 第 40卷


与 AtACP4 在进化过程中, 它们的表达模式发生了
分歧。AtACP4主要在叶中表达[17], 其启动子中含有
大量特有的光信号响应和光应答调控元件 ; 而
AhACP4 为组成型表达, 种子中表达量最高 [10], 它
的启动子区域也包含了一些特有的元件如 WUS 元
件、刺激素应答元件 ELRE CORE、磷酸盐饥饿应答
元件 PIBS、参与次生木质部发育调控的顺式元件
XYLAT等。
本研究分析的 3个花生质体型 ACP基因均克隆
自发育中的花生种子 cDNA[10,18], 它们的启动子序
列中都含有一些调控它们在种子或胚乳中特异表达
的元件, 如 DOF CORE (AAAG)、E BOX (CANNTG)、
MYB CORE (CNGTTR)等。已有大量研究证明, E
BOX 在许多参与脂肪酸合成的基因如 AhFAD2 (花
生 Δ12 Fatty Acid Desaturase)[19]、CsACP1 (萼苣花)
和 Cs4PAD (Δ4 palmitoyl-ACP desaturase)[20]以及三
酰甘油在种子中积累的基因如 AtDGAT (acyl-CoA-
diacylglycerol Acyltransferase; At2g19450)、AtPDGAT
(phosphatidyl choline: diacylglycerol acyltransferase;
At3g44830)、(At4g26740, At5g55240)的启动子区都
存在[21-22], 它是基因在种子中表达所必需的顺式元
件[20,23]。花生为异源四倍体(AABB, 2n=4x=40), 其基
因组中含有多少拷贝的质体型 ACP 基因目前尚未揭
示, 推测应该还存在其他组织或发育阶段表达特异
性的异构体参与植物体内不同组织或器官基本膜脂
生物合成或贮藏脂的生物合成。随着花生基因组学和
分子生物学研究的深入, 这一答案很快将被揭晓。
4 结论
克隆 AhACP1、AhACP4和 AhACP5 3个花生质
体型 ACP 基因的 5′侧翼调控区序列, 并确定了其转
录起始位点。不同物种、不同拷贝的 ACP基因启动
子既包含大量相同的调控序列也含有一些基因表达
特异的调控元件。即使是表达模式基本相似的基因,
它们的启动子区也各自包含了一些特异的调控元件,
推测它们精细地调控基因以组织或发育阶段特异性
模式表达。花生 AhACP4 与拟南芥 AtACP4 可能为
直系同源基因, 进化过程中它们启动子主要调控元
件产生较大差异, 它们的表达模式也随之产生了分
歧。这些关键调控元件的具体功能还有待进一步的
实验验证。
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