全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(12): 20902097 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由山西省自然科学基金项目(2013011028-1), 水稻生物学国家重点实验室开放课题(090203)和山西省人才引进与开发专项资金资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王兴春, E-mail: wxingchun@163.com, Tel: 0354-6287191-307; 杨长登, E-mail: yangchangdeng@
yahoo.com.cn, Tel: 0571-63370367
# 现工作单位中国环境科学研究院, 北京, 邮编 100012
Received(收稿日期): 2014-07-16; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-10-20.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141020.0941.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.02090
水稻糖苷水解酶基因 OsBE1在叶绿体发育中的功能
王兴春 1,2,* 王 敏 1,# 季芝娟 3 陈 钊 4 刘文真 3 韩渊怀 2 杨长登 3,*
1 山西农业大学生命科学学院, 山西太谷 030801; 2山西农业大学农业生物工程研究所, 山西太谷 030801; 3中国水稻研究所水稻生物
学国家重点实验室, 浙江杭州 310006; 4山西农业大学文理学院, 山西太谷 030801
摘 要: 叶绿体在植物碳水化合物代谢中起着至关重要的作用, 然而有关碳水化合物代谢在叶绿体发育过程中的功
能却知之甚少。从水稻中克隆了一个 Oryza sativa Branching Enzyme 1 (OsBE1)基因, 该基因编码一个糖苷水解酶 13
家族的蛋白。OsBE1 与拟南芥 AtBE1 的一致性为 66%, 但与水稻典型淀粉分支酶的一致性仅约为 40%。该基因的
T-DNA插入功能缺失突变体 osbe1幼苗白化, 且其白化表型不能用外源糖类拯救。osbe1突变体幼苗最终在三叶期死
亡。淀粉染色表明, osbe1突变体中淀粉的含量与野生型无明显差异。进一步的研究表明, osbe1突变体叶绿体数目较
少, 且无明显的基质片层结构。构建了 OsBE1 基因过量表达载体 pCAMBIA1300-35S-OsBE1, 并将其转化水稻中花
11。获得的 108 株转基因水稻中, 77 株表现不同程度的黄化。本文初步揭示了碳水化合物代谢调控叶绿体发育的机
制, 并为深入研究糖苷水解酶 BE1的功能奠定了基础。
关键词: 糖苷水解酶; 碳水化合物代谢; OsBE1; 叶绿体; 水稻
Functional Characterization of the Glycoside Hydrolase Encoding Gene OsBE1
during Chloroplast Development in Oryza sativa
WANG Xing-Chun1,2,*, WANG Min1,#, JI Zhi-Juan3, CHEN Zhao4, LIU Wen-Zhen3, HAN Yuan-Huai2, and
YANG Chang-Deng3,*
1 College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 2 Institute of Agricultural Bioengineering, Shanxi Agricultural
University, Taigu 030801, China; 3 State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China; 4 College
of Arts and Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
Abstract: Chloroplast plays an important role in plant carbohydrate metabolism; however the function of carbohydrate metabo-
lism in the chloroplast development is poorly understood. The Oryza sativa Branching Enzyme 1 (OsBE1) gene, encoding a gly-
coside hydrolase family 13 protein, was cloned from rice. The identity between OsBE1 and Arabidopsis AtBE1 is 66%, but only
40% between OsBE1 and the classical starch branching enzymes in rice. A T-DNA insertion mutant of OsBE1 gene was identified.
The seedlings of the osbe1 mutant were albino, and died at the three-leaf stage. This albino phenotype could not be rescued by
exogenous carbohydrate. Starch staining showed no obvious difference in starch content between osbe1 and the wild type. Further
studies showed that there were less chloroplasts in osbe1 mutant than in wild type, and there was no obvious stroma lamella in the
osbe1 chloroplast. The overexpression vector pCAMBIA1300-35S-OsBE1 was constructed and transformed into rice variety
Zhonghua 11. Finally, 108 transgenic lines were obtained and 77 lines of them showed etiolation in different degrees. The work
not only sheds a novel insight into the regulation mechanism of carbohydrate metabolism on chloroplast development, but also
lays a foundation for further understanding of the OsBE1’s function.
Keywords: Glycoside hydrolase; Carbohydrate metabolism; OsBE1; Chloroplast; Rice (Oryza sativa L.)
近年来 , 越来越多的证据表明碳水化合物代谢
在很大程度上影响着植物的生长发育和对环境因子
的响应 [1-7]。光合作用的最初产物磷酸丙糖在果糖-
1,6-二磷酸酶等的催化下可以转变成蔗糖。当水稻中
第 12期 王兴春等: 水稻糖苷水解酶基因 OsBE1在叶绿体发育中的功能 2091
的果糖-1,6-二磷酸酶功能缺失时 , 植物光合速率下
降, 生长发育缓慢, 并且在四叶期停止发育[5]。叶绿
体膜上的麦芽糖转运子(MEX1)是叶绿体中淀粉降
解产物转运的主要通道。MEX1基因突变后, 叶绿体
中的麦芽糖不能被及时运出, 导致麦芽糖大量积累。
mex1 突变体淀粉合成和降解的速度都变慢, 同时植
株生长缓慢, 叶绿素含量降低[6]。与上述可溶性碳水
化合物不同 , 淀粉在植物中主要作为能量的储存形
式。然而, 近来的研究表明淀粉的生物合成和代谢也
调控着植物的生长发育。当拟南芥中 2 个编码淀粉
分支酶的基因 AtSBEIIa和 AtSBEIIb同时丧失功能时,
植物淀粉含量显著降低、生长发育缓慢、植株矮小,
并且花序萎蔫[8]。在植物体内, 淀粉大多以磷酸化的
形式存在, α-葡聚糖水合激酶(α-glucan waterdikinase,
GWD)是淀粉磷酸化的关键酶。番茄 legwd突变体由
于丧失了GWD活性, 致使花粉中的淀粉粒不能正常
磷酸化。这些非磷酸化的淀粉在花粉粒发育后期无
法被降解利用, 导致花粉败育死亡[4]。此外, 淀粉的
合成和代谢与植物的生物产量密切相关 , 是植物生
长发育的调控枢纽[7]。蔗糖合酶是蔗糖代谢途径中
的关键酶, 花生蔗糖合酶基因 AhSuSy 的表达受到
干旱胁迫的诱导 , 可能在花生干旱胁迫中起一定的
作用[1]。
糖苷水解酶(EC3.2.1.-)是一类广泛存在于生物
体内可以水解糖苷或寡糖糖苷键的酶。根据其氨基
酸序列, 糖苷水解酶被分为 133 个家族(http://www.
cazy.org/fam/acc_GH.html)。其中, 糖苷水解酶 13家
族是一个比较常见的家族 , 它包括淀粉分支酶和糖
原分支酶等[9]。我们曾研究了糖苷水解酶 13家族的
AtBE1的功能[2]。与野生型相比, 拟南芥 AtBE1部分
丧失功能的突变体 atbe1-3 主根变短、侧根数目变
少、子叶变绿延迟、叶片和花畸形; 而该基因完全丧
失功能导致胚胎在心形胚时期发育停滞[2]。进一步
的研究表明, 蔗糖、葡萄糖和果糖等游离糖类可以部
分恢复 atbe1-3的表型, 暗示糖苷水解酶 AtBE1可能
通过碳水化合物代谢调控拟南芥胚胎发生和胚后发
育[2]。此外, 该基因在植物离体器官再生过程中也起
着极其重要的作用, atbe1-3 突变体不定芽再生和体
细胞胚胎发生的能力严重受阻 [3]。序列分析表明 ,
AtBE1 与拟南芥淀粉分支酶 AtSBE2.1 和 AtSBE2.2
的一致性仅为 40%左右, 而与水稻 OsBE1 的一致性
为 65%。拟南芥为双子叶植物而水稻为单子叶植物,
单双子叶植物中 BE1基因的功能可能不尽相同。本
文对单子叶植物水稻 OsBE1基因的功能研究表明水
稻 OsBE1 基因功能缺失后导致叶绿体发育异常, 水
稻幼苗白化 , 在三叶期死亡。本研究为深入解析
OsBE1基因的功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及培养条件
突变体 osbe1 (PFG_1C_15429)来自韩国庆熙大
学植物系统生物技术系(Department of Plant Systems
Biotech, Kyung Hee University)的 T-DNA插入突变
体库[10-12]。从种子播种发芽到三叶期, 均在 25℃、
16 h/8 h (光照/黑暗)的条件下培养。在中国水稻研究
所富阳实验基地进行水稻大田种植。
1.2 总 RNA的提取和 OsBE1基因表达检测
采用康为世纪生物科技有限公司的 RNA 提取
试剂盒(货号 CW0559, 含有 DNase I)提取水稻总
RNA。利用总 RNA 和宝生物(大连)有限公司的第 1
链合成试剂盒 (PrimeScript II 1st Strand cDNA
Synthesis Kit, 货号 6210A)合成 cDNA。利用半定量
RT-PCR 检测突变体 osbe1 中 OsBE1 基因的表达情
况 , 检测所用的引物为 OsBE1F2: 5-GGGAAGGG
CAAGAACCAGAT-3和 OsBE1B2: 5-CCTCATCGA
CGTATTGATTG-3。
1.3 OsBE1基因克隆和载体构建
由于 OsBE1基因非常大(32 kb左右), 很难进行
分子操作, 固采用 OsBE1基因的 cDNA。首先, 利用
KOD-Plus Ver.2 高保真 DNA 聚合酶(Toyobo Life
Science, 货号 KOD-211)和引物 OsBE1F: 5-tcccccggg
TTCCCGTTCCTCCTTCCTCC-3、OsBE1B: 5-gctctaga
GCTTGGTCTATCAACAATGC-3扩增 OsBE1基因。
将 PCR 产物用 Sma I 和 Xba I 双酶切后连接到
pCAMBIA1300-35S-GFP-OCS 载体 (中国科学院遗
传与发育生物学研究所储成才研究员馈赠)的相应
酶切位点。构建成 pCAMBIA1300-35S-OsBE1-OCS
载体用于水稻的遗传转化。所有操作都按照试剂盒
提供的方法。
1.4 生物信息学分析
运用 Lasergene 11.0的 MegAlign软件分析序列
的亲缘关系, 采用 MEGA 6.0 软件分析保守氨基酸,
将结果拷贝到 Photoshop进行编辑。
1.5 osbe1突变体的分离和鉴定
采用 PCR的方法分离和鉴定 osbe1突变体。其
中 , pGA2707 载体 T-DNA 引物 PGAL 序列为
2092 作 物 学 报 第 40卷
5-AAAGTGGCACGTGGTGAATGG-3。OsBE1基因
T-DNA侧翼序列的引物分别为 LL (5-TGCGCTCTC
TTCCTCTCTAC-3)和 LR (5-CCACTCCATGAAATC
CACAC-3)。野生型中引物 LL和 LR可以扩增出条
带, 引物 PGAL和 LR扩增不出条带; 杂合突变体中
LL 和 LR 以及 PGAL 和 LR 都可以扩增出条带; 而
纯合 osbe1突变体中引物 LL和 LR不能扩增出条带,
引物 PGAL和 LR可以扩增出条带。
1.6 叶绿素含量测定
采用分光光度计法测定叶绿素含量: 取二叶期
幼苗的地上部分, 称重(W)后加入 3 mL提取液(丙酮
和无水乙醇等量混合液), 利用宁波新芝 Scientz-48
高通量组织研磨器充分研磨; 10 000g 离心 5 min,
上清液转移至新的离心管中; 加入 1 mL提取液, 震
荡混匀后离心; 将 2次提取的上清液混合后定容至 4
mL(V); 利用分光光度计测定 645 nm和 663 nm的吸
光度。叶绿素 a的含量(mg g–1) = (12.70 OD663 – 2.690
OD645)×W×(1000×V)–1, 叶绿素 b 的含量 = (22.90
OD645 – 4.86 OD663) × W × (1000 × V) –1, 叶绿素 a、b
的总含量 = (8.02 OD663 + 20.20 OD645) × W × (1000
× V) –1。
1.7 超薄切片、染色和透射电镜观察
切片材料取自二叶期野生型和突变体幼苗叶片
的相同部位。水稻叶片以 2.5%的戊二醛固定液 4℃
固定过夜, PBS 漂洗; 1%锇酸固定液固定 4 h 左右,
PBS 漂洗; 乙醇梯度脱水, 环氧丙烷置换, 环氧丙烷
和 Epon812树脂的混合液浸透 2 h, 纯 Epon812树脂
浸透过夜、包埋, 干燥箱中聚合 48 h; 利用 LEICA
EM UC6超薄切片机切片, 切片厚度为 70 nm; 醋酸
双氧铀和柠檬酸铅双染色; JEM-1400 透射电镜观察
拍照。
1.8 农杆菌和水稻的遗传转化
将上述构建好的质粒通过电击转化到农杆菌
EHA105中, PCR检测阳性的克隆用于水稻转化。参照
Wang等[13]的方法进行农杆菌介导的水稻基因转化。
2 结果与分析
2.1 水稻 OsBE1基因克隆与序列分析
为了获得水稻 OsBE1 基因的序列, 利用拟南芥
AtBE1 (登录号为 NP_001154629)与 GenBank中的序
列比对分析, 结果表明 AtBE1与水稻 Os06g0367100
基因编码的蛋白质(登录号为 NP_001057611.1)同源,
其一致性(Identities)为 65%, 因此将该基因命名为
OsBE1 (Oryza sativa Branching Enzyme 1)。以
OsBE1F 和 OsBE1B 为引物, 籼稻 9311 的 cDNA 为
模板, 利用 KOD-Plus Ver.2 高保真酶进行 PCR, 可
以扩增出一条 2~3 kb 的条带(图 1-A)。随后对该条
带测序分析发现, 该条带全长为 2797 bp, 编码 903
个氨基酸。将该序列与水稻基因组序列比对分析表
明, OsBE1 基因含有 22 个外显子, 21个内含子(图
1-B)。但与一般基因不同 , 该基因的终止密码子
TGA 不是在最后一个外显子上, 而是在倒数第 2 个
外显子上(图 1-B), 这与拟南芥中调控开花的FCA基
因(AT4G16280)类似。
图 1 OsBE1基因克隆和结构分析
Fig. 1 Gene cloning and structure analysis of the OsBE1 gene
A: OsBE1电泳图, M为分子量标记 Trans2K Plus II, 1和 2为
OsBE1。B: OsBE1基因结构示意图, 虚线表示非转录区, 长方形
表示 UTR和外显子, 实线表示内含子。
A: PCR products of the OsBE1 gene. M: Trans2K Plus II marker, 1
and 2: OsBE1; B: Schematic representation of the OsBE1 gene. No
transcriptional region, exons and introns are represented by dash
lines, filled boxes and lines, respectively.
利用 Pfam 在线基序分析软件(http://pfam.xfam.
org/)[14]分析 OsBE1 的功能表明, 该蛋白的 127~220
氨基酸残基为 Carbohydrate-binding module 48结构
域(E = 8.9e–8), 该结构域具有与碳水化合物结合的
活性, 存在于碳水化合物相关活性的酶中; 425~557
氨基酸残基为 α-淀粉酶结构域(E = 0.0035), 该结构
域可以水解淀粉等多糖中的 α键; 802~899为 α-淀粉
酶 C结构域(E = 3e–17)。这些结果暗示 OsBE1可能
编码了一个糖苷水解酶 13 家族的蛋白。ChloroP
1.1[15]预测结果表明, 该蛋白 N 端为 41 个氨基酸残
基的信号肽, 定位于叶绿体中。
进一步的序列比对分析表明, OsBE1 与拟南芥
AtBE1 (NP_001154629)、玉米 ZmBE1 (AFW83197)、
谷子 SiSBEI (XP_004966509)、黄瓜 CsBE1 (XP_
004139870)和番茄 SlBE1 (XP_004244099)等的一致
性都在 60%以上。然而, OsBE1与水稻典型淀粉分支
酶 OsSBEI (AAP68993, 820)、OsSBEIIa (BAA82828)
第 12期 王兴春等: 水稻糖苷水解酶基因 OsBE1在叶绿体发育中的功能 2093
和 OsSBEIIb (BAA03738)的一致性较低, 仅为 40%左
右。为了深入了解 BE1 与典型淀粉分支酶 SBEI 和
SBEII 的亲缘关系, 从 GenBank 中获得了水稻、玉
米、谷子、拟南芥、黄瓜和番茄中的典型淀粉分支酶。
其GenBank登录号分别为: 水稻OsSBEI (AAP68993)、
OsSBEIIa (BAA82828)、OsSBEIIb (BAA03738); 玉米
ZmSBEI (ABQ15209) 、 ZmSBEIIa(DAA37957) 、
ZmSBEIIb (AAC33764); 谷子 SiBE1 (XP_004965411)、
SiSBEI(XP_004966509)、SiSBEIIa (XP_004975543)、
SiSBEIIb (XP_004952629); 黄 瓜 CsSBEI (XP_
004144236)、CsSBEII (XP_004137878); 番茄 SlSBEI
(XP_004238426)、SlSBEII (XP_004246561); 拟南芥
AtSBE2.1 (NP_181180)和 AtSBE2.2 (NP_195985)。
利用 Laser Gene11.0的 Megalign软件包对上述序列
进行亲缘关系分析, 结果表明 BE1 与典型淀粉分支
酶 SBEI和 SBEII属于不同的家族, 而且单双子叶植
物的 BE1 分别属于两个不同的亚类(图 2)。这暗示
BE1家族可能具有不同于典型淀粉分支酶的功能, 单
双子叶植物中 BE1基因的功能也可能不完全相同。
图 2 不同物种 BE1和典型淀粉分支酶的系统进化树
Fig. 2 Phylogentic relationship between BE1 and the clasical
starch branching enzymes in different species
为了深入了解 BE1 蛋白家族的功能, 我们对水
稻、玉米、谷子、拟南芥、黄瓜和番茄中的 BE1蛋
白进行了多序列比对分析。如图 3 箭头所示, 共有
52个保守的氨基酸在单双子叶植物BE1之间存在差
异, 这与上面系统进化树分析结果是一致的。此外,
还发现在淀粉分支酶 SBEI和 SBEII中都保守的 105
个氨基酸与 BE1 中的相应氨基酸不同(图 3), 暗示
BE1可能具有不同于淀粉分支酶的新功能。
2.2 osbe1突变体的分离鉴定
为阐明 OsBE1 基因在水稻生长发育过程的功能,
从韩国庆熙大学植物系统生物技术系的 T-DNA 插入
突变体库(http://cbi.khu.ac.kr/RISD_DB.html)中索要了
OsBE1的 T-DNA插入突变体(PFG_1C_15429)[10-12]。
T-DNA插入在该基因的第 1个内含子中(图 4-A)。从
索要的部分株系中分离到纯合的 osbe1 突变体(图
4-B)。利用半定量 RT-PCR检测了 osbe1纯合突变体
中 OsBE1 基因的表达情况, 结果表明在该突变体中
检测不到OsBE1基因的转录本(图4-C), 暗示 T-DNA
的插入完全破坏了 OsBE1基因的功能。
2.3 osbe1突变体表型分析
从韩国庆熙大学植物系统生物技术系获得了 12
个株系的可能的 OsBE1基因的 T-DNA插入突变体种
子。将其播种后, 有 4个株系出现白化幼苗(图 5-A)。
叶绿素含量分析表明, 突变体中叶绿素 a、叶绿素 b
和总叶绿素的含量都较低, 分别为野生型的 3.67%、
11.85%和 5.87% (图 5-B)。进一步的分析表明, 野生
型和 osbe1突变体中叶绿素 a和叶绿素 b的比值分别
为 2.71 和 0.84, 暗示 OsBE1 基因的突变对叶绿素 a
的合成影响更大。osbe1 突变体在三叶期后即停止发
育, 最终死亡(图 5-C)。由于外源可溶性糖类可以部
分恢复拟南芥 atbe1-3 突变体生长发育缺陷的表型[2],
那么外源糖类是否可以拯救 osbe1突变体幼苗白化或
致死的表型呢？为了回答这一问题, 将这些杂合株
系的种子播种在含有 2%蔗糖的 MS 培养基上, 观察
osbe1 突变体的生长发育情况。但结果表明, 蔗糖不
能拯救突变体幼苗白化或者致死的表型(图 5-D)。
为了阐明 osbe1 突变体白化苗的表型是否是
OsBE1 基因突变引起的, 利用单株收获的种子中含
有白化苗的株系连锁分析表明, 所分析的 62株幼苗
中, 白化苗与正常幼苗的比例为 1∶3 (14 株白化∶
48正常); 14株白化幼苗全部为 OsBE1基因 T-DNA
插入的纯合体, 而 48 株正常株系中 18 株为无 T-DNA
插入的野生型植株, 30株为含有 T-DNA插入的杂合
植株。这些结果表明 OsBE1基因的突变导致了水稻
幼苗白化。生物信息学分析表明, 与 OsBE1 一致性
最高的已知活性的酶是淀粉分支酶(图 1), 该酶活性
的丧失有可能导致淀粉含量的变化。但碘/碘化钾染
色表明, osbe1萌发的幼苗中淀粉含量与野生型无显
著差异(图 5-E)。
2094 作 物 学 报 第 40卷
图 3 不同植物 BE1氨基酸序列多重比对
Fig. 3 Multiple sequence alignment of BE1 proteins in different species
OsBE1(水稻)、SiBE1(谷子)和 ZmBE1(玉米)为单子叶植物 BE1蛋白; AtBE1(拟南芥)、CsBE1(黄瓜)和 SlBE1(番茄)为双子叶植物 BE1
蛋白。*为 BE1中保守氨基酸, 箭头指示的为单双子叶植物中不同的氨基酸, 氨基酸上面的字母表示在淀粉分支酶 SBEI和 SBEII中
保守而与 BE1不同的氨基酸。
OsBE1 (rice), SiBE1 (foxtail millet), and ZmBE1 (maize) are BE1s in monocots; AtBE1 (Arabidopsis), CsBE1 (cucumber), and SlBE1 (to-
mato) are BE1s in dicotyledon. *: conserved amino acids in BE1 proteins. The amino acids different between monocot and dicotyledon are
marked by arrows; the letters on the amino acids indicate the amino acid conserved in SBEI and SBEII, but different from BE1.
第 12期 王兴春等: 水稻糖苷水解酶基因 OsBE1在叶绿体发育中的功能 2095
图 4 osbe1突变体的鉴定
Fig. 4 Identification of the osbe1 mutant
A: osbe1突变体 T-DNA插入示意图, 箭头表示突变体鉴定引物
的位置和方向; B: 利用 PCR鉴定 osbe1突变体, M为分子量标记
Marker III [天根生化科技(北京)有限公司]; C: OsBE1基因在
osbe1突变体中的表达情况。
A: schematic representation of T-DNA in the osbe1 mutant. The
position and direction of the primers for mutant identification are
indicated by the arrows. B: identification of the osbe1 mutant by
PCR, M: Marker III [TIANGEN Biotech (Beijing) Co. Ltd.].
C: expression analysis of the OsBE1 gene in osbe1 mutant.
图 5 osbe1突变体表型分析
Fig. 5 Phenotype characterization of the osbe1 mutant
A: 三叶期野生型(左)和 osbe1(右)幼苗; B: osbe1突变体和野生
型幼苗中叶绿素含量; C: 四叶期野生型幼苗(左)和同时播种的
osbe1幼苗(右); D: 含 2%蔗糖的MS培养基上萌发和生长的野生
型(左)和 osbe1 (右)幼苗; E: 碘染色的野生型(左)和 osbe1 (右)幼
苗。标尺: 2 cm。
A: wild type (WT, left) and osbe1 mutant (right) at three-leaf stage.
B: chlorophyll content of leaves in osbe1 mutant and the WT seed-
lings; C: WT seedling at 4-leaf stage (left) and the osbe1 seedling
sowed at the same time (right); D: WT (left) and osbe1 mutant
(right) germinated and grown on MS medium containing 2%
sucrose. E: WT (left) and osbe1 mutant (right) seedlings stained
by I/KI. Bar: 2 cm.
2.4 osbe1突变体叶绿体发育异常
osbe1 突变体幼苗白化, 在三叶期死亡, 暗示该
突变体叶绿体的发育可能受到影响。为验证这一猜
测, 利用透射电镜观察了 osbe1 突变体叶绿体的发
育情况。与野生型相比, 突变体中叶绿体的数目明
显减少, 平均每个视野为 5 个叶绿体, 而野生型为
25个(图 6-A, B)。另外, 尽管 osbe1的叶绿体轮廓完
好, 但内部结构简单, 缺乏丰富、高度组织化的内膜
系统, 且无基粒和基粒片层的分化(图 6-C, D)。
图 6 osbe1突变体叶绿体发育情况
Fig. 6 Chloroplast in osbe1 mutant
野生型(A和 C)和 osbe1突变体 (B和 D)叶绿体发育情况。
标尺: A和 B为 5 μm, C和 D为 0.5 μm。
Chloroplast in wild type (A and C) and osbe1 mutant (B and D).
Bar: 5 μm (A and B), 0.5 μm (C and D).
2.5 OsBE1基因过量表达导致幼苗黄化
为了进一步阐明 OsBE1基因在水稻生长发育过
程的功能, 构建了 CaMV 35S 启动子驱动 OsBE1基
因的过量表达载体 pCAMBIA1300-35S-OsBE1 (图
7-A), 并用来转化粳稻中花11。共获得了108株潮霉
素抗性植株, 其中77株表现不同程度黄化。这些黄
化植株发育缓慢, 严重者叶尖干枯(图7-B)。
3 讨论
碳水化合物代谢是植物体内最重要最基础的代
谢之一 , 在植物生长发育过程起着至关重要的作
用。我们曾对拟南芥 AtBE1基因进行了深入研究, 该
基因编码一个糖苷水解酶 13家族蛋白, 通过碳水化
合物代谢调控了植物胚胎发生和离体器官再生[2-3],
但具体机制尚不清晰。本文从水稻中克隆了一个
AtBE1 的同源基因 OsBE1, OsBE1 与 AtBE1 的一致
性为 66%, 而与水稻中淀粉分支酶的一致性仅为
40%左右。系统进化分析表明, OsBE1与谷子、玉米、
2096 作 物 学 报 第 40卷
图 7 OsBE1基因过量表达载体及其转基因幼苗
Fig. 7 OsBE1 overexpression vector and the transgenic
seedlings
A: OsBE1基因过量表达载体 T-DNA示意图; B: 大田中种植的中
花 11(左行)和 OsBE1过表达转基因水稻(右行)。
A: T-DNA structure of OsBE1 overexpression vector;
B: seedlings of Zhonghua 11 (left) and OsBE1 overexpression
transgenic in the field (right).
番茄和黄瓜等的 BE1 亲缘关系较近, 而与经典的淀
粉分支酶 SBEI和 SBEII较远(图 1), 暗示 OsBE1可
能是不同于淀粉分支酶的一个新的糖苷水解酶 13
家族蛋白。这与 Han等[16]的研究结果是一致的。
系统进化树表明, 单子叶植物水稻 OsBE1、玉
米 ZmBE1和谷子 SiBE1序列聚为一个亚类; 而双子
叶植物拟南芥 AtBE1、黄瓜 CsBE1和番茄 SlBE1聚
为一个亚类(图 2)。多序列比对分析也表明单双子叶
植物 BE1序列之间存在一定的差异(图 3)。上述结果
暗示单双子叶植物中 BE1基因的功能可能存在一定
的差异。这一推论在随后的功能研究中得到证实 :
双子叶植物拟南芥中 AtBE1 完全丧失功能后导致胚
胎败育 , 部分丧失功能突变体虽然叶片发育畸形 ,
但叶色基本正常[2]; 而单子叶植物水稻 OsBE1 完全
丧失功能后, 叶绿体发育异常, 幼苗白化(图 5 和图
6)。另外, 外源糖类可以部分恢复拟南芥 AtBE1基因
部分功能丧失突变体 atbe1-3 的表型[2], 但却无法拯
救水稻 osbe1 突变体(图 5)。进一步研究表明, 过量
表达水稻 OsBE1 导致幼苗黄化(图 7-B), 暗示水稻
OsBE1 基因的表达量受到严格的调控, 过高过低都
会导致植物生长发育异常。当该基因功能缺失时 ,
叶绿素合成完全受阻, 幼苗白化; 而当该基因过量
表达时, 叶绿素的合成部分受阻, 幼苗黄化。但具体
原因尚待进一步研究。
我们对拟南芥 AtBE1 初步的活性分析表明 ,
AtBE1 可能不具有典型的淀粉分支酶活性[2]。此外,
在植物体内淀粉主要作为储藏物质而存在, 因此淀
粉的合成和代谢相关酶类的缺失一般不会导致植物
的死亡。拟南芥基因组中编码两个典型的淀粉分支
酶即 BE2.1 和 BE2.2 (又称为 BE2 和 BE3), 即便是
这两个编码基因全部突变, 支链淀粉的合成完全被
阻断, 双突变体也可存活, 只是生长发育缓慢[8]。除
了淀粉分支酶, 支链淀粉的生物合成还需要可溶性
淀粉合酶(soluble starch synthases, SSs)和淀粉脱分
支酶(debranching enzymes, DBEs)的共同参与[17]。水
稻淀粉脱分支酶 ISA3 功能缺失后导致造粉体和叶
绿体发育异常, 表明 ISA3基因参与了质体发育的调
控[18]。但与水稻 ISA3 基因相比, 拟南芥和水稻中
BE1基因对于叶绿体的发育可能更为重要。
4 结论
从水稻中克隆了一个 OsBE1 基因, 该基因编码
一个糖苷水解酶 13家族蛋白。OsBE1基因功能缺失
突变体 osbe1幼苗白化, 叶绿体发育异常, 暗示了该
基因通过碳水化合物代谢调控了叶绿体的发育, 但
具体机制还待进一步的生化功能研究。
References
[1] 何美敬, 刘立峰, 穆国俊, 侯名语, 陈焕英, 崔顺立. 花生蔗
糖合酶基因 AhSuSy 的克隆和干旱胁迫表达分析. 作物学报,
2012, 38: 2139–2146
He M J, Liu L F, Mu G J, Hou M Y, Chen H Y, Cui S L. Molecu-
lar cloning of sucrose synthase gene and expression analysis under
drought stress in peanut (Arachis hypogaea L.). Acta Agron Sin,
2012, 38: 2139–2146 (in Chinese with English abstract)
[2] Wang X C, Xue L, Sun J Q, Zuo J R. The Arabidopsis BE1 gene,
encoding a putative glycoside hydrolase localized in plastids,
plays crucial roles during embryogenesis and carbohydrate me-
tabolism. J Integr Plant Biol, 2010, 52: 273–288
[3] Wang X C, Yang Z R, Wang M, Meng L Z, Jiang Y W, Han Y H.
The BRANCHING ENZYME1 gene, encoding a glycoside hy-
drolase family 13 protein, is required for in vitro plant regenera-
tion in Arabidopsis. Plant Cell Tissue Organ Cult, 2014,117:
279–291
[4] Nashilevitz S, Melamed-Bessudo C, Aharoni A, Kossmann J,
Wolf S, Levy A A. The legwd mutant uncovers the role of starch
phosphorylation in pollen development and germination in to-
mato. Plant J, 2009, 57: 1–13
[5] Lee S K, Jeon J S, Bornke F, Voll L, Cho J I, Goh C H, Jeong S
W, Park Y I, Kim S J, Choi S B, Miyao A, Hirochika H, An G,
Cho M H, Bhoo S H, Sonnewald U, Hahn T R. Loss of cytosolic
fructose-1,6-bisphosphatase limits photosynthetic sucrose syn-
thesis and causes severe growth retardations in rice (Oryza sa-
tiva). Plant Cell Environ, 2008, 31: 1851–1863
[6] Niittyla T, Messerli G, Trevisan M, Chen J, Smith A M, Zeeman S
C. A previously unknown maltose transporter essential for starch
第 12期 王兴春等: 水稻糖苷水解酶基因 OsBE1在叶绿体发育中的功能 2097
degradation in leaves. Science, 2004, 303: 87–89
[7] Sulpice R, Pyl E T, Ishihara H, Trenkamp S, Steinfath M, Wi-
tucka-Wall H, Gibon Y, Usadel B, Poree F, Piques M C, Von
Korff M, Steinhauser M C, Keurentjes J J, Guenther M, Hoehne
M, Selbig J, Fernie A R, Altmann T, Stitt M. Starch as a major in-
tegrator in the regulation of plant growth. Proc Natl Acad Sci
USA, 2009, 106: 10348–10353
[8] Dumez S, Wattebled F, Dauvillee D, Delvalle D, Planchot V,
Ball S G, D’Hulst C. Mutants of Arabidopsis lacking starch
branching enzyme II substitute plastidial starch synthesis by
cytoplasmic maltose accumulation. Plant Cell, 2006, 18:
2694–2709
[9] Labes A, Karlsson E N, Fridjonsson O H, Turner P, Hreggvidson
G O, Kristjansson J K, Holst O, Schonheit P. Novel members of
glycoside hydrolase family 13 derived from environmental DNA.
Appl Environ Microbiol, 2008, 74: 1914–1921
[10] Jeong D H, An S, Park S, Kang H G, Park G G, Kim S R, Sim J,
Kim Y O, Kim M K, Kim S R, Kim J, Shin M, Jung M, An G.
Generation of a flanking sequence-tag database for activa-
tion-tagging lines in japonica rice. Plant J, 2006, 45: 123–132
[11] An S, Park S, Jeong D H, Lee D Y, Kang H G, Yu J H, Hur J, Kim
S R, Kim Y H, Lee M, Han S, Kim S J, Yang J, Kim E, Wi S J,
Chung H S, Hong J P, Choe V, Lee H K, Choi J H, Nam J, Kim S
R, Park P B, Park K Y, Kim W T, Choe S, Lee C B, An G. Gen-
eration and analysis of end sequence database for T-DNA tagging
lines in rice. Plant Physiol, 2003, 133: 2040–2047
[12] Jeon J S, Lee S, Jung K H, Jun S H, Jeong D H, Lee J, Kim C,
Jang S, Yang K, Nam J, An K, Han M J, Sung R J, Choi H S, Yu J
H, Choi J H, Cho S Y, Cha S S, Kim S I, An G. T-DNA insertional
mutagenesis for functional genomics in rice. Plant J, 2000, 22:
561–570
[13] Wang W, Wu C, Liu M, Liu X R, Hu G C, Si H M, Sun Z X, Liu
W Z, Fu Y P. Resistance of antimicrobial peptide genes trans-
genic rice to bacterial blight. Rice Sci, 2011, 1: 10–16
[14] Finn R D, Bateman A, Clements J, Coggill P, Eberhardt R Y,
Eddy S R, Heger A, Hetherington K, Holm L, Mistry J, Sonn-
hammer E L, Tate J, Punta M. Pfam: the protein families database.
Nucl Acids Res, 2014, 42: D222–230
[15] Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G. ChloroP, a neural
network-based method for predicting chloroplast transit peptides
and their cleavage sites. Protein Sci, 1999, 8: 978–984
[16] Han Y, Sun F J, Rosales-Mendoza S, Korban S S. Three orthologs
in rice, Arabidopsis, and Populus encoding starch branching en-
zymes (SBEs) are different from other SBE gene families in
plants. Gene, 2007, 401: 123–130
[17] James M G, Denyer K, Myers A M. Starch synthesis in the cereal
endosperm. Curr Opin Plant Biol, 2003, 6: 215–222
[18] Yun M S, Umemoto T, Kawagoe Y. Rice debranching enzyme
isoamylase3 facilitates starch metabolism and affects plastid
morphogenesis. Plant Cell Physiol, 2011, 52: 1068–1082