全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17 (1) : 75～ 86
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
分子标记在植物学中的应用及前景3
周奕华　陈正华
(中国科学院遗传研究所　北京　100101)
D EVELOPM ENT AND APPL ICAT ION OF MOL ECULAR
M ARKERS IN BOTANY
Zhou Y ihua　Chen Zhenghua
( Institu te of Genetics, T he Ch inese A cad emy of S ciences　Beijing　100101)
关键词　分子标记, 植物学, 遗传图谱, 物理图谱, 基因定位, 遗传多样性, 基因克隆, 比较遗传
分析
Key words　M o lecu lar m arker,Bo tany, Genetic m ap , Physical m ap , Gene tagging, Genetic di2
versity, Gene clon ing, Comparative genetic analysis
1　引言
随着近年来分子生物学的发展, 遗传标记的种类已越来越多, 不只局限于传统的形态标记, 分子标
记尤其显示出独特的优越性, 并被广泛地应用于植物学研究的各个领域。那么什么叫标记呢? K ing 和
Stansfield〔1〕将其定义为代表一个位于染色体上已知位点的基因或一种清晰的表型性状。总的来说, 分子
标记目前主要应用于两方面: 一是作为基因, 尤其是一些重要农艺性状基因如抗虫、抗病基因或数量性
状基因的检测尺度, 要做到这点, 首先必须确定与目的基因紧密连锁的分子标记; 二是作为种群分析、种
质资源分析及遗传育种的研究依据。
2　分子标记的种类及特征
2. 1　同工酶标记 ( Isozym e m arker)
同工酶标记是 60 年代出现并应用于植物学研究中的分子标记。许多研究表明, 植物中有些酶常以
多种形式存在, 这反应了植物组织发育的特异性及编码这些酶的等位基因之间的差异。当在适当的条件
下电泳时, 单个氨基酸的改变便可在其电泳的迁移率上显示出来, 从而表现出同工酶的多态性。由于同
工酶标记是共显性的, 可直接检测杂合子, 因此不仅是一种有效的“杂交测试剂”, 可在早期识别并淘汰
自花授粉得到的植株, 还可直接反映基因表达水平上的差异。Gep ts 等〔2〕用同工酶标记显示了种子贮藏
蛋白的多样性。同工酶标记还被广泛用于建立遗传图谱、种群分析等研究中。然而其数量却非常有限, 如
　3 　收稿日: 1997210209, 修回日: 1998201223。第一作者: 女, 31 岁, 助研 (博士) , 现从事植物分子遗传学研究。
在大豆中, 只有 19 个同工酶标记被报道〔3〕。加之它是结构基因的表达产物, 只代表植物基因组的一小部
分; 同时极易受环境等因素的影响, 这些都限制了它的应用。
2. 2　随机引物扩增DNA 多态性标记 (R andom amp lificat ion of po lymo rph ic DNA m arker, RA PD )
W illiam s 等〔4〕应用短的“DNA 寡核苷酸”(通常 10 bp ) 作引物, 通过 PCR 扩增来检测DNA 的多样
性。在 PCR 反应中, 随机引物在模板链的不同位置与基因组DNA 结合, 而结合位点会因基因组DNA
序列的改变而不同, 经过数次 PCR 循环, 而得到不同大小的DNA 扩增带。这种技术的自动化程度很高,
操作简单, 可为遗传图谱的建立提供大量的 RA PD 标记。同时它不受时间、地点、环境等因素的干扰, 因
而被广泛应用于基因定位、物种多样性等研究中。但由于 PCR 对反应条件敏感, 因此实验的重复性常成
为困扰人们的问题。加之 RA PD 标记大多数为显性, 无法准确区别纯合子与杂合子, 为了克服这一缺
点, 目前已发展了一些相关的技术, 如序列特异性扩增区 ( sequence characterized amp lified region,
SCA R ) 、扩增片段长度多态性 (amp lificat ion fragm ent length po lymo rph ism , A FL P)及酶切扩增多态性
序列 (cleaved amp lified po lymo rph ic sequences, CA P s)。这些技术克服了RA PD 标记只作为显性标记的
缺点, 可提供更多的共显性标记。
2. 3　限制性酶切片段长度多态性标记 (R estrict ion fragm ent length po lymo rph ic DNA m arker, R FL P)
基因组DNA 在经特定的内切酶消化后, 产生大小不同的DNA 片段, 通过 Southern 印迹和与特定
序列的探针杂交后, 显示出DNA 分子水平上的差异。基因组序列的改变引起内切酶酶切位点的缺失或
插入, 从而造成酶切后DNA 片段大小的多态性。第 1 例将此技术应用于遗传图谱研究中的是冷泉港实
验室对腺病毒血清型温敏突变基因遗传图谱的确定。此后第 1 张人类基因组 R FL P 图谱于 1987 年首次
发表〔5〕。近年来, 这一技术也越来越多地应用于植物中。由于它不像同工酶标记那样数量有限, 又是共显
性的; 不受环境、组织特异性等因素的干扰, 从而能有效地在此基础上建立高密度的遗传图谱, 并为研究
重要性状基因、物种多样性等提供稳定的、分子水平上的标记。但其操作复杂, 耗时耗钱, 仅探针就至少
有三种来源: cDNA 克隆、植物基因组克隆、PCR 克隆, 而有效探针也有限, 这都影响该标记的应用。
2. 4　简单序列重复长度多态性标记 (L ength po lymo rph ism of simp le sequence repeat, SSR )
SSR 也被称为微卫星 (m icro satellite)。70 年代初, 人们便发现真核生物基因组中普遍存在着简单的
重复序列, 它们常连续重复多次, 而且不同物种其重复序列及重复单位数都不同。如在大豆中便富含
A T ,A T T 重复序列。这种简单重复序列是 11～ 60 bp 或 2～ 5 bp 为单位的重复序列。而在重复序列的两
端往往是趋于保守的限制性内切酶的酶切位点。因此人们便在重复序列的两端设计特殊的引物, 经 PCR
扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影, 得到因简单重复序列重复单位数不同而引起的扩增片段
的多态性。由于植物基因组中 50%～ 80% 为重复序列, 因此用这一标记建立遗传连锁图也极其有效。
Zhao〔6〕证实在水稻中存在 (GGC) n 的 SSR 标记。然而, SSR 与R FL P 技术类似, 操作复杂, 劳动量大, 首
先需建立基因组文库以筛选合适的 SSR , 这些都是该技术目前在应用上的局限。
2. 5　表达序列标定 (Exp ressed sequence tags, EST s)
90 年代初, 随着人类基因组研究计划的深入, 一种新的遗传标记也孕育而生, 称之为表达序列标
定。EST s 主要是在 cDNA 文库中随机挑选克隆, 并进行单边测序 ( single2pass sequence) 而产生的 250
至 400 bp 的核苷酸片段。A dam s 等〔7〕最早用 EST s 对表达序列进行了详细的研究, 他们从人脑 cDNA
文库中随机挑取 600 个克隆, 测序合成 EST s, 从而发现了一系列在脑部表达的新基因。此外 EST s 还可
用作R FL P 标记, 构建高密度的遗传连锁图谱。目前已有 16 000 个 EST s 标记分布于人的 23 对染色体
上。与一般的遗传标记相比, 它的优越性在于直接与一个表达基因相关, 且易于转变成序标位点 ( se2
quence2tagged sits, ST Ss)。同时大量的 EST s 可累积建立一个新的数据库, 称之为 dbEST , 为表达基因
的鉴别等研究提供大量信息。由于 EST s 来源于 cDNA 克隆, 因此它部分反映了基因组的结构及不同组
织中基因的表达模式。通常 EST s 还可在 Genbank 及 P IR (P ro tein Info rm ation R esource)等数据库中进
行比较分析, 以获得其可能的功能、表达模式等信息。目前这种技术已被引入植物中。在玉米和油菜中分
67 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　　
别建立了 130 及 237 个 EST s。尤其是在拟南芥中, 已有近 7 000 个 EST s, 其中 5 000 个 EST s 可编列成
拟南芥表达基因的目录〔8〕。最近在水稻中利用 EST s 作图的研究也越来越多。Um eda 等〔9〕从盐、缺氮等
胁迫的水稻悬浮培养细胞 cDNA 文库中部分测序 780 个克隆, 发现一些 EST s 与信号传递及A T P 合成
途径等基因有关, 这为研究特殊代谢途径的基因表达非常有利。Sasak i 等〔10〕应用类似的方法在水稻愈伤
组织 cDNA 文库中测序合成了 2 259 个 EST s, 其中 690 个序列为已知基因, 包括转录和翻译过程的调控
基因。这些研究都为表达基因的物理定位、构建水稻基因转录图谱及高密度遗传连锁图谱奠定了基础。
2. 6　染色体原位杂交 (Ch romo som e in situ hybridization)
这是近 20 年发展起来的分子细胞遗传学新技术, 它可将标记的DNA 探针直接定位到染色体或
DNA 纤维上, 以便进行直观、准确检测的分子标记技术。而目前发展最快的便是 80 年代末期产生的荧
光原位杂交技术 (fluo rescence in situ hybridization, F ISH ) , 它是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体
与探针分子特异性结合来检测DNA 序列在染色体或DNA 纤维上的定位。该技术可用于检测外源染色
体插入〔11〕, 鉴定单体、三体或缺体〔12〕, 研究物种起源、演化及构建染色体物理图谱〔13〕等方面。这一技术的
最大优点便是简单, 直观, 而且可利用多色荧光标记, 在同一样片上同时观察几种DNA 探针的定位, 直
接得到它们的相关位置和顺序。随着标记、制片技术以及观察设备的不断改进, 其灵敏度和分辩率也在
不断提高, 并且取得了许多可喜的进展。
3　应用分子标记建立遗传图谱
M o rgan 的遗传连锁理论为遗传图谱的建立奠定了理论基础: 基因在同一染色体上距离近到一定程
度时, 便不发生重组 (或重组率很低)地遗传给子代, 使子代与亲本表现出一致的表型性状。目前的遗传
图谱通常用DNA 标记来作图。它是根据对某一多态性DNA 片段分离情况的直接观察而获得。遗传图
谱只显示基因间在染色体上的相对位置, 并不反映DNA 的实际长度。要建立遗传连锁图谱, 首先应选择
合适的亲本及分离群体, 这直接关系到建立遗传图谱的难易程度、遗传图谱的准确性及所建图谱的适用
范围。亲本间的差异不宜过大或过小, 否则会降低后代的结实率及所建图谱的准确度。而亲本间适度的
差异范围因不同物种而异, 通常多态性高的异交作物可选择不同种间品种作亲本, 而多态性低的自交作
物则需选择不同亚种间品种作亲本。此外用于建立遗传图谱的群体可为亲本单交产生的 F 2 群体、回交
群体 (backcro ss,BS)、重组自交系 ( recom binan t inbred lines, R I)、双单倍体群体 (doub le hap lo id, DH ) 这
些群体各有其优缺点。F 2 群体是由所选择的亲本杂交后得到 F 1 代, 再由其自交得到的群体, 它构建起来
比较省时, 不需很长时间便可得到一个较大的群体。但由于每个 F 2 单株所提供的DNA 有限, 且只能使
用一代, 限制了该群体的作图能力。BC 群体是由 F 1 代与一亲本回交产生的群体。由于该群体的配子类
型较少, 统计及作图分析较为简单, 但提供的信息量却少于 F 2 群体, 且可供作图的材料有限, 不能多代
使用。R I群体是由 F 2 个体连续自交多代, 以至于后代基因组相对纯合的群体。因此R I群体可以繁衍保
存, 有利于不同实验室的协同研究, 而且作图的精确度更高。但要建立 R I群体相当费时, 而且有的物种
很难产生R I群体。而DH 群体是通过对 F 1 代进行花药离体培养得到单倍体植株后代, 再经染色体加倍
而获得的纯合二倍体分离群体。因此DH 群体也能够长期保存。但构建DH 群体需熟练的组培技术, 同
时所提供的信息量也明显低于 F 2 群体。除群体外, 作图还需要大量的DNA 有效标记及借助于计算机程
序来准确排列不同DNA 标记在染色体上的相对位置。
最早人们用形态标记和同工酶标记建立遗传图谱, 但由于这些标记数量有限, 人们便在此基础上同
时利用RA PD 和R FL P 等标记来建立高密度的遗传连锁图谱。RA PD 标记由于操作简单, 自动化程度
高, 因此用来建立高密度的遗传图谱显得尤其优越。在拟南芥 (A rabiod op sis tha liana) 中, 2 个全日制的
研究人员在 4 个月中利用重组自交系完成了 252 个 RA PD 标记的工作, 从而建立起拟南芥高密度的
RA PD 标记连锁图谱〔14〕。在甜菜中, 对 83 个个体进行了 20 组随机引物的检测与统计, 建立了 4 个连锁
组, 同时发现有 9 个RA PD 标记与下胚轴颜色基因、甜菜线虫抗性基因连锁〔15〕; 象火炬松这样生长周期
77　第 1 期　　　　　　　　　　周奕华等: 分子标记在植物学中的应用及前景
长、基因组很大的木本植物, T ingey 等〔16〕也仅用 6 个月便完成了 191 个RA PD 标记的图谱工作。
R FL P 图谱的应用首先出现在人类遗传学的研究中。近年来, 这一技术也广泛应用于植物中, 已有
多种高等植物的 R FL P 图谱被建立。在玉米中已建立数百个 R FL P 分子标记的图谱〔17〕; 在西红柿中则
建立了近 1 000 个R FL P 分子标记图谱〔18〕; 而象大豆〔19〕、大麦〔20〕、水稻〔21〕等作物的R FL P 遗传图谱近 10
年来已陆续被建立。其中研究比较深入的是拟南芥和水稻。如水稻的遗传图谱包括 1 383 个DNA 标记,
平均间隔 300 kb, 覆盖 1 575 cM , 12 个连锁群〔21〕。而在大豆中, 传统的大豆遗传图谱由形态、生理和蛋白
质标记组成, 46 个位点构成 20 个连锁群, 共计 440 cM 的长度〔22〕。而由R FL P 标记构成的分子连锁图谱
包括了大量的标记位点, 组成 23 个连锁组, 覆盖 3 000 cM 的长度〔19〕。这为进一步研究控制作物的各种
病虫害, 提高生理效应, 改良作物品质性状提供了有效的方法。除利用单倍体、二倍体外, 第 1 个与栽培
甘蔗相关的多倍体品系〔23〕的遗传图谱在甜根子草 (S accharum sp on taneum L. )‘SES208’中被建立。其中
208 个分子标记构成 42 个连锁组, 跨越 1 500 cM 连续的区域, 覆盖 85. 1% 的基因组。
对一些木本植物而言, 建立遗传图谱要比一年生园艺作物及大多数重要的粮食作物难得多。主要是
由于生长周期长, 得到分离的后代不易, 同时又表现出高度的品种间差异。人们在松柏类树木中常利用
单倍体为材料。而在果树育种中, 由于双亲均为杂合体, 杂合位点会在 F 1 代中分离, 其分离现象与测交
试验一样, 为 1∶1。因此称这种双亲均为杂合体的现象为双“假测交”(p seudo test cro ss)。W eeden〔24〕发
展了用双“假测交”群体建立遗传图的方法, 并以此在苹果中构建了分别拥有 233 个和 156 个分子位点
的连锁图, 前者包括 24 个连锁组, 共计 950 cM ; 后者共 21 个连锁群, 其中 5 个位点与控制枝条生长习
性, 萌芽期, 花芽的萌发, 吸收根的生长, 以及果皮颜色等性状的相关基因有连锁关系。此外, 也有利用 F 2
群体作图的例子, 如A bo tt〔25〕用一组 71 株的 F 2群体在桃树上构建了包括 46 个R FL P 位点、12 个RA PD
位点以及 7 个形态标记的遗传图。这些位点共覆盖了 332 cM 长度, 包括 8 个连锁群。
4　应用分子标记定位基因
4. 1　质量性状基因的定位
质量性状基因常由单个或几个基因控制, 如一些抗虫、抗病基因。由于这些性状只受单基因控制, 所
以利用分子标记来定位、识别抗性基因, 及对具抗性性状的植株进行直观的选择相对比较简单, 只要寻
找与该目的基因紧密连锁的分子标记即可。而且连锁的紧密程度越高, 结果就越可靠。其中最典型的例
子是根瘤线虫抗性基因 (M i)与酸性磷酸酶基因 (A PS21)的紧密连锁关系〔26〕。M i 基因来源于野生的西红
柿 (L y cop ersican p eruv ianum ) , 并通过多次回交引入栽培品种。同工酶标记A PS21 与M i 连锁非常紧密,
只有 0. 89 cM , 因此A PS21 基因便成为识别线虫抗性性状方便、可靠的标记。也使得利用染色体步查
(ch romo som e w alk ing)技术, 从西红柿中分离线虫抗性基因成为可能。此外,W eeden 等〔27〕发现庭院豌豆
(P isum sa tivum L. ) 的 pgm 2p 基因, 其编码的磷酸葡聚糖变位酶与抗大豆黄花叶病毒病的调控基因连
锁; 利用这样的连锁关系选择抗病品种更为简单、有效。同时, 人们还可以利用已建立的遗传连锁图谱把
目的基因经原位分子杂交定位到染色体上。
寻找与目的性状连锁的分子标记的有效方法可通过近等基因系 (near isogen ic lines,N IL )。这是通
过多次回交筛选得到的、品系间的差异主要在于某一目的的性状。利用这样的品系可在不需要完整遗传
图谱的情况下, 有效地筛选与目的基因连锁的分子标记。Paran 等〔28〕运用 212 个随机引物及生菜抗霜霉
病 (Dm ) 的近等基因系进行 RA PD 分析, 将 4 个 RA PD 标记定位在Dm 1和Dm 3连锁区域, 6 个定位在
Dm 11连锁区。此外, R FL P 标记也是定位质量性状基因的有效标记。H inze 等〔29〕发现 4 个R FL P 标记与
大麦的M 120 位点连锁,M 120 基因具有抗霜霉病的功能。K lein2lankho rt 等〔30〕分析了西红柿第六号染
色体上 21 个 R FL P 标记和马铃薯同源六号染色体上 7 个 R FL P 标记间的关系, 发现 1 个马铃薯的
R FL P 标记与西红柿M i 抗性等位基因紧密连锁。在抗性基因的染色体区域未知的情况下, 通过近等基
因系抗性位点差异的分析或对后代中该基因分离情况的测试, 结合已知的图谱标记便可确定某一抗性
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基因的具体位置及与之连锁的R FL P 分子标记图谱。Barone 等〔31〕应用这一方法证明马铃薯根孢囊线虫
抗性基因位于第七号染色体上。在燕麦中用 1 对近等基因系筛选了 204 个引物, 发现有与茎锈斑病基因
连锁的标记, 其中 2 个标记与锈病抗性基因 Pg3 完全连锁〔32〕。
另一种定位质量性状基因的有效办法是分离集团分析 ( bu lk segregan t analysis,BSA )。对于尚没有
分子连锁图谱或虽有图谱但连锁密度不够大的目的基因, 这种方法针对性很强; 但却只给出目的基因与
分子标记的相对位置, 而它们到底位于哪个连锁群中并不清楚。例如某一抗病基因在后代中分离, 就可
以把性状不同的单株分为 2 组, 1 组为抗病的, 另 1 组为感病的, 然后分别从这 2 个组中提取DNA , 即为
混合DNA 池; 对这两组混合DNA 进行多态性分析, 就可以找到与抗病基因连锁的分子标记。当得到反
映两组差异的多态性标记后, 再用所有的分离后代单株, 验证该标记是否真与目的基因具有连锁关系以
及连锁的紧密程度。M ichelmo re 等〔33〕便利用这一技术成功地在生菜中筛选出与Om 5ö8 区连锁的标记。
Giovannoni 等〔34〕通过已知的R FL P 遗传图谱, 选择不同的R FL P 基因型建立DNA 混合库, 筛选出与西
红柿果实成熟及茎蒂脱落性状连锁的 RA PD 标记。Barua〔35〕利用具有和缺少鸟喙形孢子菌 (R hyn2
cho spo rium secalis)抗性表型的大麦个体建立 2 个DNA 混合库, 只筛选了 700 个引物, 便发现有 7 种标
记与该抗性连锁, 并结合已知的位点将其定位于第三染色体长臂的 R h 调控区。总的来看, 这种方法应
用于RA PD 较R FL P 更方便, 也较常规的RA PD 更有效、更准确。它排除了环境及个体因素的影响, 并
让研究者目的性更强地把焦点集中在植物基因组的特定区域。
4. 2　数量性状基因的定位
在 20 世纪初, 另一个重要的遗传学理论便是数量遗传的多因子假说〔36〕。我们前面论述的质量性状
由 1 个或 2 个基因控制, 从亲本基因型便可推断出子代可出现的基因型或表现型。然而, 大多数农艺性
状如株高、株形、产量、蛋白质含量、油含量、对病虫害及不良环境条件的抵御能力等都是由多个基因来
控制的, 也就是说子代的这些性状的表现型是介于两亲本表现型范围内的连续位置上。
长期以来, 人们无法用孟德尔遗传因子理论去解释那些介于亲本之间的表型性状, 例如株高、重量、
产量等性状。通过大量的实验, 如对豆类、小麦、烟草连续变化表型的研究, 人们才发现这些性状受着许
多基因的控制, 每个基因都对其所控制的性状发挥着不同程度的作用。这便是数量性状基因 (quan tat ive
tra it loci,Q TL )的“多基因调控”理论。同简单质量性状相比, 数量性状的表现型受到相对大的环境因素
和相对小的遗传因素的影响。
在用遗传标记研究与质量性状基因连锁关系的同时, 人们发现遗传标记也可与数量性状基因建立
连锁关系, 同时确定数量性状单个基因的位置。最早证实遗传标记与Q TL 连锁关系的是 Sax〔37〕, 他在研
究菜豆 (P haseolus)不同种皮颜色的基因型时, 发现种皮的颜色与种子的平均大小有着密切的关系。随后
在许多作物中发现了不同的Q TL 与遗传标记的连锁关系。近年来, 人们借助于现代分子生物学技术在
西红柿、玉米等一些作物中发现了许多同工酶标记、R FL P 标记与Q TL 的连琐关系。
事实上, 要准确地定位Q TL , 必须建立起详细的含R FL P 等分子标记的Q TL 图谱。包括的标记数
量越多, 就越有可能准确地估计Q TL 的位置, 这样也能系统地在整个植物基因组中寻找与Q TL 有关的
标记。由于R FL P 对植株没有表型效应, 因而成为研究数量性状的理想标记。已有许多 R FL P 标记被应
用在Q TL 的定位研究中。O sbern 等〔38〕在研究西红柿的R FL P 遗传图谱与目的性状的关系时认为, 通过
度量群体中每一个体的目标性状和分析 R FL P 标记的表型, 可确定每个个体的 R FL P 标记的基因型, 并
获得以R FL P 标记为单位的该性状群体平均值, 以及该性状的总体平均值; 通过比较, 可发现 R FL P 标
记所在的染色体区域是否存在着与之连锁的Q TL。Paterson〔39〕应用此方法, 在 2 个西红柿的回交品系中
确定了 6 个控制果实重量、4 个控制可溶物含量及 5 个与果实 pH 值相关的Q TL 标记在染色体上的位
置; 同时与西红柿水利用效率有关的基因连锁的 R FL P 标记也已被确定。另外在栽培大豆 (G. m ax ) 和
野生大豆 (G. soja) 的杂交后代中检测 243 个R FL P 标记; 研究是否与种子的蛋白质成份和含油量相关
时,D iers 等〔40〕发现, 单个标记的分离能解释这两个性状 43% 的变异; 同时发现所有栽培大豆中与油含
97　第 1 期　　　　　　　　　　周奕华等: 分子标记在植物学中的应用及前景
量有关的基因都较野生大豆效应大, 反之所有野生大豆中与蛋白质含量有关基因较栽培大豆效应大。而
水稻〔41〕及玉米〔42〕的Q TL 图谱的研究报道近年来也很多, 其中与抗病、株高、产量等有关的Q TL 已被陆
续定位。
由于数量性状大多是一些重要的农艺性状, 往往受到植物学家、育种学家的普遍重视, 因此研究得
也越来越深入。现在人们不再停留在Q TL 的定位上, 还开始了对Q TL 进行分离的研究。由于不能彻底
了解单个基因对某个性状表型的作用到底有多大, 基因间的相关关系是什么, 以及与环境间的关系怎样
都不清楚, 所以在利用分子标记研究Q TL 时, 必须从目的性状在染色体上的位置、单个基因的“剂量”效
应、表型对环境的敏感性等多方面进行全面的研究。另外研究Q TL 图谱还涉及到大量复杂的数据统计、
分析、运算工作, 现在当然可以借助于计算机软件系统。
5　比较基因组分析
遗传图谱, 尤其是 R FL P 图谱的另一个重大用途便是揭示植物基因组间的保守性并进行比较遗传
作图 (comparative genetic m ap )。这是目前一个新兴的、较活跃的研究领域。比较遗传作图除可进行植物
基因组起源进化研究外, 也可鉴别位于保守位点上、控制重要性状的基因, 如识别在小麦、玉米中对 GA
不敏感的矮化基因〔43〕。目前在许多作物, 如番茄与马铃薯〔44〕、拟南芥与油菜〔45〕, 尤其是禾本科作物〔46〕中
的比较基因组分析的报道已越来越多。而禾本科作物在这方面的研究更是取得了较大的进展, 这主要是
由于整个禾本科作物均存在着相当强的遗传保守性。该科大约包含了 10 000 个品种, 其中不乏重要的粮
食作物, 如水稻、小麦、玉米、大麦、谷子、高粱等。从整体而言, 该类作物具理想遗传研究模式的所有特
征: 小麦、大麦的优良细胞遗传学基础, 玉米、水稻、大麦的详细遗传连锁图谱, 水稻和高粱的小型基因
组, 玉米突变体及转座子的良好鉴定和定位技术, 及水稻已被广泛接受的转化体系, 这都为禾本科作物
间的比较基因组分析奠定了良好的基础。大量的研究已经证明, 不同禾本科作物染色体间存在部分同源
性, 如小麦的 1～ 7 号染色体的部分连锁群分别与水稻第 5、第 4 等染色体部分同源〔47〕。此外 SaghaiM a2
roof 等〔48〕通过R FL P 连锁图谱对水稻和大麦分别覆盖 287 cM (24% ) 及 321 cM (31% ) 的 17 个保守区
进行了比较基因组分析, 发现大麦中的单拷贝基因有 72% 在水稻中仍以单拷贝出现。同样, 大约 60% 的
水稻单拷贝序列在小麦和大麦中仍为单拷贝基因, 这说明禾本科作物之间的差异可能不是由结构基因
的差异引起的, 而是由重复序列的差别引起的。最近,M oo re 等〔43〕在水稻 19 个连锁区段的基础上对水
稻、小麦、玉米、谷子、甘蔗、高粱 6 种作物也进行了比较遗传作图。他们将 6 种作物的染色体分成区段并
重排, 发现了其高度的相似性。6 种作物的保守同源区段排列在一起形成了一个环状的禾本科原始基因
组框架, 表明它们来源于一个共同的祖先。这对起源进化的研究具有重大意义。此外, 由于比较基因组分
析使它们的遗传信息和探针可以共享, 这为从已知物种基因推测另一物种同源基因的位置及功能提供
了线索。例如用水稻已定位的重要农艺性状基因研究其它粮食作物, 同时对水稻的研究也可从具长期细
胞遗传学研究历史的小麦和玉米中受益。这对禾本科作物的基因克隆及分子标记育种极其有利。因此,
目前各国都非常重视该领域的研究, 并致力于以此建立禾本科作物的遗传大体系。
6　遗传多样性的分析
自然界的物种多种多样, 而这种千姿百态正是由于其遗传物质的多样性造成的。通常植物学家借助
于一些直观的形态特征来识别物种, 随着科学的发展, 传统的形态学知识很难适应现代植物学研究。人
们开始应用分子标记来反应物种的遗传多样性。由于分子标记直接揭示DNA 水平的差异, 用它来描述
植物界的遗传多样性就更为直观、准确。
Sm ith〔49〕首先认为遗传标记可直接用来反应栽培品种种质上的多样性, 他用不同的玉米栽培品种
作为实验材料, 通过分子标记揭示了高度的遗传多样性。同时证明不同的物种遗传多样性的程度各不相
同。像大豆、西红柿、小麦和棉花多样性程度就不像玉米那样高, 其原因可能有三点: 与植物的授粉方式
08 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　　
有关; 现有的遗传标记只反映了整个植物基因组的一部分信息; 虽然遗传标记只代表了基因组的一部
分, 一些重要的农艺性状也许并不象我们所想象的那样具有高度的多样性。
应用分子标记研究植物的遗传多样性, 可以具体到以下三方面。
6. 1　植物亲缘关系的分析
通过同工酶图谱调查品种亲缘关系以及研究当今栽培品种的起源、栽培品种与野生型的进化关系
方面已卓有成效。目前, 人们发现分子标记更能直接从分子水平揭示个体间的差异及物种的相关性。茄
科作物如马铃薯、番茄、辣椒的染色体数相同, 核型和核DNA 含量都相似, 但彼此间无法杂交。通过
R FL P 分析, 发现西红柿的R FL P 图谱与马铃薯的R FL P 图谱有许多相似之处。在R FL P 标记排列顺序
上, 9 条染色体相同, 而有所不同的 3 条染色体是由于臂内倒位所致〔44〕, 从而从分子水平上证明了两者
在共同起源进化上的亲缘关系。而 RA PD 标记在研究不同品种间的遗传距离、系谱分析及分类方面也
显示了其独特的优越性。Graham 等〔50〕利用 10 个RA PD 引物对 13 种不同的悬钩子属 (R ubus)植物进行
了分类研究, 并确定了它们之间的遗传距离。V irk 等〔51〕应用同样的方法在 44 个栽培水稻品种中确定并
建立了相互间的遗传距离。遗传距离在一定程度上可反映亲缘关系的远近。Do s San to s 等〔52〕对青花菜、
花椰菜和结球甘蓝的 RA PD 标记的聚类分析将 3 个变种分开。而同一变种下又分为几个遗传相似的类
群。总之, 在DNA 分子水平这一巨大的遗传信息库里, 分子标记技术的引入, 使DNA 分子研究成为常
规的手段来区分物种、变种、品种, 在分析系谱关系、理顺分类地位、评价亲缘类群间的系统发育关系方
面发挥重要的作用。
6. 2　品种鉴定
植物界中的物种, 尤其是与人类生活极其相关的栽培品种极其繁多。而有些作物乃通过无性繁殖繁
衍后代, 其个体差别并不十分明显; 仅依靠传统的形态特征很难识别。然而通过DNA 分子标记来鉴别就
比较容易、准确。RA PD 标记由于其操作容易, 自动化程度高, 已成为非常有效的鉴别手段。H u 和
Q uiro s〔53〕用 4 个引物鉴别 14 个青菜花 (B . roccolli) 和 12 个花椰菜 (B . olercea) 品种, 发现每种作物有
12. 5% 的特异性标记, 用 2～ 3 个引物就能鉴别出这些品种。K resovich 等〔54〕在花椰菜和芜青 (B . rap a
L. ) 中选择不同的代表个体, 利用 25 个引物进行RA PD 研究, 获得了 140 个不同的多态性带。T aylo r〔55〕
对从不同组培条件下得到的再生甘蔗进行 RA PD 分析, 发现从胚性愈伤组织中得到的植株与从原生质
体培养中得到的植株, RA PD 标记存在一定程度的多态性; 说明长期不同的组培条件使其基因组发生一
定程度的变异, 导致个体间表现出一定的遗传差异。同时他们对转基因植物与非转基因植物也进行了
RA PD 分析, 发现RA PD 标记不能对转化植株加以识别, 原因有两个: 一是所用引物的结合位点不能反
映外源基因插入而引起的基因组变异; 二是植物基因组中插入 1 个或几个拷贝的外源基因不能引起明
显的遗传变异。R FL P 标记因其技术复杂, 费用大, 应用在品种鉴定方面有一定的局限性。但由于 R FL P
标记是共显性的, 在鉴别杂种及纯度方面具有独特的长处。
此外,DNA 和RNA 指纹印迹也是鉴别物种的有效手段。植物育种学家常采用这些方法识别不同的
基因型、栽培品种、基因组突变体, 及确定其在种群中的变异程度。Beyerm ann〔56〕通过DNA 指纹印迹技
术, 利用简单重复序列 (GA TA ) 4 和 (GT G) 5 作探针, 证实了大麦 (单子叶植物) 和甜菜 (双子叶植物)
DNA 指纹印迹区带的显著差异。由此可见, 分子标记是一种行之有效的基因型鉴定手段, 在鉴定品种、
品种注册等方面将会发挥重要的作用。
6. 3　植物育种研究
分子标记的应用为植物育种学开辟了崭新的研究和应用领域, 它使植物育种学家能直接从分子水
平了解物种间的差异, 也使育种过程更直观, 目的性更强。事实上, 一些重要的农艺性状往往遗传能力
弱, 或极易受环境等因素的干扰, 识别起来极为不易。然而在育种过程中利用分子标记跟踪目的性状在
后代中的分离情况, 并选择合适的配种方式以保持或获得更好的重组优良品种就显得格外有效、准确。
同时分子标记的应用可使人们在育种筛选过程中节省时间及大量的人力物力。利用与目的性状紧密连
18　第 1 期　　　　　　　　　　周奕华等: 分子标记在植物学中的应用及前景
锁的分子标记进行育种筛选, 可以准确地观察该基因在后代个体中的分离情况, 在表型出现以前, 即植
株的幼苗期就能通过分子标记对个体进行有效的筛选, 这被称为标记辅助选择 (m arker2assisted selec2
t ion,M A S)〔57〕。
另外, 植物育种的一个重要方面便是将外源种质的优良性状引入栽培品种, 分子标记也可用来有效
筛选栽培品种与野生型品种的杂交后代。通常人们将栽培品种与具某一理想性状的野生型品种杂交后,
得到的后代需与栽培品种进行多次回交以保持外源的以及栽培品种的理想性状, 同时淘汰野生型品种
的不良性状。在这个过程中借助于分子标记进行筛选就显得格外有效。选择与理想性状基因连锁的分子
标记进行筛选, 可识别出具这种性状的个体; 用这样的个体进行回交便能加速保留理想性状基因, 排除
不理想性状基因的筛选过程, 节省大量的人力、物力。
在育种过程中, 对个体及群体相对遗传距离的掌握是非常有价值的。有人认为, 遗传距离与杂种优
势有一定的相关性, 它不仅可让人们有机地组织种质资源, 还可提供更有效的基因型。这样便于选择最
佳的配种组合以获得具优良性状的新品种。
7　染色体物理图谱的构建
前面阐述的遗传图谱均是在染色体减数分裂时DNA 重组率的基础上建立起来的。它只反应标记在
染色体上的相对位置, 并不代表DNA 的实际长度。因此遗传图谱的准确度受到许多因素的影响, 尤其是
重组率。众所周知, 重组率在染色体上的分布是不均匀的, 着丝点附近的重组率比远离着丝点的常染色
质区低得多〔58〕, 从而造成遗传距离与真实物理距离的偏差。因此迫切需要一种技术能将分子标记直接
定位在染色体上, 以绘制染色体的物理图谱。近年来, 随着染色体原位杂交技术的不断发展, 它已成为一
种简单、直观的物理作图方法。
首先该技术被用来定位重复DNA 序列或多拷贝基因, 并显示出了准确、有效的特性。以来自黑麦的
120 bp DNA 重复序列作探针, 对小麦等麦类作物的染色体进行原位杂交, 可以识别所有B 组、G 组及一
些A 组、D 组的染色体〔59〕。Cuadrado 和 Jouve〔60〕将黑麦和小麦的几个高度重复序列在黑麦B 染色体上
进行荧光原位杂交分析, 发现 2 个黑麦重复序列被定位在B 染色体的端部区, 这对研究B 染色体的结构
提供了有力依据。此外多拷贝基因物理作图研究得较为广泛的还有 rDNA 的定位。5S、18S、26S 核糖体
基因的几个新位点, 在小麦、大麦中利用 F ISH 技术已被确立〔61〕。L inares 等〔62〕在燕麦中通过双色荧光原
位杂交的方法, 同时对 5S rDNA , 18S25. 8S226S rDNA 及C 基因组特异性重复序列进行物理定位分析,
推测出二倍体的A 基因组品种可能是多倍体燕麦A 基因组、D 基因组的供体, 这对研究多倍体燕麦的
核型进化极为有利。而对单、低拷贝基因的物理作图, 近年来也取得了很大进展。起初人们常利用同位素
标记的探针对大片段的单拷贝基因进行直接定位。随着近年来非同位素原位杂交技术的发展, 其灵敏度
在不断提高。对于小片段的单拷贝基因, 人们也通过将其插入到BA C 或YA C 克隆上等方式来提高定位
效率。H anson 等〔63〕和 Gom ez 等〔64〕用 F ISH 技术将不同基因的BA C 克隆分别定位在棉花和高粱的染色
体上。M urata 等〔65〕也利用 11 kb 质粒克隆或更大的粘粒克隆, 在拟南芥中定位单拷贝基因。与此同时,
能将多个探针同时定位的多色 F ISH 技术也迅速发展起来。D auw erse 等〔66〕已能同时检测 12 种DNA 探
针分子在染色体上的排列次序及真实的物理距离。随着制片方法及观察设备的改进, F ISH 技术的分辩
率从只能分辩 1 M b 间距离已提高到 1 kb 左右的水平。在分辩率为 1kb 左右时, 探针分子的信号不是 1
个点, 而是许多点构成的信号区域; 其长度是否重叠或间隔均能在显微镜下直接观察到, 这为人和动物
的物理图谱构建提供了极大的便利。最近 F ransz 等〔67〕将这一技术引入植物, 在拟南芥和番茄的DNA 纤
维上进行物理作图, 图谱的分辩率达到了 1 kb 左右的水平。利用分子标记构建物理图谱是基于已有的
标记探针, 即便是缺乏多态性而无法用作常规R FL P 作图分析的分子探针也能在此发挥作用。当然这还
要与其它分子生物学技术相结合, 才能进一步加速染色体物理图谱构建的进程。
28 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　　
8　图谱位点基础上的基因克隆
随着分子生物学技术的发展, 人们关心的另一个焦点便是如何能通过已建立的分子标记图谱分离
重要的质量性状或数量性状基因。也就是说, 植物通常有 3 000～ 6 000 个基因, 基因组DNA 大约覆盖
108～ 1010 bp 的长度, 怎样才能从这样庞大的基因组中分离到目的基因。首先必须确定与目的基因两端
紧密连锁的分子标记, 通常为 R FL P 标记; 再利用染色体步查技术等方法, 从目的基因一端与其紧密连
锁的分子标记开始, 建立一系列末端相互重叠的酵母人工染色体克隆 (YA C s)的重叠群。但由于不是所
有的 YA C 克隆都与目的性状有关, 所以可以将某些候选克隆转化到不具该目的性状的个体中, 通过观
察个体转化后的表达情况来筛选最与目的性状相关的克隆; 并可将这一小段的DNA 进行亚克隆、测序,
最后得到目的基因的全部序列情况, 并掌握如何调控该基因表达等信息, 以便构建植物表达载体进行遗
传工程等研究工作。Putterill 等〔68〕便用染色体步查方法及 YA C 克隆, 从拟南芥中分离了控制开花时间
的Co 基因。Song 等〔69〕用类似的方法, 幸运地通过水稻第十一号染色体上与抗细菌病基因 (X a21) 紧密
连锁的标记R G103, 并借助细菌人工染色体克隆 (BA C s)分离到该抗病基因。事实证明, 这是一项非常复
杂、耗资庞大的工作。到目前为止, 只有少数的几个基因, 包括个别抗虫、抗病基因和数量性状基因
(Q TL )已完成或正在进行克隆。
9　将来的发展方向及应用前景
从前面我们可以看到, 分子标记无论在基因定位、遗传育种、品种识别、比较基因组分析、染色体物
理图谱构建及目的基因克隆等方面都发挥了重要的作用。但要将分子标记广泛而深入地应用到植物学
中的各个领域, 人们还必须注意以下几个方面:
(1) 寻找新类型的多态性分子标记。栽培品种尤其是一些自花授粉的品种, 其遗传多态性程度低,
现有的分子标记手段不能提供大量的多态性标记。因此人们必须寻找新的、能在遗传差异性很低的情况
下检测到大量多态性分子标记的手段。而建立单染色体或染色体片段的特异性文库将是一种寻找新的
多态性分子标记的有效手段〔70〕。R FL P 分析中的探针常来自于基因组或 cDNA 文库。由于受大多数高等
植物基因组含 50%～ 80% 的重复序列等诸多因素的影响, 从中筛选有效探针较难。而特异染色体或染
色体片段文库的构建, 不仅可提供大量的有效标记, 而且对基因的物理定位也极其有利。另一方面, 从
50%～ 80% 重复序列中发掘多态性标记, 也是解决这一问题的关键。只有这样才能加快在栽培品种中建
立高密度遗传连锁图谱的进程。
(2)简化DNA 标记技术。总的来说, 目前的分子标记技术都比较复杂, 限制了其在遗传育种中的广
泛应用。如能发展一些新的非同位素的DNA 探针, 不受限制性内切酶或电泳分离限制的位点特异性
DNA 探针, 或能扩增及直接显示特殊的DNA 序列都能简化DNA 标记技术。新兴的DNA 芯片 (DNA
ch ip s)技术便是有效的简化手段。
(3) 改进分析大基因组的方法和技术。目前分子标记主要应用在植物育种中对目的性状的有效筛
选方面。克隆、分离重要的农艺性状基因的研究才刚刚起步, 但它却是将植物育种学与基础生物学、分子
生物学结合起来的重要环节, 具有广泛的应用前景。因此人们正在着力寻找有效克隆和分离目的基因的
新分子生物学手段及技术。
(4) 提高农艺性状的生物物理分析方法。事实上该领域涉及到的主要研究对象就是农艺性状。因此
如何在不同的环境中有效分析这些性状的物理、化学反应特性及生理状态, 都直接影响着利用分子标记
定位基因及建立遗传连锁图谱等研究。
(5) 提供和保护丰富的种质资源。建立植物的遗传连锁图谱或物理图谱、将外源的理想基因引入栽
培品种等研究工作都是在丰富的种质资源基础上进行的。收集、保护各种种质资源, 并加以妥善的管理,
是有效利用这些资源的关键。实际上这不只是植物学研究领域的问题, 也是保护全球环境, 人类最紧迫
38　第 1 期　　　　　　　　　　周奕华等: 分子标记在植物学中的应用及前景
和最应重视的问题。
人们相信, 随着分子标记技术的不断发展和完善, 遗传连锁图谱和物理图谱的建立将不仅限于少数
的一些作物, 许多作物都能配上一幅精美的基因图谱, 使整个基因组的最基本结构一目了然; 也使人们
对基本遗传成份的观察进入到一个更深的层次, 能更有效、准确地分析某些性状的遗传规律。此外分子
标记的应用也能加速育种进程; 加之在了解物种起源、比较基因组分析、分析遗传变异、分离克隆基因等
方面的应用前景, 都使之越来越受到重视。
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