全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 10001008 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由湖南省科技创新项目(CX2013A012)和国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2015CB150200)资助。
This study was supported by Innovation Foundation of Hunan Province (CX2013A012) and the National Basic Research Program of China
(2015CB150200).
 通讯作者(Corresponding author): 官春云, E-mail: guancy2011@aliyun.com
第一作者联系方式: 刘睿洋, E-mail: ruiyang_liu2007@126.com 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2016-01-11; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160511.1551.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01000
甘蓝型油菜 BnFAD2基因的克隆、表达及功能分析
刘睿洋 刘 芳 官春云*
湖南农业大学农学院 / 国家油料改良中心湖南分中心, 湖南长沙 410128
摘 要: 高油酸油具备较高的营养价值, 在甘蓝型油菜中, 脂肪酸去饱和酶基因(FAD2)是控制油酸含量的关键基因。
本研究克隆了甘蓝型油菜 A5、C5、A1 连锁群上 3 个 BnFAD2 基因的全长 cDNA 序列, 分别命名为 BnFAD2-A5、
BnFAD2-C5和 BnFAD2-A1, 各自编码 384、384、136个氨基酸。分别使用 TMHMM、Clust X软件分析 FAD2基因的
跨膜结构域和酶活中心表明 , BnFAD2-A1 不具备脱氢酶活性。采用酵母功能互补实验对 4 个基因(含已发表的
BnFAD2-C1)进行功能验证, 发现 BnFAD2-A5 和 BnFAD2-C5 基因去饱和能力接近, 均大于 BnFAD2-C1 基因。采用
qRT-PCR 分析 4 个基因在甘蓝型油菜不同组织中的表达规律, 并用血凝素标签法分析 BnFAD2-C1、BnFAD2-A5 和
BnFAD2-C5的蛋白稳定性, 表明 BnFAD2-A5和 BnFAD2-C5是影响油菜种子油酸积累的主效基因。
关键词: 甘蓝型油菜; BnFAD2基因; 生物信息学; 蛋白活力; 蛋白稳定性
Cloning and Expression Analyses for BnFAD2 Genes in Brassica napus
LIU Rui-Yang, LIU Fang, and GUAN Chun-Yun
College of Agronomy, Hunan Agricultural University / National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan Province, Changsha 410128, China
Abstract: The oil containing high oleic acid is high nutritional. In Brassica napus, the fatty acid desaturase gene (FAD2) is the
key gene controlling oleic acid content. In this study, the full-length cDNA sequences of three genes located on chromosome A5,
C5 and A1 in Brassica napus were cloned and named BnFAD2-A5, BnFAD2-C5 and BnFAD2-A1. The three genes encode proteins
with 384, 384, and 136 amino acid residues, respectively. TMHMM was used to predict transmembrane domain and Clust X soft-
ware was used to analyze the activity center of FAD2 genes. Both of the results showed that BnFAD2-A1 did not have the function
of dehydrogenase. The yeast complementary experiment on four genes (including published BnFAD2-C1 gene) showed that the
desaturation capability of BnFAD2-A5 gene was next to that of BnFAD2-C5 gene, and both of them were greater than that of
BnFAD2-C1 gene. The expression patterns of the four genes were analyzed by using qRT-PCR technique in different tissues and
the protein stability of BnFAD2-C1, BnFAD2-A5, and BnFAD2-C5 was analyzed by using Hemagglutinin labeling method. Both
of the results revealed that BnFAD2-A5 and BnFAD2-C5 are major genes affecting the accumulation of oleic acid in B. napus.
Keywords: Brassica napus; BnFAD2; Bioinformation; Protein activity; Protein stability
高油酸菜籽油具备较高的营养价值和氧化稳定
性, 主要因为其含有大量单不饱和脂肪酸和较少量
多不饱和脂肪酸(如亚油酸、亚麻酸)。亚油酸是亚麻
酸的合成前体 , 由脂肪酸去饱和酶 2 (FAD2; EC
1.3.1.25)催化油酸脱氢形成[1]。因此, FAD2是菜籽油
品质改良的关键基因。
Tanhuanpää 等[2]最先在白菜型油菜中进行油酸含
量QTL定位研究, 以白菜型油菜杂交 F2代为作图群体,
发现 2 个控制油酸含量的 QTL, 并将其定位在 FAD2
基因[3]。在甘蓝型油菜中, Schierholt等[4]以高油酸材料
为研究对象, 发现一个控制油酸含量的 QTL 位于 A5
连锁群, 且证明高油酸的性状是由 FAD2 基因突变导
致。Hu 等[5]不仅证实了这一发现, 还在 A1 连锁群上
定位到一个微效 QTL, 控制油酸含量。杨燕宇等[6]也
第 7期 刘睿洋等: 甘蓝型油菜 BnFAD2基因的克隆、表达及功能分析 1001


证实 A5 连锁群上具有一个控制油酸含量 QTL, 并首
次报道在 C5连锁群上具有一个控制油酸含量的 QTL,
认为该 QTL与 A5连锁群 QTL为同源标记。
在甘蓝型油菜基因组中, FAD2基因通常以多拷
贝的形式存在。Scheffler 等[7]利用 Southem 杂交发
现在甘蓝型油菜中, FAD2基因有 4~6个拷贝, 其中 4
个拷贝被分别定位在 Al、C1、A5和 C5连锁群上。
这 4个拷贝中, 位于 C1、A5和 C5连锁群上的 3个
被 Smooker等[8]开发的 FAD2基因标记所证实。肖钢
等[9]根据 FAD2保守序列设计引物, 克隆了甘蓝型油
菜基因组FAD2, 获得了 56条基因序列, 分析认为在
甘蓝型油菜中 FAD2 基因存在 11 个拷贝, 分为有功
能的 5个拷贝和无功能的 6个拷贝[10]。杨庆勇等[11]
借助于白菜、甘蓝基因组数据库, 在油菜基因组中
定位了 4个FAD2基因。近些年关于甘蓝型油菜FAD2
基因拷贝数的研究日渐明确, 但对于该基因的染色
体定位及其功能机制还不十分清楚。
本研究克隆了甘蓝型油菜 A5、C5、A1 连锁群
上共 3 个 BnFAD2 基因的全长 cDNA 序列, 采用生
物信息学和酵母功能互补实验的方法分析 4 个基因
功能, 通过比较 4 个基因在不同组织中的表达规律
及 BnFAD2-C1、BnFAD2-A5和 BnFAD2-C5的蛋白
稳定性, 进一步了解 4 个基因在油酸积累过程中的
功能, 确定其主效功能蛋白。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝型油菜湘油 15 来源于湖南农业大学油料
作物研究所; 酵母菌株 INVSC I 和酵母表达载体
PYES2.0 为湖南省作物基因工程重点实验室的陈信
波教授赠予; 本试验中所用到的引物均由南京金斯
瑞合成。
1.2 BnFAD2基因克隆及全长 cDNA序列扩增
利用已公布的甘蓝型油菜 BnFAD2 基因(NCBI
登录号为 AY577313), 在白菜、甘蓝的基因组数据库
中进行 Blast比对, 发现在 A1、A5、C5染色体上分
别存在 FAD2 基因序列, 根据序列两端的差异碱基
设计了每个 FAD2基因的特异扩增引物 SP。
使用肖钢等[9]设计的 FAD2 基因编码区保守序列
的扩增引物 P1/P2 和特异定位引物 SP (表 1), 以基因
组 DNA为模板进行高保真扩增。将 PCR产物纯化回
收后, 进行加A反应, 然后将其连接到 pMD18-T载体
并转化到大肠杆菌中, 由铂尚公司完成测序工作。
参考Kiefer等[12]的方法, 采用CTAB法提取油菜
总RNA, 按照消化试剂盒(TaRaKa, Japan)说明书操
作, 去除RNA中的基因组DNA。将消化后的RNA按
照Smarter Race cDNA扩增试剂盒说明扩增BnFAD2
基因全长cDNA, 转化大肠杆菌并筛选阳性菌测序。
1.3 BnFAD2基因的表达量分析
根据已获得的全长 cDNA序列, 在该基因 3′UTR
序列区域设计特异性引物进行定量 PCR 检测。引物
序列如表 2所示。采用上述方法提取油菜不同组织及
不同发育时期种子的 RNA, 包括根、花、角果皮(开
花后 10、15、20、25、30、35和 40 d), 种子(开花后
10、15、20、25、30、35 和 40 d)。将 RNA 按照上
述方法消化后, 按照 PrimeScript II 1st Strand cDNA
Synthesis Kit说明书(TaKaRa)进行 cDNA第 1链的合
成, 选择 Actin作为内参基因, 进行定量 PCR检测。

表 1 BnFAD2基因克隆中用到的引物序列
Table 1 List of primers used in experiments to clone BnFAD2 gene
基因
Gene
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
BnFAD2 P1: ATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAG P2: ACTTATTGTTGTACCAGAACACACC
BnFAD2-A1 SP-A1: TCTACCACCTCTCCACAGCCTACTT SP-A1: ACAACAACTTTTAACTCTGTCCTTC
BnFAD2-A5
BnFAD2-C5
SP-A5: ACTTTAATAACGTAACACTGAATAT
SP-C5: CGTAACTCTGAATCTTTTGTCTGTA
SP-A5: TTTCAACGATCCCAAACATAACAGC
SP-C5: TTGTTCTTTCACCATCATCATATCC

表 2 BnFAD2基因拷贝表达检测引物
Table 2 List of primers used for detecting expression quality of BnFAD2 gene
基因
Gene
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
BnFAD2-A1 CGACTTTTCTCTTGGTCTGGTTTAG TGAATAAAAAGTAGGCCTGCAGCCT
BnFAD2-A5 TCCATTTTGTTGTGTTTTCTGACAT TTTCAACGATCCCAAACATAACAGC
BnFAD2-C5 AAAGAACAAAGAAGATATTGTCACG AAAACAAAGACGACCAGAGACAGCA

1002 作 物 学 报 第 42卷


1.4 BnFAD2基因生物信息学分析
1.4.1 BnFAD2 蛋白的跨膜结构域分析 在丹麦技
术大学生物序列中心网站 (http://www.cbs.dtu.dk/
services/)分别使用 TM HMM对跨膜结构域进行预测
分析。
1.4.2 BnFAD2蛋白的酶活中心分析 使用 Clust X
软件, 将大豆[13]、花生[14]、向日葵[15]、玉米[16]、棉
花[17]、拟南芥[1]、红花[18] 9 种植物的 FAD2 基因序
列与 BnFAD2基因的 4个拷贝序列进行比对分析。
1.5 BnFAD2基因在酵母中的功能验证分析
将获得的 BnFAD2 基因连接于 PYES2.0 载体,
采用氯化锂法将其转化到酵母菌株 INVSC I中。参
考徐荣华等[19]的方法培养酵母, 将含有 BnFAD2 拷
贝基因的酵母及含有对照质粒的酵母在尿嘧啶缺陷
的合成完全培养基 (synthetic minimal defined me-
dium lacking uracil, SC-U)抑制培养基(2%葡萄糖)中
220转 min–1振荡培养, 在 30℃条件下培养过夜。当
OD600值为 1.0时, 离心收集菌体, 用 SC-U诱导培养
基(2%半乳糖)重悬菌体至 OD600值为 0.4, 在 220 转
min–1、30℃条件下培养 36 h后, 收集酵母菌体, 低
温冻干, 测定脂肪酸组分。采用 HP 6890N 分析脂
肪酸, 毛细管色谱柱为 Aginent DB-23, 在肖钢等[10]
的方法基础上, 待柱温升至 210℃后, 运行时间延长
至 8 min。
1.6 BnFAD2蛋白的稳定性分析
将 BnFAD2 基因的 4 个拷贝分别与血细胞凝集
素(Haemagg, HA)标签融合, 然后连接到 PYES2.0载
体, 转化至酿酒酵母 INVSC I, 筛选阳性菌株。将已
获得的阳性菌株于 30℃条件下活化培养, 待 OD600
值为 1.0时, 收集菌体备用。
参考O’Quin等[20]的实验方法, 使用含有终浓度
为 2%葡萄糖和 0.5 mg mL–1环己酰亚胺的 SC-U酵
母液体培养基重悬菌体, 在 30℃下培养 8 h, 并在 0、
2、4、6和 8 h时收集相同数量的酵母菌体, 提取总
蛋白, 用于蛋白印迹杂交分析(Western blot)。参照鲁
少平[21]的方法进行 Western blot。一抗使用 HA标签
抗体, 从山羊中提取获得, 二抗使用小鼠抗山羊抗
体, 采用 ECL发光检测。
2 结果与分析
2.1 BnFAD2基因的克隆及全长 cDNA序列扩增
使用保守引物 P1、P2和染色体定位引物 SP, 从
基因组中高保真扩增, 均得到约 1100 bp 长度的片
段(图 1-A, B)。将其转化到大肠杆菌后测序, 获得多
个不同的拷贝序列, 根据油菜与甘蓝、白菜的同源
性, 将这些拷贝分别定位到 A1、A5和 C5染色体上,
分别命名为 BnFAD2-A1、BnFAD2-A5和 BnFAD2-C5。
采用 RACE技术在甘蓝型油菜种子的 cDNA中
克隆 5′UTR和 3′UTR序列, 以确定转录起始位点和
终止位点。以 RACE 试剂盒中 M14R引物为反向引
物, 在 3个 FAD2基因同源区序列设计引物 RACE-F
(5′-CTATGTTGAACCGGATAGGCA-3′)为正向引物 ,
高保真扩增 3′UTR 序列(图 1-D), 并转化大肠杆菌。
大量筛选阳性菌落, 测序。同时, 在编码区内部同源
区设计反向引物 CDS-R (5′-GTGGGATTGCTTTCT
TGAG-3′), 结合试剂盒中的特定正引物(UPM/NUP),
高保真扩增 FAD2 基因 5′UTR 序列(图 1-C)。转化大
肠杆菌并筛选阳性菌测序。BnFAD2-A1、BnFAD2-A5
和 BnFAD2-C5基因中 5′UTR和 3′UTR序列长度分别
为 167、155、155和 166、308和 286 bp。在此基础
上, 以基因组 DNA 为模板, 将 3 个基因从 5′UTR 至
3′UTR序列进行高保真克隆, 得到 3个基因的全长序列。
BnFAD2 基因在油菜基因组中主要由 5′UTR、
CDS、3′UTR及位于 5′UTR内部的内含子(Intron)序
列 4 个部分构成; 其基因的转录由位于 5′UTR 之前
的启动子序列启动, 转录由 5′UTR 第一个碱基起始
至 3′UTR结束。
BnFAD2-A1 基因的开放式阅读框(ORF)长度为
1141 bp, 因其发生了碱基的添加(在 180 位 2 nt,
1009位 1 nt)与删除(在 164位 1 nt, 在 231位 15 nt,
在 409 位 1 nt), 致使其在第 411 位碱基处翻译提前
终止, 共编码 136个氨基酸; 其 5′端存在着一个 159

图 1 FAD2基因编码区序列克隆及 5′UTR、3′UTR扩增
Fig. 1 Cloning of coding sequence of FAD2 and amplification
of 5UTR and 3UTR
A: 使用定位引物 SP对 BnFAD2高保真扩增; B: 使用保守引物
P1、P2对 BnFAD2高保真扩增; C: BnFAD2的 5UTR扩增;
D: BnFAD2的 3UTR扩增.
A: High-fidelity amplification of BnFAD2 by using position primer
SP; B: High-fidelity amplification of BnFAD2 by using conserva-
tive primer P1, P2; C: Amplification of 5UTR of BnFAD2;
D: Amplification of 3UTR of BnFAD2.
第 7期 刘睿洋等: 甘蓝型油菜 BnFAD2基因的克隆、表达及功能分析 1003


bp 的 UTR 序列, 且其内部含有长度为 618 bp 的内
含子, 在 3′末端带有一个 166 bp 的 UTR 序列。
BnFAD2-C1 (已发表)是 BnFAD2-A1的同源基因, 编
码 384个氨基酸。
BnFAD2-A5 基因的 ORF 长度为 1155 bp, 编码
384 个氨基酸, 5′UTR 长度为 155 bp, 其中内含子为
1077 bp, 3′UTR长度为308 bp。BnFAD2-C5基因的ORF
长度为 1155 bp, 编码 384 个氨基酸, 5′UTR 长度为
151 bp, 其中内含子为 1123 bp, 3′UTR长度为 286 bp。
BnFAD2-A1、 BnFAD2-C1 基因分别与白菜
BrFAD2-A1、甘蓝 BoFAD2-C1基因的同源性为 100%;
BnFAD2-A5、BnFAD2-C5 基因分别与白菜 BrFAD
2-A5、甘蓝 BoFAD2-C5 基因的同源性为 98.87%和
99.22%。
2.2 BnFAD2基因的生物信息学分析
由图 2 可知 , 甘蓝型油菜中 BnFAD2-A5、
BnFAD2-C5 和 BnFAD2-C1 蛋白的序列相似度为
96.61%, 其中包含 6 个跨膜结构域和 3 个组氨酸富
集区, 3个组氨酸富集区与铁离子共同构成脱氢酶的
酶活中心[22]。而 BnFAD2-A1 基因的 ORF 出现碱基
缺失及移码突变, 致使其蛋白质缺少了 2个组氨酸
富集区, 无法与铁离子结合构成有功能的酶活中心,
因此, 推测 BnFAD2-A1 基因不具备脂肪酸脱氢酶的
活性。
2.3 BnFAD2基因在酵母中的功能验证
将 4个 BnFAD2基因分别连接到 pYES2.0载体,
然后转入酵母 INVSC I。将转化的酵母涂布于 SC-U
固体平板, 30℃条件下培养 2 d。挑选单菌落于 2 mL
SC-U 液体培养基(2%半乳糖)摇过夜, 收集菌体, 使
用酵母质粒提取试剂盒(天根)提取质粒, 以保守引
物 P1, P2为引物进行 PCR检测。结果如图 3, 酵母
INVSC I自身不含有 FAD2基因, 而转化的酵母均扩
增出约 1100 bp长度的产物, 说明已成功将 BnFAD2
基因转入酵母中。

图 2 BnFAD2蛋白序列分析图
Fig. 2 Analysis of BnFAD2 protein sequence
A: BnFAD2氨基酸序列比对图; B: FAD2蛋白拓扑结构图; “*”代表保守同源序列; “: ”代表高度相似的序列; “.”代表相似度较低的序列; “_”
代表的是预测的跨膜结构域; 灰色阴影区表示组氨酸酶活保守结构域。
A: Sequence alignment of BnFAD2 amino acids; B: The topology graph of FAD2 protein. “*”represents conservative homologous sequences;
“: ”represents highly similar sequences; “.” represents low sequence similarity; “_” represents the predicted transmembrane domain. Gray
shaded area represents conserved histidine domains with activity.
1004 作 物 学 报 第 42卷



图 3 4个 BnFAD2拷贝转化酵母检测结果
Fig. 3 Test results of four copies of BnFAD2 transformed yeast
A: INVSC I; B~E: 依次是转化含有 BnFAD2-A1、BnFAD2-C1、
BnFAD2-A5、BnFAD2-C5的酵母 INVSC I。
A: INVSC I; B–E: The INVSC I transformed with BnFAD2-A1,
BnFAD2-C1, BnFAD2-A5, and BnFAD2-C5.

经生物信息学预测已知, BnFAD2-A1 基因不具
备脂肪酸脱氢酶的活性, 其他 3个基因功能尚未可
知。为了研究 3个基因活性差异并进一步验证 BnFAD2-
A1 蛋白的功能活性, 将 4 个基因分别转入酵母采用
气相色谱分析脂肪酸组分。在阴性对照中, 酵母的
脂肪酸色谱图上只有棕榈酸 (16:0)、棕榈一烯酸
(16:1)、硬脂酸(C18:0)和油酸(C18:1), 因此酿酒酵母
INVSC I是一种天然的 FAD2基因突变体, 适合于检
测 BnFAD2基因功能的分析(图 4-A)。在图 4-C, E中,
气相色谱图上出现了棕榈二烯酸 (16:2)和亚油酸
(18:2)的特异脂肪酸峰 , 这意味着 BnFAD2-C1、
BnFAD2-A5、BnFAD2-C5 完全具备脱氢酶的活性。
与此同时, 含有 BnFAD2-A1 基因的酵母菌株则没
有检测到这 2 个特异性的脂肪酸峰, 说明 BnFAD2-
A1 基因不具备油酸脱氢酶功能, 是假基因。这与生
物信息学分析的结果一致。
由于棕榈二烯酸 (16:2)和亚油酸 (18:2)均是由
BnFAD2 基因将其相应底物脱氢而生成, 因此我们
以二者在脂肪酸中所占的比例来表示 BnFAD2-C1、
BnFAD2-A5、BnFAD2-C5 基因脂肪酸脱氢酶活性的
大小, 结果显示, BnFAD2-A5 和 BnFAD2-C5 活性较
为接近, 显著高于 BnFAD2-C1。
2.4 BnFAD2基因的表达分析
图 5-A表明, BnFAD2表达量随着种子成熟度加
深而先上升后下降, 在授粉后 25 d 达到顶峰; 其中
B n FA D 2 - A5 表达起伏平缓 , 而 Bn FA D2 -A1、
BnFAD2-C1、BnFAD2-C5在第 15~25 d期间, 表达量
大幅上调, 而后迅速下降, 表明该时期三者共同受

图 4 酵母脂肪酸气相色谱分析
Fig. 4 Gas chromatographic analysis of fatty acid in yeast
A: 含有 PYES2.0空载体的酿酒酵母脂肪酸组分分析; B~E: 含有 PYES2.0+BnFAD2-A1/C1/A5/C5拷贝基因的转基因酿酒酵母脂肪酸组
分分析; F: BnFAD2-C1/A5/C5基因去饱和能力比较分析, 标示不同字母的柱值差异显著。
A: analysis of fatty acid component of Saccharomyces cerevisiae containing PYES2.0 empty vector; B–E: analysis of transgenic
Saccharomyces cerevisiae fatty acid component comprising PYES2.0 + BnFAD2-A1/C1/A5/C5 copies; F: comparative analysis of
desaturation capability of BnFAD2-C1/A5/C5 genes; Bans superscripted by different letters are significantly different.
第 7期 刘睿洋等: 甘蓝型油菜 BnFAD2基因的克隆、表达及功能分析 1005


到某种因素调节。从整体上看, BnFAD2-C5的表达量
最高, 其次是 BnFAD2-A1和BnFAD2-A5, 而 BnFAD2-C1
表达量最低。BnFAD2-A1 经证明并没有脱氢酶的活
性, BnFAD2-C1蛋白脱氢酶活性最弱, 因此认为, 在
种子中对油酸消减的主效基因是 BnFAD2-A5 和
BnFAD2-C5。据表达规律, BnFAD2-A5基因应属于
组成型表达基因, 而 BnFAD2-C5 基因表达规律更接
近于为诱导增强型表达。
在角果皮中(图 5-B), BnFAD2-A5、BnFAD2-C5
与另外 2 个拷贝相比更加活跃, 且表达变化不明显;
但 BnFAD2-A1在油菜即将成熟时出现大幅上调。
在油菜的花和根中 (图 5-C), BnFAD2-A5 和
BnFAD2-C5仍然维持着较高的表达量; 在根组织中,
BnFAD2-A5 的表达量高于 BnFAD2-C5, 而在花中
BnFAD2-A5 的表达量要低于 BnFAD2-C5, 推测
BnFAD2-A5主要负责根细胞多不饱和脂肪酸的合成,
而 BnFAD2-C5负责花器官多不饱和脂肪酸的合成。
BnFAD2-A1 在根组织中的表达量接近于 0, 在花中
的表达量较高, 仅次于 BnFAD2-C5。
2.5 BnFAD2蛋白稳定性分析
将 HA标签插入 BnFAD2基因的 5′端, 对其蛋白
定量示踪(图 6-A)。显示, 随着时间的推移, BnFAD2-

图 5 BnFAD2基因的表达
Fig. 5 Expression of BnFAD2 genes
A: 油菜种子不同发育时期 4个 BnFAD2基因表达模式; B: 油菜角果皮不同发育时期 4个 BnFAD2基因表达模式; C: 油菜不同组织 4
个 BnFAD2基因表达模式。
A: Four copies of BnFAD2 genes at different developmental stages in rape seeds; B: BnFAD2 genes in different developmental stages in rape
sillique walls; C: Four copies of BnFAD2 genes in different organizations in rape seed.

图 6 BnFAD2蛋白的稳定性分析
Fig. 6 Stability analysis of BnFAD2 protein
A: HA标签插入 BnFAD2结构图; B: BnFAD2蛋白随时间衰减的 Western图; C: BnFAD2蛋白随时间衰减的曲线图。
A: Chart of that HA tag inserted into BnFAD2; B: The western blot figure of decaying of BnFAD2 protein; C: The graph of decaying of
BnFAD2 protein.
1006 作 物 学 报 第 42卷


A5、BnFAD2-C5、BnFAD2-C1的蛋白含量不断减少。
在 8 h时, BnFAD2-A5、BnFAD2-C5的蛋白残存量为
原有的 50%, 而 BnFAD2-C1 为原有的 25%; 这说明
BnFAD2-A5、BnFAD2-C5 的蛋白较之 BnFAD2-C1
更加稳定。在同等情况下, 细胞中始终会保持较高
含量的 BnFAD2-A5 和 BnFAD2-C5, 发挥油酸脱氢
酶的功能(图 6-B)。
利用 Quality One软件将 Western杂交斑点数字
化 , 并绘制衰减曲线 , 结果表明 , BnFAD2-A5 与
BnFAD2-C5 蛋白衰减曲线十分接近, 说明二者的蛋
白稳定性相同; BnFAD2-C1 的蛋白衰减曲线下滑速
率显著高于 BnFAD2-A5和 BnFAD-C5, 其蛋白的稳
定性较差。
3 讨论
油菜油酸含量 QTL 最先是由 Tanhuanpää 等[2]
在白菜型油菜(Brassica rapa ssp. oleifera)中定位的,
使用白菜型油菜杂交 F2代群体作为作图群体, 找到
2 个控制油酸含量的 QTL。在甘蓝型油菜中 ,
Schierholt 等[4]用高油酸材料发现在 A5 连锁群上存
在一个控制油酸含量的 QTL, 并证明高油酸是
FAD2 基因突变的结果, 随后这个发现被 Hu 等[5]证
实, 并发现 A1 连锁群上存在一个控制油酸含量的
微效 QTL。Mahmood 等[23]研究发现, 在 A8 连锁群
上存在 1个油酸含量主效 QTL。Smooker等[8]、Burns
等[24]和 Zhao等[25]研究表明, 在 C8连锁群上还有一
个油酸含量主效 QTL。张洁夫等[26]和 Smooker等[8]
在 C3连锁群还发现了另一个油酸含量的主效 QTL。
在芥菜型油菜中, 这种油酸含量主效 QTL同时也是
芥酸含量主效QTL并且与 FAE基因相关的现象是与
甘蓝型油菜一致的[23]。
基于甘蓝型油菜湘油 15为当前普遍种植的低油
酸油菜的代表品种(油酸含量为 62%), FAD2 是目前
定位到与油酸相关的关键基因 , 本研究克隆到
BnFAD2 基因的多个拷贝序列, 经比对验证, 发现在
甘蓝型油菜基因组中只有 4个拷贝, 并分别定位于
A1、C1、A5、C5 染色体上, 这与前人的研究结果
一致。
植物 FAD2 蛋白一般定位于细胞内质网中 ,
FAD2 蛋白在翻译的同时依赖于其第一个疏水跨膜
区作为 N端的信号序列与信号识别颗粒 SRP (signal
recongnition particle)相互作用, 插入到内质网膜上,
便于蛋白的跨膜运输[27]。组氨酸富集区常作为酶活
性中心, 参与蛋白功能发挥。BnFAD2-A1 编码的蛋
白只有正常 BnFAD2 蛋白前端的 136 个氨基酸, 缺
少 2 个组氨酸富集区, 因此 BnFAD2-A1 基因不具备
脱氢酶的活性 , 这已在酵母功能实验中得到了证
实。甘蓝型油菜中A基因组来源于白菜[28], Jung等[29]
发现白菜中含有两个 FAD2 拷贝, 其中一个不具备
功能; 肖刚等[10]克隆到长度为 1141 bp的假基因, 经
序 列 比 对 分 析 , 该 假 基 因 即 为 本 研 究 中 的
BnFAD2-A1。虽然 BnFAD2-A1 是假基因, 但其在种
子、花和角果皮中表达却异常活跃。假基因即与功
能基因相关的、有缺陷的序列, 不受进化的负选择
作用, 因此, 可为物种进化的正选择、负选择以及中
性漂变提供丰富的原材料, 成为物种进化不可缺少
的有用工具[30]。
由于 BnFAD2-A1 是假基因, 那么在油菜种子油
酯合成期发挥油酸消减功能的基因就是 BnFAD2-
C1、BnFAD2-A5、BnFAD2-C5。对于消减功能的发
挥起重要作用的因素是蛋白稳定性, 且不同蛋白稳
定性存在差异, 这一差异削弱了基因表达量与蛋白
含量之间的关系。O’Quin 等 [31]利用血细胞凝集素
(Haemagg, HA)标签法成功检测了拟南芥 FAD2和油
菜 FAD3蛋白的稳定性。在此, 我们利用 HA标签定
量 示 踪 BnFAD2 蛋 白 , 发 现 BnFAD2-A5 与
BnFAD2-C5 蛋白衰减趋势接近, 稳定性相同; 较之
BnFAD2-C1蛋白稳定性更强。
BnFAD2-A5和 BnFAD2-C5的基因表达量、脂肪
酸脱氢酶活性及蛋白稳定性均明显高于 BnFAD2-C1,
这意味着在单位时间内种子细胞中含有较多的
BnFAD2-A5 和 BnFAD2-C5 蛋白在对油酸磷脂胆碱
发生高效的消减作用; 同时 BnFAD2-C5基因的表达
量高于 BnFAD2-A5, 因此推断, BnFAD2基因的功能
发挥是以 BnFAD2-C5为主, BnFAD2-A5辅助完成油
菜种子中油酸的消减作用。然而 , 大量的高油酸
QTL 实验结果表明, BnFAD2-A5 是消减油酸的主效
基因[2,4,32], 而 BnFAD2-C5基因的作用较小。这表明,
在 BnFAD2-A5、BnFAD2-C5蛋白对油酸脱氢的过程
中, 仍然存在某种机制在对其功能调控, 而这种机
制目前尚未可知, 有待进一步探索研究。
4 结论
甘蓝型油菜只有 4个BnFAD2基因, 已克隆到其
全长 cDNA 序列, 其中 BnFAD2-C1、BnFAD2-A5 和
BnFAD2-C5 具备正常的脂肪酸脱氢酶功能 , 而
第 7期 刘睿洋等: 甘蓝型油菜 BnFAD2基因的克隆、表达及功能分析 1007


BnFAD2-A1为假基因, 不具备这一功能。BnFAD2-A5
和 BnFAD2-C5在基因表达、脂肪酸脱氢酶活性及蛋
白稳定性上均明显高于 BnFAD2-C1, 这意味着二者
是控制种子油酸消减作用的主效基因。
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