全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(5): 837−844 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(SS2012AA100107, 2012AA10A300), 国家自然科学基金项目(30900901和 31271740/
c130403), 国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08003-003)和四川省教育厅面上基金(11ZB123)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 潘光堂, 张志明, E-mail: panlab605@gmail.com, Tel: 028-86290917
第一作者联系方式: E-mail: luomao20050908@yahoo.cn **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-09-03; Accepted(接受日期): 2012-12-11; Published online(网络出版日期): 2013-02-19.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130219.1021.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00837
玉米纹枯病胁迫相关miRNA功能研究
罗 茂 1,** 彭 华 2,** 宋 锐 2 高 健 2 潘光堂 2,* 张志明 2,*
1 泸州医学院药物与功能性食品研究中心, 四川泸州 646000; 2 四川农业大学玉米研究所, 四川温江 611130
摘 要: microRNA (miRNA)是一类内源性的、19~24个碱基长度的小分子非编码 RNA, 通过碱基互补调控靶基因的
表达, 参与调控植物生长发育, 并在多种非生物与生物胁迫响应中发挥重要作用。但目前关于玉米纹枯病胁迫相关
miRNA表达调节与功能尚不完全清楚。利用生物信息学挖掘玉米中的 microRNA及其靶基因, 筛选到 23条新的玉米
miRNA, 预测到 89个靶基因。本文在前期研究基础上, 以对纹枯病抗性不同的自交系 R15和掖 478作为对象, 采用
半定量方法对预测获得部分 miRNA 前体初步鉴定, 采用实时荧光定量 PCR 手段对 R15 和掖 478 中表达存在差异的
成熟 miRNA进行抗纹枯病组织特异性表达验证。结果提示, 部分 miRNA在玉米抗纹枯病胁迫过程中可能起着重要
的调控作用。
关键词: miRNA; 半定量; 实时荧光定量 PCR; 玉米
Functional Analysis of miRNA Resistant to Banded Leaf-Sheath Blight in
Maize
LUO Mao1,**, PENG Hua2,**, SONG Rui2, GAO Jian2, PAN Guang-Tang2,*, and ZHANG Zhi-Ming2,*
1 Research Center for Drug Discovery of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China; 2 Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of
Maize in Southwest Region, Ministry of Agriculture, Maize Research Institute of Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China
Abstract: microRNAs (miRNAs) are an extensive class of endogenous, non-coding, short (19–24 nt) RNA molecules, which
directly involve in regulating gene expression at the post-transcriptional level and play important roles in the regulation of plant
growth and development, and in response to various abiotic and biotic stress. However, the miRNAs-regulated networks and func-
tion in response to Banded Leaf-Sheath Blight are not clear in Zea mays. In our previous studies, miRNAs and their target genes
in maize were excavated by bioinformatic prediction, and a total of 23 conserved miRNAs and 89 miRNA targets were predicted
and identified by a web-based integrated computing system and WMD 3. In this paper, based on previous studies, we profiled the
responsive functions of miRNAs under BLSB stress, preliminarily identified the precursor of miRNAs in BLSB-stressed Zea
mays (R15 and Ye 478) using semi-quantitative RT-PCR and detected the level of mature miRNAs under BLSB stress. The result
showed that some miRNAs play very important roles in response to BLSB in Zea mays.
Keywords: miRNA; Semi-quantitative RT-PCR; QPCR; Zea mays
玉米纹枯病 (Banded Leaf and Sheath Blight,
BLSB)是国内外玉米产区广泛发生且危害严重的病
害[1-2]。当前, 随着玉米种植面积扩大, 玉米杂交种
的推广应用, 施肥量及种植密度的提高, 玉米纹枯
病的发生、发展以及蔓延日趋严重, 已成为我国玉
米产区的主要病害之一, 严重影响玉米产量和品质
性状的提高。国内外关于玉米纹枯病的病害研究主
要集中在病原菌的分离鉴定、抗病资源的筛选以及
基于不同作图群体的 QTL定位等, 关于抗病机制的
研究则主要集中在某些生理生化指标上, 而对于抗
病基因的克隆、功能鉴定以及抗病基因表达调控的
分子机理等方面的研究报道尚少[3-4]。目前, 部分研
究揭示少量玉米抗纹枯病相关抗病基因、防御酶和
功能蛋白, 使得玉米抗纹枯病机制研究取得较大进
838 作 物 学 报 第 39卷

展[5-7], 但是大量玉米纹枯病胁迫应答基因功能并非
孤立作用的, 对其复杂分子调控机制网络的研究仍
有限。
miRNA是一类内源性的、19~24个碱基长度的
小分子非编码 RNA, 是真核生物基因表达中的一类
负调控因子, 它可以通过与靶基因 mRNA 分子完全
或部分匹配, 指导 mRNA 剪切或者抑止翻译等方式
来调节植物基因的表达, 参与调控植物生长发育各
个方面以及逆境胁迫响应等生物学过程[8-11]。研究表
明, miRNA 能够调控某些抗病途径中的关键靶基因
来抵御病菌的入侵。在已知的众多参与植物抗逆过
程的 miRNA 中, miR393 是第一个被发现受病原菌
侵染负调控的 miRNA, 它通过负调控其靶基因生长
素受体蛋白(TIR1 和 AFBs)的表达进而响应病原菌
胁迫 [12-14]。目前, 生物逆境胁迫(病原菌侵染)相关
miRNA 研究已见报道, 但纹枯病胁迫相关 miRNA
研究尚少, 作用机制仍不明确。
本研究前期利用生物信息学挖掘玉米中的
microRNA及其靶基因, 通过对拟南芥、水稻等植物
已知的 miRNA 与玉米 EST 和 GSS 数据库的比对,
并设置一系列严格的筛选标准, 共筛选到 23条新的
玉米 miRNA[15]; 利用 WMD 3在线植物 miRNA 靶
基因预测软件, 对新发现的玉米 miRNA靶基因预测,
总共预测到 89个靶基因[15]。本文在前期研究基础上,
以对纹枯病抗性不同的自交系 R15和掖 478作为研
究对象, 采用半定量方法对预测获得部分miRNA的
前体进行初步鉴定, 以实时定量 PCR手段对 R15和
478中表达存在差异的成熟miRNA进行抗纹枯病组
织特异性表达验证, 初步探讨miRNA与玉米抗真菌
病害调控机制的关系。
1 材料与方法
1.1 试材及处理
耐病材料 R15和感病材料掖 478由四川农业大
学玉米研究所选育; 接菌菌种为纹枯病优势病菌群
AG1-IA, 由四川农业大学植物病理课题组提供。
分别盆栽 R15 和掖 478, 待长至拔节期接菌
AG1-IA。选取高度、生长状况相同的玉米接菌, 并
留取 1 株作为对照。用灭菌的牙签将一小块长满菌
的培养基插入选取玉米的相同位置的叶片的叶鞘中,
并用喷雾器将接菌处湿润, 用保鲜膜覆盖保湿。在
接菌后 0、12 和 24 h, 取接近接菌叶鞘部位的叶片
和相应部位叶鞘长 10~15 cm、重 1 g为试材, 重复 3
次。
mirVana miRNA Isolation Kit购自 Ambion公司;
Trizol、DEPC购自 Invotrigen公司; Small RNA Gel
Extraction Kit、 Small RNA cloning Kit、 SYBR
PrimeScript RT-PCR Kit、DNAmate、DL2000 DNA
Ladder Marker, 20 bp DNA Ladder Marker 、
pMD18-T、逆转录试剂盒购自 TOYOBO公司; DNA
回收试剂盒、Real MasterMix (SYBR Green)、Golden
Easy PCR System、Ampicillin购自 TIANGEN公司; E.
coli poly(A) Polymerase、rATP购自NEB公司; DNase
I购自 Sigma公司; DH5α由本实验室保存; PCR引物
由 Invitrogen公司合成。
1.2 生物信息学分析
利用 miRBase 数据库收录的植物 miRNA 序列
为探针与玉米的 EST和GSS数据库比对, 共发现 23
条新的玉米 miRNA, 利用 miRU (http://bioinfo3.
noble.org/miRNA/miRU.htm)和 WMD 3 (http://wmd3.
weigelworld.org/)在线植物靶基因预测软件共预测
到 89个潜在的靶基因, 生物信息学具体分析方法、
预测所得miRNA及其前体信息等结果见张志明等[15]。
基于前期所获结果, 本研究筛选其中前体表达有差
异的 miRNA 及目前研究已报道逆境胁迫响应相关
的已知 zma-miR171 [16-17]和 zma-miR319 [11,18-20]等进
行后续实验验证, 并利用miRU和WMD 3在线靶基
因预测软件的最新比对数据库 Zea mays EST
ZmGI-19.0和 Zea mays ZmB73 v4a. 53 (MGC)对所
选 miRNA重新预测靶基因并功能分类。
1.3 半定量 RT-PCR检测 miRNA前体表达
1.3.1 总 RNA提取及其反转录 按照 Invotrigen
公司 TRIzol 试剂盒说明书步骤并作一定改进, 提取
R15和掖 478各时间段的接菌部位叶片总 RNA。取
2 µL RNA原液稀释至 10 µL进行 1%琼脂糖凝胶电
泳检测, 之后将各样品总 RNA 采用 TOYOBO 公司
逆转录试剂盒反转录为 cDNA。
1.3.2 设计前体引物并进行半定量 PCR 扩增电泳
检测 将反转录的溶液 2 µL稀释至 20 µL, 取 0.5
µL为模板, 以内参基因引物作 PCR并电泳检测。通
过检测的条带亮度, 将各 cDNA的浓度调整为一致。
将本研究前期通过生物信息学同源预测获得的
miRNA 前体及前期克隆获得的 miR168b 的前体通
过 primer 5设计相关的引物(表 1)。以调整后的反转
录溶液为模板 , 玉米 β-actin 为内参基因 , 进行
miRNA前体引物 PCR扩增并电泳检测。
第 5期 罗 茂等: 玉米纹枯病胁迫相关 miRNA功能研究 839


表 1 miRNA前体引物及内参引物
Table 1 Primers of precursors of miRNA and β-actin
引物
Primer
序列
Sequence (5–3)
pre-miR165 F: TCGTGGTCGTCATCGTC; R: GGAATGTTGTCTGGTTGGAG
pre-miR173 F: GCTATTGACTGGGCTGTG; R: GAAGGGGCTCCAAAGAT
pre-miR437 F: CGACCTTTCACCTTTGC; R: ACCTACTCCCTCCATTTCA
pre-miR810 F: TGCTACTTCTGGCACCTACA; R: CGGAGAAAACCCCAGAG
pre-miR819 F: GCAGCACGAACTCCAAA; R: AGCATTGCCCACATTCA
pre-miR853 F: ATCTGGAATGATTGAGGGTG; R: GCACCAACCTTAGCAAAACT
pre-miR845 F: TCTCCTTCTTGCCGTGAT; R: TTTCAGTTTCGCCCTATTC
pre-miR1027 F: AAACAAATCCGAGCAAACTG; R: CCTGTCCTCTTTGCTTGTTAT
pre-miR168-1 F: GCTCGCTTGGTGCAGAT; R: GGCTCCGATTCACTTGAT
pre-miR168-2 F: GGGAGAAGAAGCGAAGC; R: GACACGGAGTCACAGCAAT
β-actin F: GTGACCTTACCGACAACC; R: CCAATACCAGGGAACATAG

1.4 RNA 加尾-引物延伸实时荧光定量 PCR 法
实时定量检测候选 miRNA表达
半定量检测预测所得的 microRNA 前体中, 发
现前体表达有所差异的 microRNA 通过设计特异性
引物, 采用改进的RNA加尾和引物延伸实时荧光定
量 PCR法实时定量检测组织中的microRNA表达(表
2)。以玉米 5S rRNA 为内参基因 , 分别取接菌
AG1-AI后的 R15 (耐病材料) 0 h叶、12 h叶、12 h
叶鞘, 掖 478 (高感材料) 0 h叶、12 h叶、12 h叶鞘
共 6个样品进行RNA加尾和引物延伸后实时荧光定
量 PCR, 检测 miRNA加尾产物的相对表达量, 确定
miRNA在 2个材料接菌后各部位阶段之间表达量的
差异。

表 2 miRNA引物及内参引物
Table 2 Primers of miRNAs and 5S rRNA
引物
Primer
序列
Sequence (5–3)
5S rRNA TAAGGTAGCGGCGAGACGAGC
miR165 GGGAATGTTGTCTTGGTTGGAAA
miR168b TGGTGCAGATCGGGACAAAAAA
miR168b* TGCATCAAGTGAATAAAAA
miR173 GCGCTTGCAGAGTGAAATCATAAA
miR171 GAGCCGTGCCAATATCACAAA
miR319 ACTGAAGGGTGCTCCCAAAA
Universal reverse primer TCAACGATACGCTACGTAACG

2 结果与分析
2.1 miRNA前体半定量结果
R15、掖 478接菌后 0 h、12 h、24 h分别取样
提取总 RNA, 总共 6个样品。本实验提取的总 RNA
经 Beckman 分光光度计分析, 其 A260-A320/A280-A320
值均在 1.9~2.1范围内。取 2 µL样品 RNA原液稀释
至 10 µL, 采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测(图 1)。

图 1 各材料总 RNA电泳图
Fig. 1 Total RNA electrophoretogram for the samples

采用 pMD18-T反转录试剂盒, 将 6个样品反转
录为 cDNA。将获得的样品 cDNA经 Beckman分光
光度计分析, 其A260-A320/A280-A320值均在 1.7~1.9范
围内。
采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 , 电压 100 V,
Marker 为 DL2000。据检测结果 , 调整各个样品
cDNA 的浓度使其一致。由图 2 可知, 各个样品的
cDNA浓度一致, 可进行下一步半定量检测实验。

图 2 各材料内参基因电泳图
Fig. 2 Electrophoretogram of various materials β-actin gene

将扩出单一条带的引物, 通过其最适合的退火
温度进行 PCR 扩增, 并用新胶和新缓冲液 1%琼脂
糖凝胶电泳检测。在扩增的结果中, 有 5 条前体扩
增的片段在各个样品中的亮度基本一致, 没有太大
差异, 获得的 miRNA 前体片段分别是 miR437、
miR810、miR819、miR853 和 miR1027 引物扩增的
前体片段, 扩增的结果中有差异的引物也有 5 对,
840 作 物 学 报 第 39卷

获得的 miRNA前体片段分别为 miR165、miR173、
miR845、miR168b和 miR168b* (图 3), 其表达差异
主要表现为在从 0~24 h R15 接菌后各处理中
miRNA前体的表达量呈现出一定的上升趋势。

图 3 miRNA前体电泳图
Fig. 3 Electrophoretogram of precursors of miRNAs

2.2 实时荧光定量 PCR检测 miRNA表达结果
2.2.1 miRNA真实性鉴定 由图 4可以看出, 内
参长度在 150 bp 左右 , 条带单一清晰。各成熟
miRNA在样品 cDNA模板中扩增后目标产物均为单
一条带, 且符合条带大小, 即内参为 150 bp 左右,
miRNA引物扩增片段为 80 bp左右, 符合荧光定量
试验要求。

图 4 miRNA加尾后扩增片段电泳检测图谱
Fig. 4 Electrophoretogram for miRNA tailed with poly A
1–3: 478-L 0h 5S rRNA, 478-L 12h 5S rRNA, 478-S 12h 5S rRNA;
4–5: R15-L 0h 5S rRNA、R15-L 12h 5S rRNA; 6–11: 478-L 0h
miR168b*, 478-L 12h miR168b*, 478-S 12h miR168b*, 478-L 0h
miR168b, 478-L 12h miR168b, 478-S 12h miR168b; 12–14: R15-S
12h 5S rRNA, miR171, miR319; 15–18: miR168b*, miR168b,
miR173, and miR365.

2.2.2 各 miRNA 在 R15 和掖 478 接菌后不同部位
的相对表达量 以 5S rRNA 为内参基因, 将掖
478接菌后 0 h的叶处理中 miRNA表达量作为对照,
设其表达量设为 1, 分别计算出各材料处理中的
miRNA 相对于掖 478 表达量的表达倍数(图 5)。5S
rRNA和候选 miRNA标准曲线及熔解曲线结果未显
示 , 标准曲线的相关系数 R2>0.99, 扩增效率在
80%~120%之间 , 符合标准曲线相关标准 ; 熔解曲
线均为单一峰, 没有其他杂峰, 表明扩增产物特异
性较高。
miR165在 R15和掖 478 0 h、12 h的叶处理中
表达量的没有显著差异, 而在其相应的叶鞘处理与
叶处理中 miR165 表达量均存在极显著差异, 且表
现极显著上调表达, 差异倍数分别约为 3.0 倍和 5.5
倍。此外, miR165在 2个材料的 12 h叶鞘处理中表
达量也存在显著差异, R15 (耐)是掖 478 (感)的 2倍。
从图 5可以看出, 在掖 478中 miR171的表达量
有下调趋势, 但差异很小, 而在 R15中 miR171的表
达量有一个明显的下调趋势。在 R15各处理中其表
达量均比对应的掖 478 的表达量更少, 统计分析表
明 2 个材料相应各处理间存在极显著差异。在两材
料中 12 h 的叶鞘处理中 miR171 表达量差异最大,
R15 (耐)表达量约为掖 478 (感)的 1/7。
miR173在两材料中 0 h、12 h的叶和叶鞘处理
的相对表达量呈上升趋势, 并在 12 h叶鞘中表达量
最多, 其趋势与 miR165 类似。统计分析表明, 在 2
个材料的 0 h、12 h的叶中的 miR173表达量没有明
显差异, 而在两材料 12 h的叶鞘中表达量存在极显
著差异, R15 (耐)约为掖 478 (感)的 2倍。
miR319 在两材料的各处理中均存在显著差异,
且 R15的表达量均低于掖 478。miR319在两材料 12
h的叶及叶鞘处理中的表达量相对于 0 h对照的表达
量明显减少, 呈现出下调趋势, 均下调为对照处理
的 1/2 左右。由此可以看出, 掖 478 和 R15 在接菌
后自身均具一定的反应措施, 其表达量均下调, 尤
以 R15 (耐)下调更低。
miR168/miR168*在两材料的各处理中均存在
显著差异, 掖 478 12 h叶鞘中miR168表达量较叶处
理中高, 差异约 3倍, R15的各处理中 miR168表达
量呈上升趋势 , 并在 12 h 叶鞘中表达量最高。
miR168*在两材料中 0 h、12 h的叶和叶鞘处理的相
对表达量呈上升趋势, 处理后 12 h叶鞘中表达量最
高, 较相应对照中表达量差异达 5 倍左右。结果表
明, 在植物叶鞘(接菌部位)中, 各 miRNA 的量差异
最显著, 提示可能与植物叶鞘(接菌部位)最先受到
外源病原物入侵, 而植物通过调控相关基因在病原
菌入侵部位(叶鞘)做出应答反应更显著有关。
2.3 miRNA的靶基因预测
预测共获得靶基因总数 27个, 与前期研究结果
一致[15]。这些靶基因主要涉及玉米的生长发育、代
谢调节、信号转导、转录因子及逆境胁迫响应等, 并
且 miRNA 倾向于靶定转录因子, 共获得 10 个转录
因子, 占预测靶基因总数的 37.04% (表 3)。
第 5期 罗 茂等: 玉米纹枯病胁迫相关 miRNA功能研究 841



图 5 miRNA相对表达量
Fig. 5 Relative expression patterns of miRNA
1; 2: 478-L 0h; 2: 478-L 12h; 3: 478-S 12h; 4: R15-L 0h; 5: R15-L 12h; 6: R15-S 12h.

3 讨论
3.1 zma-miR168b/zma-miR168b*参与自身代谢
负反馈调节途径
zma-miR168b/zma-miR168b*的靶基因AGO1蛋
白(ARGONAUTE1)与 miRNA 的生物合成与功能途
径密切相关, 已有研究揭示 zma-miR168a 靶向调控
AGO1蛋白是一类miRNA参与的自身代谢负反馈调
节[21]。推测本研究中 zma-miR168的上调表达, 导致
靶标 AGO1 表达量降低, 由于其自身反馈调节功能
的存在, AGO1 表达量降低又会导致大量抗病相关
miRNA 调控的抗病相关靶基因在玉米叶和叶鞘组
织中积累, 从而加强植物抗病原菌胁迫能力。
3.2 zma-miR171 调控转录因子相关激素信号通
路并调节叶物理抗性
zma-miR171 的靶基因主要为 GRAS 结构域的
SCL6转录因子和纤维连接蛋白(fibronectin)。GRAS
转录因子在植物生长发育和逆境胁迫响应过程中均
发挥重要作用, 它能够参与并调控多项植物发育和
逆境胁迫相关信号传导途径, 也能在有毒物质入侵
时通过与部分基因蛋白互作产生广谱性解毒功能[22],
如 Zhang 等[16]研究发现 miR171 受低温胁迫诱导表
达; Zhou 等[20]研究发现 miR171 受重金属胁迫诱导
发生差异表达; Kasschau 等[17]研究发现 zma-miR171
通过下调表达响应病毒胁迫。在本试验中 , zma-
miR171在接菌处理中呈下调表达趋势, 在耐病材料
R15的 12 h叶鞘处理中下调表达最为显著, 且明显
低于感病材料掖 478的相同处理, 推测miR171可能
通过负调控靶基因 GRAS 转录因子使其上调表达,
参与抗病相关激素信号传导途径, 通过信号级联不
断传递放大, 启动激素信号传导通路并协助泛素连
接酶与转录抑制因子的相互作用, 并使其通过泛素
/26S 蛋白酶体降解途径降解[23], 最终激活下游激素
信号通路, 启动植物体内防御基因的表达, 表达产
物作为信号分子不断传递放大, 使植物感知信号并
随即作出应答 , 最终响应病原菌胁迫过程。
zma-miR171 的另一个靶基因纤维连接蛋白与植物
细胞壁组成有关, 推测 miR171的下调表达, 使玉米
表 3 miRNA靶基因相关信息
Table 3 Information about target genes of miRNA
miRNA 序列
Sequence (5–3)
靶基因 ID
Target gene ID
靶基因功能
Function of target gene
调控位点
Regulatory site (5–3)
杂交自由能
Hybridization energy (kcal mol−1)
zma-miR168 UCGCUUGGUGCAGAUCGGGAC GRMZM2G039455 Argonaute, PAZ; stem cell self-renewal protein Piwi 590–610 –40.11
GRMZM2G441583 Argonaute, stem cell self-renewal protein Piwi 625–645 –40.11
zma-miR171 UUGAGCCGUGCCAAUAUCACA GRMZM2G098800 GRAS transcription factor 1388–1408 –40.47
GRMZM2G079470 GRAS transcription factor 1195–1215 –40.47
GRMZM2G055263 GRAS transcription factor 441–461 –38.39
GRMZM2G021471 Fibronectin, type III-like fold; fibronectin, type III 581–601 –35.26
GRMZM2G051785 GRAS transcription factor 674–694 –40.47
GRMZM2G418899 GRAS transcription factor 42–62 –40.47
GRMZM2G079980 GRAS transcription factor 499–519 –40.47
GRMZM2G037792 GRAS transcription factor 1319–1339 –40.47
GRMZM2G011947 Unknown 731–751 –40.47
zma-miR319 UUGGACUGAAGGGUGCUCCC GRMZM2G028054 MYB domain transcription factor; homeodomain-like; SANT 1360–1379 –40.84
GRMZM2G412073 Unknown 232–251 –37.27
GRMZM2G089361 TCP Transcription factor 1316–1335 –41.33
GRMZM2G139688 MYB domain transcription factor; homeodomain-like; SANT 1399–1418 –34.89
GRMZM2G388987 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2 343–362 –34.94
GRMZM2G115516 TCP Transcription factor 1412–1431 –41.33
zma-miR165 GGGGAAUGUUGUCUUGGUU-GGA
GRMZM2G103078 Pentatricopeptide repeat-containing protein 1582–1603 –37.58
TC394270 Alcohol dehydrogenase 2 1206–1226 –38.72
CO464230 Zinc-binding dehydrogenase family protein 858–878 –38.23
DV029598 LipA and NB-ARC domain-containing protein 1806–1826 –37.92
TC372556 AGO10 100–120 –34.12
zma-miR173 AGCGCUUGCAGAGUGAAAU-CAU GRMZM2G011998 Hypothetical protein 229–249 –31.28
AW289138 60S ribosomal protein L13 160–181 –36.15
TC430600 Serine/threonine-protein kinase SNT7 290–311 –38.30
TC391640 Leucine rich repeat N-terminal domain 800–820 –46.37
TC374339 Auxin response factor 7 169–189 –40.60

第 5期 罗 茂等: 玉米纹枯病胁迫相关 miRNA功能研究 843


接菌后纤维素物质和角质层大量合成, 从而加强细
胞壁的抵抗能力[24-25]。
3.3 zma-miR319调控泛素途径相关激素信号
zma-miR319 主要靶向作用于 TCP 转录因子和
部分 MYB转录因子, 此外还可作用于泛素水解酶。
大量研究表明, miR319通过靶向 TCP转录因子和部
分 MYB 转录因子进而控制植物叶、花等器官的生
长命运, 并参与调控部分激素生物合成和信号传导
通路, 在植物发育过程中发挥重要生物学功能[26-28]。
据此 , 本研究推测靶向作用于泛素水解酶可能是
miR319响应逆境胁迫的主要途径。Sunkar等[14]发现
miR319c能够上调响应严寒胁迫; Liu等[19]研究表明
miR319的表达受大量激素如 CK、GA等调节, Zhou
等[20]研究发现重金属(Cd和 Al)胁迫诱导 miR319表
达上调, 但上述研究对 miR319 响应逆境胁迫的分
子调控机制均未详细阐述。本研究推测靶向作用于
泛素水解酶可能是 miR319 响应逆境胁迫的主要途
径。本试验中 miR319在两材料中 12 h叶和叶鞘处
理中均呈现出明显的下调表达, 从而有可能负调控
靶基因泛素水解酶使其显著上调表达。标记并降解
纹枯病侵染产生大量的有毒蛋白, 并最终激活水杨
酸信号转导和茉莉酸信号转导途径等下游激素防御
信号通路, 进而激活植物体内防御基因的表达, 抵
抗病原菌胁迫。
3.4 zma-miR173 调控激素信号通路并参与蛋白
质可逆磷酸化途径
zma-miR173 的靶基因主要是与 ARF 生长素因
子结合的 ta-siRNA和与蛋白质可逆磷酸化有关的丝
氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在本试验中, 接入真菌后 12
h的玉米自交系材料 R15和掖 478中的 zma-miR173
在叶和叶鞘中有明显的增量表达, 特别是在接菌后
的叶鞘中, 表达量更为突出, 导致靶标 ta-siRNA 降
低, ARF生长素因子增多, 富集的 ARF增加与生长
素应答元件结合机会, 从而启动激素信号传导通路
并协助泛素连接酶与转录抑制因子相互作用, 使其
通过泛素/26S 蛋白酶体降解途径降解, 最终激活下
游激素信号通路 , 启动植物体内防御基因的表达 ,
表达产物作为信号分子不断地传递放大, 使植物感
知信号并随即作出应答。同时, zma-miR173的上调
表达 , 导致蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受到抑制 ,
从而打破蛋白激酶/蛋白磷酸酶的平衡, 导致丝氨酸
/苏氨酸磷酸酶得到解放, 引起相关的信号传导, 从
而引起抗病防卫基因的表达, 使其表达产物抑制病
原菌的侵害和生长[29]。另外, 耐病材料 R15的 zma-
miR173 12 h表达量较感病材料掖 478多, 也可以看
出 R15由于其寄主本身会迅速作出强有力的防卫反
应, 而阻止病原微生物的进一步侵染, 表现出较抗
病的特点, 提示玉米纹枯病的抗性可能与蛋白质可
逆磷酸化有关。
3.5 zma-miR165 调控植物干细胞分化, 可能参
与调节植物体内抗氧化还原机制
zma-miR165靶基因主要为 AGO10和脱氢酶。
AGO10是植物顶端分生组织的重要因子, 已有研究
揭示, miR165能结合植物分裂组织细胞发育相关基
因 AGO10 调控植物干细胞分化[30]。本研究中 zma-
miR165受纹枯病侵染诱导上调表达, 可能抑制该调
控通路 , 抑制叶片、叶鞘分裂组织细胞生长。
zma-miR165的另一个靶基因脱氢酶, 可能与植物体
内抗氧化还原机制相关, 但作用机制不清楚。
4 结论
病原菌侵入时, miRNA通过增强植物细胞壁等
物理机械抗性直接抵御病原菌侵害; miRNA作为最
初信号源, 通过参与调控抗病相关信号途径, 激活
抗病途径关键转录因子从而合理地控制植物自身的
各种抗性机制以抵御病原菌的侵害; miRNA直接调
控植物抗性基因及蛋白, 引起抗病防卫基因的表达,
使其表达产物抑制病原菌生长 ; 部分抗病相关
miRNA 可以同时参与玉米的生长发育和纹枯病胁
迫响应过程并发挥重要作用, 这类现象组成了抗病
相关 miRNA调控功能的重叠网络。
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