全 文 ：第

卷 第
期



年
月
武 汉 植 物 学 研 究




 ! ∀ #



 ! ∀







! ∀ #



















今
水稻抗白叶枯病菌毒素
细胞无性变异系的初步筛选 关
刘成运 李中奎

中国科学院武汉植物研究所
权明清 谢岳峰 张端品
武汉

 


华中农业大学农学系 武汉



。

提 要 应用 湖北水稻白叶枯病强毒菌株 “江陵


’ 活细菌 、 细菌培养滤液 、 病菌粘液
多糖和菌体多糖。 对水稻粳

 、 梗


 和科选
号的幼穗及 花药所形成的愈 伤组织进行
共培养筛选 。 获得体细胞再生植株

 株 , 花粉植株
 株 , 其 中
 株为单倍体





。
同工酶谱显示 , 筛选出的梗

 愈伤组织的过氧化物酶同工酶活性加强 , 带数增多 。
关健词 水稻 , 白叶枯病 , 细胞无性变异系
水稻白叶枯病是水稻最主要的三大病害之一 。 在我国稻区都有发生 , 其中华中 、 华
东和华南是老发病区 , 每年都有不同程度 的危害 。 就湖北省而言 , 目前水稻抗白叶枯病
的育种工作 , 多是常规选育 、 辐射选育和轮回杂交方法 。 利 用生物细胞工程手段进行抗
病育种 , 自


年分离出第一个耐烟草野火病 的烟草突变体后 , 发展很快 , 至今已得
到

多个抗病突变体 。 在水稻中 , 利用生物技术手段 已在 抗胡麻 斑叶病 〔‘’, 抗铝〔” ,
筛选高蛋 白质含量 〔” , 抗盐 〔‘’‘
, 以及抗白叶枯病‘

等方面进行了研究 。 这些工作均以
一定物质作为压力选择剂 , 通过定 向选择 , 从而获得 了突变体或抗性细胞无性变异系 。
本文报道利用白叶枯病菌活菌体 , 细菌培养滤液以及细菌抗原—粘液多糖和 菌 体 多糖 , 对湖北主栽水稻品种粳
 、 粳


及黄淮海水 稻品种科 选
号的幼 穗和花药愈
伤组织进行压力筛选后 , 获得抗性细胞无性变异系的结果 。 有关子代抗病性 鉴 定 正 在
进行 。

材料与方法



愈伤组 织的诱导
水稻晚粳


、

及中 、 晚稻科选
号幼穗及晚粳

 花药 , 取自本组网室栽培
盆中 。 在超净台上直接剥取


一




长的 幼穗 , 并接 种在
。附加
,
一



,

  !

,
一





培养基上 。 花药培养前用显微镜检查花粉发育期 , 并将幼穗
放置 。一
℃ 低温处理
天 , 剥离后培养在
。附加
,
一
、
一

、


各



, 蔗
糖




的培养基上 。 待愈伤组织长至
一
  时 , 用于压力培养 。
本文于
 !年
月
日收到 ,
。,
年
月

日收到修改稿

所长基金资助课题

武 汉 植 物 学 研 究 第
 卷



细菌培养
水稻 白叶枯病菌菌种系华中农业大学植保系提供 , 湖北强毒菌株 “江陵

” 。 用
牛肉膏蛋白膝培养基液体振荡培养




、
 ℃ 、
 小时 。 细菌滤液分别用
。 及

号玻璃细菌过滤器抽气过滤 。



细 菌多糖杭原分离
应用改进的


 和



方法分离细菌粘液多糖 , 菌体细胞 中的菌体 多糖用修
正 的



和





方法提取
’
。



杭性细 胞无性 系的建立





与活细菌共培养 将细菌培养液
滴加在 继代培养的愈伤组织块
大小为
一

  ,
上 。 与一般愈伤组织相同的条件下共培养
 夭 , 然后挑取突 出菌层的 愈伤组
织块及菌层下的细胞团块 , 分别继代
不再滴加菌液 , 本身带菌
共
 天 。 分化培养
时 , 用无 菌水冲洗
次 , 接种到分化培养基上 。





与细菌过滤液共培养 细菌培养
 小时后经
‘过滤器 , 然后再经
。细菌过滤
器取得无菌滤液 。 接种幼穗及花药形成的愈伤组织
大小约


,
, 花药材料 仅粳


 一种 。 分为固体与液体两种方式 。 液体培养细菌滤液含量为





, 下同
经
小
时和
 小时两种 。 固体培养细菌滤液含量

培养
 天 , 然后再转至

浓度培养

天 , 以及同时用


、

和

浓度同时培养 , 以观察不同浓度 、 不同方法对愈伤
组织产生 的影响 。





与细菌粘液多糖的菌体多糖共培养 细菌多糖是致病性可溶性抗原 , 经
。过滤
器取无菌液加入培养基中 , 含量为最终浓度




, 固体培养

天 。





染色体倍性检查 采用去壁低渗法 。





同工酶技术 采用聚丙烯酞胺凝胶 电泳 , 浓缩胶

, 分 离胶

。 改 良联苯胺
染色 。

实验结果

。
活 细菌与愈伤组 织共培养
接种
一
天 , 愈伤组织生长快 , 菌落仅围绕愈伤组织块周围生长 。约
天后 , 大部分
斑
不同品种水稻 对愈伤组 叔与活细 , 共培养的反应










 !



























一



















”




”













品种 菌层内愈伤组
织小块数
突出菌层愈伤
组织小块数
再生植株

一





















































 





晚粳


,








科选一号










晚梗

了


一
名

‘



愈伤组织被菌层覆盖 。 以后 , 有极
少数愈伤组织小块突破菌层
图版


。新长出的愈伤组织呈 白色 , 与
正常培养时胚性愈伤组织相似 。 在
菌层 内的愈伤组织大部分解离 , 死
亡 。 有极少数菌层 内的细胞团不解
离 , 也不突出菌层 。 统计表明
表


, 以每瓶接种
块愈伤组织计 ,
到
 天时 , 晚梗

有
一
块突
出菌层 , 科选
号有
一
块突出菌
层 , 而晚梗



每个大的愈伤组织
块上至少有一小块突出菌层 。 在总
第
期 刘成运等
水稻抗白叶枯病菌毒素细胞无性变异系的初步筛选

计每种各
 块大的愈伤组织上 , 经培养后 , 突出于菌层之上的小愈伤组织块 , 分别 是晚
粳

 有
 块 , 科选
号有
 块 , 晚梗

有

 小块 。 有些晚粳


的愈伤组织块未
能突破菌层 , 但并不坏死 。 将这些残体放到液体培养基中培养
 天
转速




, 然
后静止
小时 , 弃去上清液 , 离心并接种到分化培养基上 , 证实这一部分细胞团可以分
化 。 其再生植株在含

细菌过滤液的培养基上





 生长 。



利用细菌培养过滤液对愈伤组 织进行 筛选
用于筛选的材料有幼穗和花药形成的愈伤组织
表
数据表明 , 随着细菌滤液浓度增大 , 存活愈伤组织数减少 , 但不同品种间减少
率存在差异 。 晚粳

 对细菌过滤
液 的压 力最敏感 、 抵抗力最差 。 晚
粳

 则表现出较强的抗性 。 这些
存活的愈伤组织经分化培养获得95
株再生植株 , 其中86 株能在 含35 %
的细菌滤液 的 1/ZM S 培养基 上生
长 , 另 9 株死亡 。 一些幸存的愈伤
组织经第一次压力筛选后 , 转至含
50% 的细菌滤液培养基上 , 经压力
筛选后 , 通过分化培养又获得再生
植株79 株 , 其中75 株可在含35 % 的
细菌滤液 的1/Z M S 培养基上生长 ,
其余 4 株死亡 ( 图版 I , 3 ) 。
花药形成的愈伤组织表现出对
细菌过滤液的敏感性 , 其存活率比
幼穗形成的愈伤组织少 , 而且经压
力筛选后 , 所分化出的再生植株 白
化苗多。 第一筛选 ( 25 % 含量 ) 后 ,
裹 2 不同浓度细 , 培养称液对愈伤组织的筛选作用
( 固休培养基 )
T able 2 S ereening o f differen t eon eentration
of baeteria filter to eallu 3
( on solified m ediu m )
品 种
V 一 r i e t 二e -
三种浓度下愈伤组织存活率
R a tio o f , u r v i v a l e a l l u s u n d e r
3
e o n o e n t r . t i o n s
2 5 % (
v
/
v
)
通。% ( v / V ) 5 0 % ( v / v )
晚粳 10 5
W u 一 n g e n g 1 0 5
科选 1号K ex u 一 n y i 卜ao
晚粳 3037
W u . ng eng 3 037
9 。 1 纬 4 。 1 % 1 . 6 %
2 1
。
2 % 8
。
8 ; 百 3。 5 ; 百
28 。 6 % 1 1 。 4 % 4 。 8 %
注: 愈伤组织存活率 - 存活愈伤组织数总接种愈伤组织数
No te. R 一t i o o f . u r , i v a l e a l l u ,
S
u r v
i v a l
e . l l
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T o t a l
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得到再生植株 20 株 , 其中有 6 株白化苗 , 第二次筛选后 ( 含量 40 % ) 得到再生植株 1
株 , 8 株为 白化苗 ( 图版 I : 4 ) 。 其中 3 块愈伤组织分化的全部为 白化苗 。
在幼穗再生植株中也发现一株叶片为白、绿各占一半的嵌合体植株 , 以中脉为分界 ,
叶鞘亦分成 白绿相嵌 , 转移至含35 % 滤液的 1 / 2 M S 培养基上可以正常生长 , 移栽后正
常生长 20 余天 , 在 强阳光下死亡 。
2
.
3 细 菌拈液 多糖和菌体 多糖时愈伤组 织的 筛选
经分离提取 的细菌水溶性多糖抗原结晶 , 配制成含量为looPPm 的培养基 , 3 个品种
的愈伤组织的生长均不同程度地受到抑制 , 有的甚至死亡 。 晚粳105, 有少部分愈伤组织
在已变黑 的愈伤组织上生长 (图版 I : 2 ) 。 科选 1 号及晚粳 3037 则有较多的存活率 ,
有些晚粳 3037的愈伤组织只受到轻微影响 。 统计表明 : 细菌菌体多楷使愈伤组织的存活
率分别是晚粳105为1.3% , 科选 1 号为2% , 而晚粳3037为 4 .1% 。 细菌粘液多 糖 对 愈
伤组织的存活 率是晚粳 10 5为 1.8% , 科选 1 号为 2 .5% , 晚梗 3037 为 5% 。 经压力筛
武 汉 植 物 学 研 究 第12 卷
选后 , 幸存愈伤组织共分化出 91 株再生 植 株 , 其中 76 株 可在 含 35 % 细菌过滤液 的
1/ 2 M S 培养篆上生长 , 另 15 株 发黄枯萎死亡 。
2
.
4 花粉植株染 色体倍性检查
将植株转移至 1/Z M S 培养基 上 , 有大量幼嫩根 形 成 , 于上午 9 时 采 样 处 理 ,
.........
-
.. . .. . .
曰卜一 侧厂钾「 二 】叮
比 几认 门匕 口r , 产7 产洲
5 t r o n g b 一 n d
m e d i 一t e b 一n d
w e a k b 一n d
抗性愈伤组织
reoist一 n t e . l l u -
R C C K
图 1 晚粗 10 5 经压 力筛选后愈伤组织过饭
化物醉 同工醉谱变化
F 19. 1 C ha n名e s o f p e ro x 生d t g e i , o z y m e p . t t e r n
o f
r
i o e
( o
r y 名a s a 忿iu a L . e v . W . , 弓e n g
1 0 5 ) 。 a l l u s t h r o u g h s t r e s s 一 r e e n i n g
经检 查有 17 株染色 体为 n = 12 ( 图
版 I : 5 ) 。 检 查 后 的 植 株 从
1/Z M S培养基上取出 , 放到含0 .05 %
秋 水仙素 的溶液中处理 48 小时 , 使
其加倍 。 未对白化苗进行检查 。 加倍
后的花粉植株均能在 35 % 细 菌 滤 液
的 1/ZM S 培养基 上生长 。
2
。
5 幸存愈伤组织 中过 乳化物 酶 同
工 酶谱 变化
筛选后的愈伤组织 , 其过氧化物
同工酶活性增强 , 表现在染色带染色
加深 , 带数增多。 图示晚梗 105 经筛选
后与对照愈伤组织 ( 筛选前的继代愈
伤组织 )过氧化物酶同工酶谱比较 。
粉姗稀Rc. .a:.脚画
目昌日嗣+一
3 讨论
( 1 ) 已有的研究证明 , 应用活细菌 、 加热 杀死的病原体〔吕, , ’、 细菌提取液〔” 、 细
菌 D N At ‘。」细胞壁组分 〔’‘】, 以及非病原性细菌 ( 腐生的 )[ “” ‘] , 均可以诱导植物产生抗
性 。 我们应用白叶枯病活细菌 、 细菌培养滤液 , 以及细菌粘液 多糖和菌体 多糖抗原物
质 , 均可以诱导水稻愈伤组织产生抗性反应 , 而这种抗性细胞无性系经分化培养后 , 所
产生 的再生植株仍然保持这种抗性 。 通过 含 35% 细菌培养液滤的 1/2 M S 培养基初步抗
性测定 , 绝大多数可以正常生长 , 少部分死亡。 压力筛选 60 天比 30 天者 , 植株表现出
更明显的抗病力 。 液体振荡培养压力筛选 48 小时 , 比 24 小时所产生的植株表现出更明
显的抗病 力 。 通过本研究可以看出 , 细菌培养无菌滤液 40 % 含量培养 60 天 ( 固体 ) 和
48 小时 ( 液体振荡培养 ) 比较 简易有效 。 后代抗性表现正在进行 。
( 2 ) 花粉单倍体植株 , 经加倍后 , 植株表现出比二倍体细胞产生 的植株较为明显
的抗病力 ( 指在含 35% 细菌培养滤液培养基上生长表现 , 后 代大 田抗病性 测验尚在进
行 ) 。 这可能与花粉植株的抗性基因为纯合 型之故 。 但花粉愈伤组 织经长期 压 力筛选
后 , 会产生大量白化苗 , 这有待进一步研究 。
( 3 ) 植物产生抗性是抗性基因表达的结果 , 其抗性强弱受基因表达 的速度和强度
决定 〔” ’。 前人研究指出 , 过氧化物酶参与下的木质素聚合过程中 , 能产生游离基 , 对
病原菌有很大 的杀伤作用 , 诱导植株过氧化 物酶活性增 加近 3 倍 , 而且整体 都有增
加 〔‘” 。 在水稻抗 o L 和抗瘟性筛选中 , 产生抗性的植株 , 也 表现出过 氧化物酶同工酶谱
活性增强〔’‘’“ ’。 我们对水稻抗性愈伤组织测定 的结果 , 也表现出过 氧化物酶 同工酶谱
带增强 , 弱带变为强带 , 且带数增多 。 这也 可以作为 愈伤组织 产生抗性的 一种测定指
第 1 期 刘成运等: 水稻抗白叶枯病菌毒素细胞无性变异系的初步筛选 5
标 。 植物 的抗病性是一个综合指标 , 在本研究基础上 , 将对其生理 、 生化 、 细胞学等方
面进行综合分析 , 并对其后代抗病性及抗性遗传进行深入研究 。
今 考 文 献
1
2
3
4
凌定厚 , v i d h y “ , e h . r o n P , B O r ro m o E s 等. 运用植物毒 素离体筛选水稻抗胡麻斑叶病 种质的研究. 遗
传学报 , 1 0 5 6 ; 1 3 ( 3 ) : 1 9 4 一200o kaw ara R , o j i m a K , Y o s h i d a 5 . s e l e e t i o n a n d p l a n t r e ‘e n e ra t io n o f a lu m in iu m 一 t o l e r a n t
c a l l u s 一 d e r i v e d f r o m r i c e ‘r a in s , J a P J 5 0 1 ￡ S e i P la ”七 N “ 玄r云￡, 1 9 8 6 ; 5 7 : 5 5 8 一562
Seh aeffer G w 一 M u t . t i o D . n d e e l l s e l e e t i o n s i n e r e : s e d P r o t e i n f r o m r e g e n e r a t e d r i e e t i , s u e
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九 u 诬ro ” E x P B o 亡, 1 , 8 1 ; 2 1 : 3 53一s‘5
v u D 一 Q , T r a n D 一 Q , p h a n p . M u t a ‘en e si 。 一 n d . o r e e n i n g m e t h o d f o r “ a l t t o l e r a n e e i n r i e e
b y a n t h e r G e n o m e 3 0 ( s
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9
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孙立华 , 佘建明 , 吕学锋. 用组织培养法筛选水稻抗白叶枯病突变体 . 遗传学报 , 1 9 8 6 ; 1 3 ( 3 ) : 18 8 一19 3
C h oi J E , N o b u a k i M a t s u y a 川 a , S a t o s h i w . k m o t o . A n t i g e n a n a l y s i s o f t h e p o l y s a e e h a r i d e .
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o m o n a s e a m p e s t
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甲 o r y z o e . A 雌 , P 人yt o p a t人 S o c J a P , 1 0 8 1 ; 4 7 : 1 9 9 一205ouehi 5. xnduetion of re.i一t a n e e o r o u 一e e p t i b i l i t r . A ” 几 R e ” P 耘y t o P a 七儿07 , 1 9 8 3 ; 2 1 : 2 8 9 一
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s eq u eir a L . M eeha niom o f in du eed r。。 i , t . n e e i n p l . n t a . A n 几 R e ” M i c r o 石10 1 , 1 9 8 3 ; 3 7 : 5 1
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一 i n v a d e r s . N e m a t o d e 巴一。 d i n , e c r s . p a g e s s 3 3
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H o 甘 P 1 a n t s d e f e n d t h e m . e l v . s 。 N e 钾 Y o r k : A e . d e . i e P r e一
G oo d m an R N . D efen .e一 t r i g g e r e d b 了 P re v 玉o u o i n v a d e r . : B a e te ri a : p a g e s s o s一515 in J. G .H o rsf 一 1 1 . n d E . B . c o , i n 何 ( e d s ) p l一n t d i 一e 一 : e : ^ n o d v a n e e d t r e : t i s e , v o l . 5 . H 。 w P l a n t :
d e f e n d t h e m 日 e l v e s 一 N e 甘 Y o r k : A c 一 d 。也ic P r e二
李冠 , 欧阳光察. 植物诱导抗性‘ 植物生理学通讯 , 1 9 9 。; ‘: 1一5H am m ersehm idt R , K u e J . E n b : n e e d P e r o x i d . , e . e t i v i t y a n d l i d n 工 f i e o t i o n i n t h e i n d u o e d
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钱德祀 ,
P r o t e
c t i o n o f c u c u m b e r
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P 人yto P a 亡人01 0止y , 1 9 8 0 ; 2 0 ( 7 0 ) : 6 5 。
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,曰.甘月‘口班.且,舀,孟‘.二
武 汉 植 物 学 研 究 第12卷
A P R E L !M !N A R Y S C R E E N !N G O F S O M A C L O N A L V A R !A N T S
O F R IC E ( O R Y Z A S A T IV A L 。 ) R E S I S T A N T T O
X A N T H O M O N A S O R Y Z A E D O W S O N
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