全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(5): 692697 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(U1201211)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2014AA10A603)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 石英尧, E-mail: shiyy123@163.com, Tel: 0551-65786213; 张帆, E-mail: fzhang81@gmail.com
第一作者联系方式: E-mail: dalong9300@163.com, Tel: 13141269174
Received(收稿日期): 2014-11-24; Accepted(接受日期): 2015-03-19; Published online(网络出版日期): 2015-03-30.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150330.1617.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00692
水稻抗白叶枯病新基因 Xa39分子标记有效性的评价
卓大龙 1,2 胡丹丹 1,2 张 帆 2 张 帆 2,* 石英尧 1,* 高用明 2
周永力 2 黎志康 2
1安徽农业大学农学院, 安徽合肥 230036; 2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: Xa39 是一个对水稻白叶枯病具有广谱抗性的显性新基因, 在水稻抗白叶枯病育种中具有良好的应用价值和
前景。在前期研究中, 我们将该基因定位在水稻第 11 染色体上。本研究利用携带 Xa39 基因的供体亲本 FF329 与受
体亲本 BT4、BT6、BT12、BT18 杂交培育出 4FL10、4FL14、4FL17、4FL21 四个育种 F2分离群体, 结合人工接种
抗病性鉴定, 对 3个与 Xa39紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助选择(MAS)有效性比较, 筛选高效的 PCR分子标
记。结果表明, 标记 RM26985 和 RM206 在上述 4 个群体中的 MAS准确率分别达到 95.81%和 93.61%, 同时使用两
者其准确率达到 95.59%, 上述 2个标记在水稻白叶枯病抗性改良育种中可以提高 Xa39的选择效率。
关键词: Xa39; 水稻白叶枯病; SSR; MAS
Evaluation of Selective Efficiency of Molecular Markers Linked with a Novel
Gene Xa39 Resistant to Bacterial Blight in Rice
ZHUO Da-Long1,2, HU Dan-Dan1,2, ZHANG Fan2, ZHANG Fan2,*, SHI Ying-Yao1,*, GAO Yong-Ming2,
ZHOU Yong-Li2, and LI Zhi-Kang2
1 College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China
Abstract: Xa39 is a novel and dominant resistance gene with broad spectrum for bacterial leaf blight in rice. In previous study,
this gene was mapped on chromosome 11. In present study, FF329 carrying Xa39 gene as donor parent and BT4, BT6, BT12,
BT18 as recipients were used to develop four F2 segregation populations (4FL10, 4FL14, 4FL17, 4FL21). Combining artificial
inoculation with phenotype identification of bacterial leaf blight, the validity of three molecular markers tightly linked with Xa39,
and two co-dominant molecular markers was investigated for marker-assisted selection (MAS). The results showed that the accu-
racy of marker RM26985 for MAS was 95.81% and that of marker RM206 was 93.61% in the four populations. The accuracy of
two markers RM26985 and RM206 used simultaneously for MAS was up to 95.35%. Therefore, RM26985 and RM206 can be
used as effective markers in MAS for Xa39 in rice breeding program.
Keywords: Xa39; Rice bacterial blight; SSR; MAS
由黄单胞杆菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae
pv. oryzae, Xoo)引起的白叶枯病是一种重要的水稻
细菌病害, 该病害在我国南方稻区以及亚洲东南亚
稻区经常暴发成灾, 是水稻高产、稳产的重要限制
因子之一[1]。培育和种植抗病品种是防治水稻白叶
枯病害最经济有效的方法。迄今, 国内外已鉴定了
39个白叶枯病抗性基因[2-3], 但是由于大多抗性基因
的抗谱较窄、部分抗病基因仅具有成株期抗性, 以
及来源于野生稻的抗病基因难以转育等问题, 在水
稻育种中有较大利用价值的抗性基因资源十分有
限。20世纪 80年代以来, 国内外水稻抗病育种中主
要利用的白叶枯病抗性基因包括 Xa3、Xa4、Xa21
和 Xa23[4]。大面积种植携带单一抗病基因水稻品种,
易于导致新毒力菌株出现而使品种抗性丧失。20世
第 5期 卓大龙等: 水稻抗白叶枯病新基因 Xa39分子标记有效性的评价 693
纪 90年代以来, 我国广东以及东南亚其他稻区相继出
现了对 Xa4和 Xa21有毒力的菌株[5-7]。通过分子标记
辅助选择抗病新基因或聚合已知抗病基因对于培育具
有广谱持久抗性的水稻品种具有重要意义[8-9]。近年来,
国内外研究者越来越重视通过多基因的聚合提高水稻
的抗病性。如 Luo等[10]通过聚合获得了抗白叶枯病基
因 Xa4、Xa21 和 Xa27 多抗水稻恢复系, 闫成业等[11]
利用分子标记辅助选择聚合 Xa7、Xa21和 cry1C*基因
改良了杂交水稻金优 207的白叶枯病和螟虫抗性。
Xa39是从我国籼稻常规稻黄华占为轮回亲本、
以菲律宾籼稻品种 PSBRC66 (P66)为供体亲本的回
交导入系中鉴定的一个水稻白叶枯病显性抗性基因,
该基因对我国和菲律宾的白叶枯病菌代表病原型和
生理小种均表现高度抗病 [2], 在常规稻和杂交稻育
种中具有广泛的应用前景。在前期研究中, 我们已
将 Xa39定位在水稻第 11染色体上[2]。本研究利用 4
个育种 F2分离群体, 评价了 2个与 Xa39紧密连锁的
共显性分子标记和一个显性标记 DM13, 以期筛选
出适合对该基因进行分子标记辅助选择 (MAS)的
PCR分子标记。
1 材料与方法
1.1 群体构建
FF329是从黄华占为轮回亲本、P66为供体亲本
在 BC1F4群体中选出的携带 Xa39的抗病株系。2013
年在北京中国农业科学院作物科学研究所昌平试验
地以 FF329[2]为父本, 以 4个杂交稻亲本品系 BT4、
BT6、BT12、BT18为母本, 配制 F1杂交组合。2013
年冬季, 将全部 F1种植于中国农业科学院作物科学
研究所海南试验地, 收取各 F1 单株苗期叶片, 提取
DNA, 利用随机筛选的 10对在亲本间有多态性的分
子标记进行真杂种鉴定, 收取真杂种单株种子, 从
而获得 F2分离群体。
1.2 人工接种与抗性鉴定
采用 Xoo 菲律宾 6 号生理小种代表菌株
PXO99[12]接种 F1单株和 F2分离群体。菌种保存于
80℃的甘油中, 接种前在 PSA培养基上复壮, 挑取
单菌落, 经毒力测试后保存于 4℃。用 PSA 培养基
于 28℃培养菌株 32~48 h, 配制成 108 cfu mL–1菌液
用于接种试验[13]。
2014年正季, 将供试水稻亲本 F1和 F2材料种植
于中国农业科学院作物科学研究所内的网室, 以导
入系亲本黄华占和抗病亲本 FF329 为对照。在水稻
植株的分蘖期采用剪叶法接种 [14], 每个单株接种
7~10张叶片。接种 18 d后, 当供试亲本充分发病且
病情发展稳定时, 调查接种各单株的病斑长度, 每
株调查 5 张叶片, 计算各株病斑长度平均值, 病斑
长度<1 cm为高抗、1~5 cm为抗病、5~10 cm为中
抗、10~15 cm为中感、>15 cm为感病。
1.3 分子标记及 PCR
人工接种前, 取各 F2 单株 1~2 张叶片, 采用
CTAB 法提取 DNA[15]。选择 Xa39 两侧的紧密连锁
的分子标记 RM26985、DM13和 RM206 (表 1)用于
F2群体 MAS有效性分析。
表 1 用于 Xa39基因检测的特异性引物
Table 1 Specific primer pairs used for detecting the Xa39 gene
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5–3)
反向引物
Reverse primer (5–3)
文献
Reference
RM26985 CACAAGACAACCTTCAATGG GGCTTAGGAGCGTTTATAGG Zhang et al. [2]
RM206 CCCATGCGTTTAACTATTCT CGTTCCATCGATCCGTATGG Zhang et al. [2]
DM13 TTTGACAAGCTTAAACTGCAAT ATAAAGGTCTACAGCTATTGCA Zhang et al. [2]
PCR 扩增体系 20 µL, 包括 10×缓冲液 2.0 µL,
10×TB 1.5 µL, 5 µmol L-1引物 2.0 µL, Taq DNA聚合
酶 0.5 µL, DNA 5 µL, ddH2O 4 µL。扩增程序为 94℃
预变性 5 min, 94℃变性 1 min, 55℃ (或 61℃、67℃)
退火 45 s, 72℃延伸 45 s, 从变性到延伸循环 35次,
最后在 72℃下保温 10 min, 10℃保存。扩增产物经
8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 1.5 h 左右,
用已配好的 genefinder 染料染色, 在紫外灯下扫描
照相, 读取标记基因型数据。
2 结果与分析
2.1 亲本及其 F2分离群体对白叶枯病的抗性表现
4个杂交稻亲本 BT4、BT6、BT12、BT18在分
蘖盛期对白叶枯病病菌代表菌株 PXO99表现中等抗
病、中等感病和感病, 病斑长度为 8.6~16.1 cm; 携
带 Xa39的抗病株系 FF329对 PXO99表现典型的过
敏性坏死反应, 病斑长度小于 0.5 cm (表 2)。
采用 PXO99对 FF329与上述 4个杂交稻亲本的
694 作 物 学 报 第 41卷
F2 代分离群体进行白叶枯病抗性鉴定, 各群体单株
均表现抗感分离(表 3)。卡方检验结果表明, F2群体
的抗感植株符合 3∶1抗感分离(P>0.7) (表 3)。
2.2 Xa39基因的分子标记辅助选择效率
选择与 Xa39 紧密连锁的分子标记 RM26985、
RM206、DM13 对 4 个 F2分离群体的 775个单株进
行 PCR扩增(图 1)。其中 RM26985、RM206是共显
性分子标记, 能区分出纯合抗病基因型和杂合抗病
基因型, 而 DM13是显性分子标记, 不能区分纯合抗
病基因型和杂合抗病基因型且在纯合感病植株(图
1-B, 第 1、第 3、第 6、第 9株)上有一条杂带, 所以本
研究主要对 RM26985和 RM206进行MAS效率评价。
利用位于 Xa39 基因两侧的紧密连锁分子标记
RM26985和 RM206对 F2群体的各单株进行 PCR检
测, 评价这 2个分子标记对 Xa39基因MAS的效率。
从表 4可以看出利用 RM26985分子标记检测 4FL10
群体的 198个 F2单株, 接种表型鉴定表明抗病的 148
个单株(抗病亚群)中有抗病带型的 147个, 有感病带
型的植株 1 个, 基因型与表型符合率为 99.32%; 感
病的 50 株(感病亚群)中, 分子标记检测到感病带型
的植株为 47 个, 抗病带型的植株为 3 个, 符合率为
94.00%, 整个 4FL10群体MAS的符合率为 96.66%。
利用上述方法得到分子标记RM206对 4FL10群体的
图 1 与 Xa39紧密连锁的 3个分子标记在分离群体中的 PCR
扩增结果
Fig. 1 PCR amplification products of three molecular markers
closely linked with Xa39
A、B、C: 分子标记 RM26985、DM13、RM206对 4FL10/FF329
F2分离群体亲本(1: BT4; 2: FF329)及部分单株(3~16) PCR扩增
产物在 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M: 分子量。向左的箭头
表示抗病单株带型。
A, B, C: PCR amplification products of RM26985, DM13, and
RM206 in partial F2 individuals (3–16) of the 4FL10/FF329 popu-
lation and their parents BT4 (1) and FF329 (2) on 8% polyacryla-
mide gel. M: DNA ladder. Arrows point to the left indicate the PCR
products of BB resistant individuals.
表 2 亲本对白叶枯病菌代表菌株 PXO99的反应
Table 2 The resistance reaction of parents after inoculation with Xanthomonas oryzae pv. oryzae PXO99
亲本
Parent
来源
Origin
病斑长度
Lesion length (cm)
抗性级别
Resistance level
BT4 O84/桂 99 O84/Gui 99 8.55±1.15 MR
BT12 O84/黄华占 O84/Huanghuazhan 9.69±1.25 MR
BT18 II–32B/IR58025 14.63±1.55 MS
BT6 明恢 86/紫恢 100 Minghui 86/Zihui 100 16.11±1.48 S
FF329 P66/黄华占 P66/Huanghuazhan 0.40±0.10 HR
HHZ 黄华占 Huanghuazhan 14.30±2.60 MS
HR: 高抗; MR: 中抗; MS: 中感; S: 感病。
HR: highly resistant; MR: medium resistant; MS: medium susceptible; S: susceptible.
表 3 F2分离群体对白叶枯病菌 PXO99的抗性表现
Table 3 Resistance reactions of F2 population to PXO99 population
群体
Population
杂交组合
Cross
F2群体总数
Plant number F2 population
抗病
Resistant
感病
Susceptible
卡方值
Chi-square
P 值
P-value
4FL10 BT4/FF329 198 148 50 0.04 0.84
4FL14 BT6/FF329 200 149 51 0.03 0.86
4FL17 BT12/FF329 226 169 57 0.01 0.92
4FL21 BT18/FF329 147 112 35 0.11 0.74
总计 Total 771 578 194 0.03 0.86
第 5期 卓大龙等: 水稻抗白叶枯病新基因 Xa39分子标记有效性的评价 695
MAS符合率为 92.66%; 对于 4FL14群体, RM26985
和 RM206 标记的 MAS 符合率均为 95.72%, 其中
RM206 标记的 MAS 符合率有所提高; 对于 4FL17
群体, RM26985和 RM206标记的 MAS符合率分别
为 95.60%和 93.55%, 而对于 4FL21群体, RM26985
和 RM206 标记的 MAS 符合率分别为 95.27%和
92.50%。可以看出, 标记 RM26985 对各个群体的
MAS 平均符合率 95.81%, 高于 RM206。抗病亚群
中的 MAS 符合率均高于感病亚群的 MAS 符合率,
两者差值范围 3.2%~13.3% (表 4), 原因是部分单株
在接种鉴定中抗感反应不够清晰, 对病斑长度介于
抗病和感病之间的判断不够准确, 对本研究中亚群
体规模较小的感病亚群影响较大, 导致感病亚群体
的标记选择符合率较低。
表 4 4FL10、4FL14、4FL17、4FL21四个 F2群体分子标记检测与田间抗感表型的符合率
Table 4 Marker-assisted selection efficiency in four F2 breeding populations
标记检测带型
PCR pattern
分子标记符合率
MAS efficiency
F2群体
F2
population
株数
Number of
individuals
标记
Marker
接种表型
Phenotype 抗病
R
感病
S
亚群符合率
Subgroup
efficiency
(%)
抗感亚群差值
Difference of
subgroup efficiency
(%)
群体符合率
Group
efficiency
(%)
R 147 1 99.32 RM26985
S 3 47 94.00
5.32 96.66
R 147 1 99.32
4FL10 198
RM206
S 7 43 86.00
13.32 92.66
R 145 4 97.32 RM26985
S 3 48 94.12
3.20 95.72
R 145 4 97.32
4FL14 200
RM206
S 3 48 94.12
3.20 95.72
R 166 3 98.22 RM26985
S 4 53 92.98
5.24 95.60
R 165 4 97.63
4FL17 226
RM206
S 6 51 89.47
8.16 93.55
R 111 1 99.11 RM26985
S 3 32 91.43
7.68 95.27
R 108 4 96.43
4FL21 147
RM206
S 4 31 88.57
7.86 92.50
R: 抗病株; S: 感病株; MAS: 分子标记辅助选择。R: resistant; S: susceptible; MAS: marker-assisted selection.
在4FL10群体中, 利用 RM26985和 RM206两个
分子标记同时检测4FL10群体的195个 F2单株 , 接
种表型鉴定表明抗病的148个单株(抗病亚群)中有
抗病带型的147个, 有感病带型的植株1个, 基因型
与表型符合率为99.32%; 感病的47株(感病亚群)中,
分子标记检测到感病带型的植株为44个, 抗病带型
的植株为3个 , 符合率为93.61%, 整个4FL10群体
MAS的符合率为95.50% (表5)。同时利用 RM26985
和 RM 206标记的 MAS 符合率对于群体4FL14为
95.72%, 对群体4FL17标记 MAS 符合率为95.48%,
而对于4FL21群体达到94.71% (表5)。平均来看, 同
时利用标记 RM26985和 RM206对 F2分离群体的
MAS 符合率为95.59%, 与使用单个标记 RM26985
的 MAS 准确率(表4)近似。在本研究所用群体中
RM26985一侧发现的重组单株在利用2个分子标记
预测表型结果时同样判断错误 , 但是使用2个分子
标记时有少数单株在其中一个标记基因型缺失, 导
致符合率计算时总株数减少 , 这使得使用2个分子
标记的符合率略低于只利用一个 RM26985标记的
符合率, 当基因型无缺失的情况下, 两符合率应该
相同 , 这也表明使用单个分子标记 RM26985就能
达到分子标记辅助选择育种的要求。
696 作 物 学 报 第 41卷
表 5 同时使用 Xa39基因两侧的分子标记的 MAS符合率
Table 5 MAS efficiency when using two markers flanking Xa39
RM26985–RM206
F2群体
Population
株数
Number of individuals
抗病
Resistant
感病
Susceptible
亚群符合率
Subgroup efficiency (%)
群体符合率
Group efficiency (%)
147 1 99.32
4FL10 195
3 44 93.61
96.47
145 4 97.32
4FL14 200
3 48 94.12
95.72
166 3 98.22
4FL17 224
4 51 92.73
95.48
111 1 99.11
4FL21 143
3 28 90.32
94.71
3 讨论
通过聚合多个不同抗病基因 [8], 一方面可以拓
宽水稻品种的抗谱, 另一方面能够降低因大面积种
植携带单一抗病基因水稻品种而造成的抗性迅速丧
失的风险, 使水稻品种具有相对持久抗性。分子标
记辅助选择技术的特点是准确、快速,且不受环境影
响,是多基因聚合的有效手段。利用与抗病基因紧密
连锁的分子标记跟踪目标基因, 因基因型不受环境
条件和病原小种的限制和影响, 在水稻白叶枯病抗
性基因的转育和聚合中得以广泛应用。但分子标记
辅助选择的准确性很大程度上依赖于标记与目的基
因的连锁紧密程度 ,选择标记与目的基因连锁越紧
密,辅助选择结果越准确可靠[16]。对于 Xa4、Xa21和
Xa23等白叶枯病抗性基因, MAS在其育种利用中发
挥了作用 [17-19]。Zhou等 [20]利用 MAS 培育了携带
Xa23 的杂交稻亲本, 并聚合了细菌性条斑病抗性基
因[21]; Wang等[22]报道了与抗病基因 Xa23 共分离的
分子标记; Yoshimura等[23]利用MAS育成 Xa4和 xa5
聚合系; Huang 等[24]用 RFLP 和 PCR 标记对白叶枯
病抗性基因累加系进行选择, 成功地构建了含 Xa4、
xa5、xa13和 Xa21的多基因累加系。
Xa39是一个完全显性的广谱白叶枯病抗性基因,
携带该基因的水稻植株对 Xa4 的毒力菌株 CV[25]和
Xa21 的毒力菌株 GV[26]均表现免疫反应, 因此该基
因在常规稻和杂交稻的白叶枯病抗性改良中具有重
要的应用价值。鉴定与 Xa39 紧密连锁的分子标记,
通过MAS不仅可以加速该基因的转育进程, 而且可
以实现该基因与其他抗病基因的聚合(如目前尚未
发现 Xa23和 Xa39的鉴别菌株)。郑乐康等[27]认为用
于 MAS 的分子标记与目标基因的遗传距离小于 5.0
cM有利于保证选择的准确性。因此在水稻抗病育种
过程中, 可以利用该标记和与 Xa4、Xa21、Xa23 等
白叶枯抗病基因紧密连锁标记共同进行 MAS 聚合
育种, 获得 Xa39 与多个抗病基因的聚合系, 从而培
育具有广谱持久抗性的水稻品种。
4 结论
本研究评价了 3个与 Xa39紧密连锁分子标记的
选择效率, 显性分子标记 DM13 不能区分纯合抗病
基因型和杂合抗病基因型, 具有局限性。RM26985
和 RM206位于 Xa39基因的两侧, 与 Xa39的遗传距
离分别为 0.36 cM和 1.20 cM[2], 其分子标记辅助选
择准确率分别为 95.81%和 93.61%, 同时使用位于
Xa39 基因两侧的分子标记 RM26985 和 RM206 的
MAS准确率与单个使用标记 RM26985的MAS准确
率相当, 所以在只利用与 Xa39基因紧密连锁的分子
标记 RM26985就可以用于 Xa39的标记辅助选择。
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