全 文 ：Vol. 29 , No. 4
pp. 501～507 　July , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 4 期
2003 年 7 月 　501～507 页
水稻抗白叶枯病基因 Xa23 的 PCR分子标记定位及辅助选择
潘海军1 　王春连1 　赵开军1 , 3 　章　琦1 　樊颖伦1 　周少川2 　朱立煌3 Ξ
(1中国农业科学院作物育种栽培研究所 ,农业部作物遗传育种重点开放实验室 ,北京 100081 ; 2广东省农业科学院水稻研究所 ,广东广州
510640 ; 3中国科学院遗传研究所 ,北京 100101)
摘 　要 　用 Xa23 的近等基因系 CBB23 及其感病轮回亲本 J G30 构建了包含 2562 个单株的 F2 作图群体。通过分析 571
个感病单株 ,找到 2 个新的与 Xa23 基因连锁的 SSR 标记 RM187 和 RM206 ,它们与 Xa23 之间的遗传图距分别为 711 cM
和 119 cM。通过筛选 1200 个 RAPD 引物 ,获得 2 个与 Xa23 基因连锁的 RAPD 标记 RpdH5 和 RpdS1184 ,与 Xa23 之间的遗
传图距分别为 710 cM和 716 cM。利用丰富占/ CBB23、绿油占/ CBB23 两个实际育种 F2 群体 ,结合抗病性人工接种鉴定 ,
测算了 RpdS1184、RM206 和 RpdH5 用于分子标记辅助选择 (MAS) 的可能性。结果表明 ,对于丰富 23 群体 , RpdH5 和
RpdS1184 的 MAS准确率分别为 9110 %和 8713 % ,如果同时使用这两个标记 ,可使 MAS的准确率达 99 %。对于绿油 23 群
体 ,RpdH5、RpdS1184 和 RM206 的 MAS准确率分别为 7711 %、8111 %和 8018 %。同时使用 RpdH5、RpdS1184 标记的 MAS准
确率为 9013 % ;同时使用 RpdH5、RM206 的准确率为 9113 % ;同时使用 RpdH5、RM206、RpdS1184 标记的准确率为 9018 %。
关键词 　Xa23 ;水稻白叶枯病 ;SSR ;RAPD ;MAS
中图分类号 : S511 　　　文献标识码 : A
Molecular Mapping by PCR2based Markers and Marker2assisted Selection of Xa23 ,
a Bacterial Blight Resistance Gene in Rice
PAN Hai2Jun1 　WANG Chun2Lian1 　ZHAO Kai2Jun1 3 　ZHANG Qi1 　FAN Yin2Lun1 　ZHOU Shao2Chuan2
ZHU Li2Huang3 .
(1 Key Laboratory of Crop Genetics & Breeding , Ministry of Agriculture , Institute of Crop Breeding and Cultivation , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Bei2
jing , 100081 ; 2 Rice Research Institute , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangzhou , Guangdong 510640 ; 3 Institute of Genetics , Chinese Academy
of Sciences , Beijing , 100101 , China. )
Abstract 　A F2 population , with 2562 individuals , of J G30/ CBB23 was constructed for molecular mapping of the bacterial
blight resistance gene Xa23 in rice. After screening 1200 random amplified polymorphic DNA (RAPD) primers , we found
RAPD markers , RpdH5 and RpdS1184 , were linked to the Xa23 gene , with genetic distance of 7. 0 cM and 7. 6 cM , re2
spectively. Two simple sequence repeats (SSR) markers , RM187 and RM 206 , were also found to be linked to the Xa23
gene , the genetic distance were 7. 1 cM and 1. 9 cM , respectively. The marker2assisted selection (MAS) efficiency of
RpdS 1184 , RM 206 and RpdH5 was evaluated using two true breeding F2 populations. The results showed that the MAS
efficience of RpdH5 and RpdS1184 , in population Fengfu23 , were 91. 0 % and 87. 3 % , respectively , but the MAS effi2
ciency reached as high as 99 % when these two markers were co2used. For population Luyou 23 , the MAS efficiency of
RpdH5 , RpdS1184 and RM 206 were 77. 1 % , 81. 1 % and 80. 8 % , respectively. When RpdH5 and RpdS1184 were co2
used , the MAS efficiency was 90. 3 % ; when RpdH5 and RM 206 were co2used , the MAS efficiency was 91. 3 % ; when
RpdH5 , RM 206 and RpdS1184 were co2used , the MAS efficiency was 90. 8 %.
Key words 　Xa23 ; Rice bacterial blight ; SSR ; RAPD ; MAS
基金项目 :国家植物转基因及其产业化专项 (J002A2002) ;国家自然科学基金项目 (39970452) ;国家“863”计划项目 (2001AA222151) 。
作者简介 :潘海军 (1976 - ) ,男 ,山东人 ,硕士生 ,研究方向 :水稻抗病基因分子标记定位及应用。3 通讯作者 :赵开军 ,Author for correspondence E2mail :zhaokj @mail . caas. net . cn
Received(收稿日期) :2002206226 ,Accepted(接受日期) :2002210215.

　　水稻白叶枯病是水稻生产中最严重的病害之
一 ,世界各产稻区均有发生 ,一般减产 10 %～30 % ,
严重时甚至绝收[1 ] 。自 20 世纪 60 年代以来 ,国际
上统一鉴定命名了 19 个水稻白叶枯病抗性基因[2 ] ,
其中能在育种上有效利用的并不多 ,除 Xa3、Xa4 已
在育种上广泛利用外[3 ] ,来自长药野生稻的 Xa21
由于具有广谱抗性并且已被分离克隆[4 ] ,近年 ,人们
正通过基因工程和杂交转育途径开发利用[5 ,6 ] 。近
十年来不断有新的白叶枯病抗性基因被鉴定出来 ,
新基因的序号已排至 xa24[7 ] 。其中由章琦等从我
国普通野生稻中鉴定发掘的 Xa23 ,对国内外所有鉴
别菌系都表现为高抗 ,而且为显性、全生育期抗病 ,
对于杂交稻的改良具有广阔的应用前景[8 ] 。章琦等
已将 Xa23 初步定位在水稻第 11 染色体的长臂上 ,
与 SSR 标记 OSR6、RM224 和 RFLP 标记 G1465 之间
的遗传图距分别为 513 cM、2717 cM 和 1617 cM[8 ] 。
但是这 3 个标记均位于 Xa23 基因近端粒一侧 ,而
且离 Xa23 基因较远 ,无法用于 Xa23 基因的分离克
隆。另外 , Xa23 基因的优异特性已引起育种家的重
视 ,正被应用于水稻育种计划。由于可以鉴定 Xa23
基因的强致病菌系 P6 和 P10 引自 IRRI ,在我国只能
在限定的地点和严格隔离控制的条件下用于人工接
种 ,所以在实际育种计划中 , Xa23 基因的分子标记
辅助选择显得非常重要。为此 ,我们近两年来采用
SSR、RAPD、AFLP 及 RFLP 等多种途径寻找与 Xa23
基因更紧密连锁的分子标记 ,以期用于 Xa23 基因
的图位克隆和分子标记辅助选择 (MAS) 。本文报道
RAPD 标记和新的 SSR 标记的筛选及其用于 MAS的
可能性。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　植物材料
　　携有 Xa23 基因的近等基因系 CBB23、培育
CBB23 的轮回亲本 J G30 (金刚 30) 及它们的 F2 分离
群体由本实验室制备。绿油 23 (绿油占/ CBB23) 、丰
富 23 (丰富占/ CBB23)两个 F2 育种群体由广东省农
业科学院水稻所制备。所有提取 DNA 的植株种植
在本所温室或网室 ,常规管理。
11112 　水稻白叶枯病菌系
水稻白叶枯病广致病菌系 P6 引自国际水稻研
究所 ( IRRI) , 由本实验室保存。
11113 　RAPD 引物
购自 OPERON 公司的 10 碱基的 RAPD 引物 20
套共 400 个 (编号 :OPA、OPB、OPC、OPD、OPE、OPF、
OPG、OPH、OPI、OPJ 、OPK、OPL、OPM、OPN、OPO、
OPU、OPV、OPW、OPX、OPY) ;购自上海生工生物工程
技术服务有限公司 (上海生工) 的 10 碱基 RAPD 引
物 800 个 (编号 : S1812S220、S3212S340、S4612S520、
S10012S1520、S20012S2160) 。
11114 　SSR 引物
根据 Temnykh et al . [9 ]选用水稻第 11 染色体长
臂上包括 RM206 和 RM187 的 SSR 标记 10 个。引物
由上海生工合成。其中 RM206 和 RM187 的引物序
列为 :
RM206F :5′2CCCATGCGTTTAACTATTCT23′,
RM206R :5′2CGTTCCATCGATCCGTATGG23′;
RM187F :5′2CCAAGGGAAAGATGCGACAATTG23′,
RM187R :5′2GTGGACGCTTTATATTATGGG23′。
112 　方法
11211 　植株抗病接种鉴定
　　采用人工剪叶接种法[8 ] ,用白叶枯病国际鉴别
菌系 P6 对供试水稻植株于苗期进行抗性鉴定。
11212 　基因组 DNA 提取
对 J G30、CBB23 及它们的 F2 分离单株 ,参考
McCouch 等[10 ]的方法提取叶片总 DNA。
对绿油 23、丰富 23 两个 F2 群体的分离单株 ,采
用基因组 DNA 的快速提取法。具体步骤如下 :取一
小片嫩叶放入盛有 100μL NaOH (015 mol/ L) 的 115
mL Eppendorf 管中 ,用磨砂玻璃棒研磨成匀浆 ,取 5
μL 上清液与 245μL Tris2HCl (011 mol/ L ,pH 810) 混
合 ,4 ℃下保存 ,尽早用于 PCR。
11213 　PCR 反应及电泳
SSR标记筛选及其用于 MAS 时 :反应体积 25
μL ,反应液组成为 1 ×PCR 缓冲液 (10 mmol/ L Tris2
HCl , pH 813 , 50 mmol/ L KCl , 011 % Triton2100) ,215
mmol/ L MgCl2 , dNTP 0125 mmol/ L , 每个引物 50 ng ,
100 ng 基因组 DNA , 1U Taq 酶。反应程序为 :94 ℃
预变性 5 min ,然后每个循环 :94 ℃变性 1 min ,55 ℃
复性 1 min ,72 ℃延伸 2 min ,共循环 35 次 ,最后 72 ℃
保温 10 min。
RAPD 标记筛选及其用于 MAS 时 :反应体积 20
μL ,反应液组成为 1 ×PCR 缓冲液 (10 mmol/ L Tris2
HCl , pH 813 , 50 mmol/ L KCl , 011 % Triton2100) ,210
mmol/ L MgCl2 , dNTP 01125 mmol/ L , 引物 30 ng ,1 U
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Taq 酶 ,基因组 DNA 50 ng(标记筛选和定位)或 3μL
(MAS) 。反应程序为 :95 ℃预变性 5 min ,然后每个
循环 :95 ℃变性 30 s ,37 ℃复性 45 s ,72 ℃延伸 1 min ,
共循环 45 次 ,最后 72 ℃保温 7 min。
PCR扩增产物在 310 % (SSR) 或 110 % ( RAPD)
琼脂糖凝胶中电泳分离 ,经溴化乙锭 ( EB) 染色后 ,
紫外灯下扫描照相。
11214 　分子标记与 Xa23 基因的连锁分析
根据分子标记多态性 ,结合分离群体抗性表型
参数 ,用 Mapmaker/ EXP310 作图软件进行基因和分
子标记位点的遗传连锁分析。LOD ≥310。重组值
经 Kosambi 函数转换为遗传图距 (cM) 。
2 　结果与分析
211 　F2 作图群体构建
1999 年将 J G30 与 CBB23 杂交 ,其 F1 植株在海
南岛繁殖加代 ,单株收获。2000 年在北京种植 F2 代
分离群体 ,共 2562 个单株。用 P6 进行白叶枯病抗
性鉴定表明 ,它严格符合 3 ¬1 的抗感分离 (表 1) ,
可以用于 Xa23 基因的分子标记定位。
表 1 JG30/ CBB23 的 F1 和 F2 群体对 P6 的抗性反应
Table 1 Resistance reactions of F1 and F2
populations from cross JG30/ CBB23 to P6
组合
Cross
F1 植株
F1 plant
F2 群体　F2 population
抗病 R 感病 S Total
χ2
( Expected
ratio)
P
value
J G30/ CBB23 # 1 ¬R 1046 341 1387 01106 (3 ¬1)0150～0175
# 2 ¬R 882 293 1175 01000 (3 ¬1) > 0190
总计 Total 1928 634 2562 01075 (3 ¬1)0175～0190
　　R :Resistant ; S :Susceptible
212 　Xa23 基因的 RAPD 标记定位
21211 　多态性 RAPD 引物的筛选
从 J G30/ CBB23 的 F2 分离群体中 ,选择接种鉴
定表现为典型的抗病和感病的单株各 10 株 ,每株取
等量 DNA 分别混合成抗病 DNA 池 ( R2pool) 和感病
DNA 池 ( S2pool) 。用抗、感池 DNA 为模板 ,从 1200
个 RAPD 引物中 ,筛选到 2 个在抗、感池之间出现多
态性条带的引物 H5 和 S1184 ,它们在抗病DNA 池中
分别扩增出 0165 kb 和 0145 kb 特异片段 ,分别记为
RpdH5 和 RpdS1184 (图 1) 。
21212 　F2 感病单株检测及遗传图距
鉴于 Xa23 为显性基因 ,J G30/ CBB23 的 F2 群体
中表型抗病的植株包含纯合和杂合两种基因型 ,抗
病表型存在因病原菌人工接种失误而造成误差的可
能性 ,相反 ,感病植株为隐性纯合体 ,感病表型理论
上完全真实。在分子标记检测中 ,感病植株的扩增
带型可以真实地反映分子标记与 Xa23 基因间的遗
传交换情况。因此 ,我们用 RAPD 引物 H5 和 S1184 ,
对 F2 群体的感病单株逐一检测 (图 1) 。由于部分单
株 DNA 量不足等原因 ,最后获得 571 个感病单株的
可分析数据。其中 H5 和 S1184 分别检测到 78 和 81
个单株在 Xa23 基因与分子标记之间发生了遗传交
换。用 Mapmaker310 软件对上述结果进行连锁分析
表明 ,RpdH5 和 RpdS1184 标记均与 Xa23 基因连锁 ,
其中 RpdH5 位于 Xa23 基因的靠着丝粒一侧 ,遗传
距离为 710 cM ; RpdS1184 位于 Xa23 基因的靠端粒
一侧 ,遗传距离为 716 cM。这样就将 Xa23 基因框
在特定的染色体区间内 (图 2) 。
213 　Xa23 基因的 SSR标记定位
利用 J G30、CBB23、F2 抗病池、感病池 DNA 为模
板 ,筛选了水稻第 11 染色体长臂上的 10 个 SSR 标
记。结果表明 RM206 和 RM187 在 J G30、CBB23 之间
和抗、感 DNA 池之间扩增出多态性条带。所以用这
两个标记检测了 F2 群体的感病单株 (图 1) ,在具可
分析数据的 571 个感病株中 ,RM206 和 RM187 分别
检测到 17 和 70 个单株在 Xa23 基因与分子标记之
间发生了单交换、2 和 3 个单株发生了双交换。
Mapmaker310 软件分析表明 , RM206 和 RM187 标记
均位于 Xa23 基因的靠端粒一侧 ,与 Xa23 的遗传距
离分别为 119 cM 和 711 cM(图 2) 。
214 　Xa23 基因的 PCR分子标记辅助选择( MAS)
由于可以鉴定 Xa23 基因的强致病菌系 P6 和
P10 引自 IRRI ,在我国只能在限定的地点和严格隔
离控制的条件下用于人工接种 ,所以在实际育种计
划中 , Xa23 基因的分子标记辅助选择很重要。丰富
23、绿油 23 两个 F2 分离群体是广东省农科院水稻
所的实际育种材料 ,我们在用 P6 进行人工接种鉴定
每个单株的抗病性的同时 ,选用位于 Xa23 基因两
侧的 RAPD 标记 RpdH5 和 RpdS1184 以及目前找到
的离 Xa23 基因最近的 SSR 标记 RM206 对每个单株
进行分子标记检测 ,评估这 3 个 PCR 标记在辅助选
择 Xa23 基因的效率。由于 RM206 在丰富占、CBB23
之间没有多态性 ,所以对丰富 23 群体只有 RpdH5 和
RpdS1184 标记选择的资料。
305　4 期 潘海军等 : 水稻抗白叶枯病基因 Xa23 的 PCR 分子标记定位及辅助选择 　　　

图 1 分子标记在 F2 群体中与 Xa23 基因的连锁分析
M:分子量　R :抗病池　S:感病池　01 - 56 :F2 感病植株
Fig. 1 Co2segregation between molecular markers and Xa23 in F2 population
M:Molecular weight ; R :R2pool ; S :s2pool ;01256 :F2 plants susceptible to P6 A :RM187 ; B :RpdH5 ;C :RpdS1184 ;D :RM206
图 2 　　水稻抗白叶枯病基因 Xa23 的连锁遗传图谱
Fig. 2 　　The genetic linkage map flanking rice bacterial blight resistance gene Xa23.
New markers identified in this study are shown in boldface. CEN : Centromere ; 11S : Short arm of chromosome 11
　　从表 2 可以看出 ,对于丰富 23 群体 ,RpdH5 标
记检测的 328 个 F2 单株中 ,有 245 株在接种鉴定中
表现为抗病 ,分子标记检测有 227 株表现为抗病带
型 ,符合率为 9217 % ;在接种鉴定中表现为感病的 83 个单株中 ,有 74 株在分子标记检测中表现为感病带型 , 符合率为 8912 % , 所以平均符合率为9110 %。同样可以算出 RpdS1184 标记对丰富 23 群体的 MAS 平均符合率为 8713 %。由于 RpdH5 标记
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位于 Xa23 基因靠着丝粒一侧 710 cM 处 ,RpdS1184
标记位于 Xa23 基另一侧 716 cM 处 (图 2) ,说明对
于 Xa23 基因 ,利用相距 710 cM 左右的单个分子标
记进行辅助选择 ,其准确率在 9010 %左右。由表 3
可知 ,对于丰富 23 群体 ,在 RpdH5 和 RpdS1184 标记
检测中同时表现为抗病带型的 148 个单株中 ,只有 1
株在接种鉴定中表现为感病 ,表明同时使用位于
Xa23 基因两侧的 RpdH5、RpdS1184 标记 ,可使 MAS
的准确率达到 99 %。
对于绿油 23 群体 , RpdH5、RpdS1184 标记的平
均 MAS 符合率均有所降低 , 分别为 7711 % 和
8111 %。距 Xa23 基因仅 119 cM 的 RM206 标记 ,其
平均MAS符合率也只有 8018 %(表 2) 。但是抗病植
株的 MAS符合率并不低 ,3 个标记分别为 8911 %、
9018 %和 9419 %(表 2) ,之所以造成平均 MAS 符合
率偏低的原因是感病植株的符合率低。我们查阅原
始记录发现 ,绿油 23 群体的部分单株在抗病接种鉴
定中的抗感反应不够清晰 ,有 12 个单株的接种叶片
之病斑面积在 15 %～20 %左右 ,被归为感病植株
(抗感分界标准为病斑面积 15 %) ,这可能有人为误
差 ,因为绿油 23 群体的感病株比例远多于 1/ 4 ,例如
RpdH5 检测的 273 株中 ,人工接种划分为 R 的为 193
株 ,划分为 S 的为 80 株 ,感病株比例为 117/ 4 (表
2) ,这可能致使该群体中 MAS 符合率的估计偏低。
由表 3 可知 ,对于绿油 23 群体 ,同时使用 RpdH5、
RpdS1184 标记的 MAS 准确率为 9013 % ;同时使用
RpdH5、RM206 标记的MAS准确率为 9113 % ;同时使
用 RpdH5、RM206、RpdS1184 标记的 MAS 准确率为
9018 %。可见 ,同时使用位于 Xa23 基因两侧的 2 个
或 3 个分子标记可提高 MAS 的准确率 ,但使用 3 个
分子标记的 MAS 符合率并不比使用 2 个分子标记
的 MAS符合率显著提高 ,所以在实际应用中 ,选择 2
个位于 Xa23 基因两侧的分子标记开展 MAS就足够
了。
表 2 　　绿油 23、丰富 23 两个 F2 群体分子标记检测与田间抗感表型的符合率
Table 2 　　Marker2assisted selection efficiency in two F2 breeding populations
F2 群体 3
Populations
Marker 检测株数
Plants
人工接种
Inoculation
分子检测带型
Amplified pattern
分子检测符合率
MAS efficiency
表型
Phenotype
植株数
Plants
R S R 　
S( %)
平均符合率
Mean ( %)
丰富 23 RpdH5 328 抗病 R 245 227 18 9217 9110
Fengfu 23 感病 S 83 9 74 (8912)
RpdS1184 235 抗病 R 175 151 24 8613 8713
感病 S 60 7 53 (8813)
绿油 23 RpdH5 273 抗病 R 193 172 21 8911 7711
Luyou 23 感病 S 80 28 52 (6510)
RpdS1184 276 抗病 R 196 178 18 9018 8111
感病 S 80 23 57 (7113)
RM206 278 抗病 R 197 187 10 9419 8018
感病 S 81 27 54 (6617)
　　3 :丰富 23 : 丰富占/ CBB23 ;绿油 23 : 绿油占/ CBB23 ; Fengfu23 : Fengfuzhan/ CBB23 ; Luyou23 : Luyouzhan/ CBB23
表 3 　　同时使用 Xa23 基因两侧的分子标记的 MAS 符合度 (R %)
Table 3 　　MAS efficiency when 2 or 3 markers flanking Xa23 were co2used
F2 群体 3
Population
RpdH52RpdS1184 RpdH52RM206 RpdH52RM2062RpdS1184
Plants R S R % Plants R S R % Plants R S R %
丰富 23 Fengfu23 148 147 1 9913 / / / / / / / /
绿油 23 Luyou23 175 159 17 9013 184 168 16 9113 174 158 16 9018
　　3 :丰富 23 : 丰富占/ CBB23 ;绿油 23 : 绿油占/ CBB23 ; Fengfu23 : Fengfuzhan/ CBB23 ; Luyou23 : Luyouzhan/ CBB23
505　4 期 潘海军等 : 水稻抗白叶枯病基因 Xa23 的 PCR 分子标记定位及辅助选择 　　　

3 　讨论
311 　分子标记定位
　　为使 Xa23 基因的分子标记定位足以精细到可
以开展图位克隆 ,我们构建了包含 2562 个单株的 F2
大群体。如果分子标记定位中检测每一个单株 ,则
工作量非常大。所以我们参照王文明等[11 ]的方法 ,
主要用感病植株进行连锁分析。其理论基础是显性
基因控制的抗病表型包含纯合和杂合两种基因型 ,
且植株的抗病表型会因病原菌人工接种可能的失误
而造成误差 ,相反 ,感病植株为隐性纯合体 ,无论出
现纯合的抗性亲本带型还是杂合带型 ,都能清晰地
揭示分子标记与抗病基因间的遗传交换情况。
本研究通过分析 571 个感病单株 ,找到 2 个新
的与 Xa23 基因连锁的 SSR 标记 RM187 和 RM206 ,
并测得它们与 Xa23 之间的遗传图距分别为 711 cM
和 119 cM ,确证了 Xa23 在水稻第 11 染色体长臂上
的相对位置 (图 2) 。实验中 ,我们也用前期找到的
SSR 标记 OSR6 检测该群体 ,发现其扩增带型总是与
RM187 的一致 , 通过比较引物碱基序列发现 ,
RM187F 包含了 OSR6F 的全部 20 个碱基 ,只是在
3’端多了 TTG碱基 ;RM187R 包含了 OSR6R 的全部
20个碱基 ,只是在第 8 位多了 T 碱基[9 ,12 ] ,所以
RM187 与 OSR6 在本群体中的扩增位点相同 ,所以
测得 OSR6 与 Xa23 之间的遗传图距也为 711 cM。
章琦等曾利用包含 160 个单株的 J G30/ WBB1
(CBB23 培育中的 BC5F3 代) F2 群体测得 OSR06 与
Xa23 的遗传图距为 513 cM[8 ] ,这可能由群体差异所
致。
至此发现的与 Xa23 基因连锁的 SSR 标记
OSR06、RM224、RM187、RM206 及 RFLP 标记 G1465
均位于 Xa23 基因靠染色体端粒的同一侧 (图 2) ,为
了精细定位 Xa23 基因 ,有必要在 Xa23 的另一侧找
到标记 ,从而首先将其框在特定的染色体区段内。
本研究通过筛选 1200 个 RAPD 引物 ,获得 2 个与
Xa23 基因连锁的 RAPD 标记 RpdH5、RpdS1184 ,其中
RpdH5 位于 Xa23 基因靠着丝粒的一侧 ,这样 Xa23
就被框在了 RpdH5 与 RM206 之间 819 cM 的染色体
区段内 (图 2) 。我们正集中力量寻找落入该染色体
区段内的各种分子标记 ,包括 RFLP、AFLP、EST、YAC
亚克隆标记等。
312 　分子标记辅助选择
从实验成本和技术可行性考虑 ,开展 MAS 首选
基于 PCR 的分子标记。郑康乐等认为 ,用于 MAS的
分子标记与目标基因的遗传距离最好小于 510
cM[13 ] 。我们目前找到的位于 Xa23 基因两侧的最
近的基于 PCR 的分子标记为 RM206 和 RpdH5 ,距
Xa23 分别为 119 cM 和 710 cM ,因此我们利用丰富
23、绿油 23 两个实际育种 F2 群体 ,结合抗病性的人
工接种鉴定 ,测算 RM206 和 RpdH5 用于 MAS 的可
靠性。由于 RM206 在丰富占、CBB23 之间没有多态
性 ,所以又纳入 RpdS1184 进行测算。RpdS1184 与
RM206 位于 Xa23 基因的同一侧 ,但遗传图距为 716
cM(图 2) 。
对于丰富 23 群体 , RpdH5 和 RpdS1184 的 MAS
平均符合率分别为 9110 %和 8713 % (表 2) ,如果同
时使用这两个标记 ,可使 MAS 的准确率达 99 %(表
3) 。我们曾利用 J G30/ WBB1 的 F2 植株 , J G30/
WBB1、9520/ WBB1、南京 11/ WBB1、IR24/ WBB1 的 14
个 F3 家系 , 估算 OSR6 的 MAS 准确率为 9212 %
[Zhao K J1 et al . , Plant Genomics in China I (Ab2
stracts) . p104 , Dalian , China , July 24227 ,2000 ]。从
这些结果来看 ,我们的上述测算数据是可靠的。
对于绿油 23 群体 ,RpdH5、RpdS1184、RM206 的
平均 MAS 符合率分别为 7711 %、8111 %、8018 % (表
2) 。同时使用 RpdH5、RpdS1184 标记的 MAS 准确率
为 9013 % ;同时使用 RpdH5、RM206 标记的准确率为
9113 % ;同时使用 RpdH5、RM206、RpdS1184 标记的
为 9018 %(表 3) 。我们认为这些测算数据比实际效
率偏低 ,原因是在该群体的抗病接种鉴定中 ,有 12
个抗病单株由于抗感反应不够清晰而被归为感病植
株 ,从而使群体中感病植株数远多于 1/ 4 ,感病植株
的分子检测符合率仅为 65 %～7113 % ,从而拉低
MAS的平均符合率。3 个标记对抗病植株的分子检
测符合率较高 (分别为 8911 %、9018 %和 9419 %) 也
反证了这一点 (表 2) 。
由于使用 3 个分子标记的 MAS 符合率并不比
使用 2 个分子标记的 MAS 符合率显著提高 (表 3) ,
所以在实际应用中 ,选择 2 个位于 Xa23 基因两侧
的分子标记开展 MAS就足够了。就目前情况看 ,选
择 RpdH5 标记与 Xa23 基因另一侧的 RM206、OSR6、
RM187 和 RpdS1184 标记之一联合使用 ,可使 Xa23
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基因的 MAS准确率达 90 %～99 %。在实际应用中 ,
要根据亲本间的多态性 ,选择位于 Xa23 基因两侧
最近的 2 个标记开展 MAS ,这样不仅可以提高准确
率 ,而且可以增加中选个体与受体亲本的遗传背景
同质性。
由于目前利用 MAS对 Xa23 基因进行选择的准
确率为 90 %～99 % ,所以我们建议在育种利用的早
期分离世代 (F2～F4) ,可以利用 MAS ,到后期基本稳
定世代 ,中选株系可取少量种子 (15～30 粒) 在控制
的条件下进行人工接种鉴定抗病性 ,既不影响育种
进程 ,又确保 Xa23 基因不被丢失。
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