全 文 ：武汉植物学研究 1 9 9 5 , 1 3 ( 4 ) : 3 4 4一3 4 8
J o u rn a l oj Wu h a n B o t a n i e a l R e s e a rc h
亚麻下胚轴离体培养和转化的研究
李学宝 陈光荣 金 波
(华中师范大学生物系 武汉 43 0 7 0)
提 要 报道了亚麻 (反nu m us i t at is im “ , ) 的高频率植株再生和细胞转化 。亚麻下胚轴切段
培 养在 M S B 分化培养 基上 , 诱导 分化出不定芽 。最佳 的激素组合是 BA Zm g / L + IA A
。. s m g / L , 分化频率可达97 % 。在附加 BA l m g /L 和 N A A o . 。如g / L 的 M S B 培养基上 , 亚麻
下 胚 轴 外 植 体 的 不 定 芽分 化 频 率也 可 达 90 % 以 上 。 用根 癌 农杆 菌 ( A g ro 加ct e ri “m
tu m e fa ci en : )感染亚麻下胚轴外植体 , 在含卡那霉素 s om g / L 的选择培养基上筛选获得卡那霉
素抗性苗 , 并检测到 G U S 基因活性表达 。表明它们是转化植株 , 转化频率约为 2 % 。
关键词 亚麻 , 根癌农杆菌 , 下胚轴离体培养 , 转化
亚麻 (Li o m us l’t at is i m u m )隶属亚麻科 , 是重要的纺织纤维和工业油料作物 , 它还可
能成为食用油和蛋 白质的重要来源〔’〕。近年来 , 虽然国外已有一些转化亚麻的报道 , 但大
多转化频率偏低 , 甚至不能再生转化植株〔卜 5〕。国内有关亚麻转化 的报道则极少 。建立一
个良好的再生和转化 系统 , 以便能够利用遗传操作技术改 良亚麻 品种 , 无疑具有重要的应
用价值 。我们以亚麻下胚轴为材料 , 研究了亚麻离体培养和转化的一些条件 , 旨在建立一
个简便而有效的实验 系统 , 进而将外源 目的基因 (例如 , 抗虫基因 )导入该作物 。
1 材料与方法
1
.
1 亚麻下胚轴培养
本试验所用亚麻品种为宁 亚 一1号 (五i , , 、m u s i t 。 t i s s i m u m e v . N in g y a N o . 1 1 ) 。将亚麻
种子用 自来水冲洗后 , 浸泡数小时 , 然后用。. 05 % H gC1 2表面灭菌 1 s m in , 无菌水冲洗 4一5
次 , 置 MS 培养基 [6j (不含激素 )上萌发生长 5一 7d , 取无菌苗下胚轴用作试验材料 。
在超净工作 台上将下胚轴切成约 0 . 5 。m 长的切段 , 接种在 M S B 分化培养基 ( M S 无
机盐 + B S维生素 [ , ] )上 , 光照培养 ( 2 5 。士 I C , 2 0 0 0 l x , 1 2 h / d ) , 形成愈伤组织并分化出芽 。
2 0一3 0d 后 , 统计分化频率 。
1
.
2 根癌农杆 菌培养和诱 导活化
试验所用根癌农杆菌 (A g ro 吞a c t e r i u , n t u n Ze fa c i e n : )为 P G V 2 2 6 0 ( p B l l Z I ) , 双质粒系
收稿 日 : 19 9 4一 0 8 一 3 1 , 修回 日 : 1 9 9 4 一 1 1 一 2 5
第 4期 李学 宝等 : 亚麻 下胚轴离体培 养和转化的研 究
统 ‘ p B I 1 21 质粒上带有新霉素磷酸转移酶 H (N P T I )和 件葡萄糖昔酸酶 (G U S) 基 因 , 能
够 在真核 细胞 中表达 。将 根癌农杆菌 P G V 2 60 ( p BI 1 21 ) 培养在含 氨节青 霉素 ( A p )
s om g / L 和卡那霉素 ( K m ) s o m g / L 的 A B 固体培养基 [ 8〕(用 1 . 5 %琼脂固化 ) 上 2一4 d , 形
成单菌 落 。 挑 取单个 菌 落 , 接 种 在 约 Z o m 1A B 液体 培 养基 中 , 2 7 ℃条 件 下 振 荡培养
( Zo o r / m i n ) 2一 3d 。待细菌密度约达 1 0 , 一1 0 , / m l 时 , 离心收集细菌 。将 细菌重新悬 浮于
ZOm l 修改的 A B 诱导培养基 [a] (添加 乙酞丁香酮和章鱼碱各 1 0 m g / L ) 中 , 在上述条件下
继续振荡培养8一 1 2h , 活化细菌 vi r 区基因 。
1
.
3 转化方法
将亚麻下胚轴切段浸入菌液 (细菌密度约为 1。,一 1 05 / m l) 中约 5一 l om in , 用无菌滤纸
吸干多余的菌液 , 置 M SB 培养基上共培养 ( 25 C ) 48 一 7 2h 。然后 , 将外植体转移到含 A p
40 om g /L 和头抱氨唾肪钠 ( ce f ) Zo om g / L 的 M S B 培养基上 , 光照培养 5一 7d , 再将外植体
转移到含 K m 50 m g / L 的 M SB 选择培养基上 , 继续光照培养 , 筛选转化体 。筛选期间 , 每2
周更换一次选择培养基 。将筛选得到的 K m 抗性芽连 同母体 愈伤组 织转 入附加 BA O.
l m g /L
,
IB A 0
.
Zm g /L 和 K m 5 0m g / L 的 M S 选择培养基上 , 促进不定芽伸长生长 , 形成
幼苗 。切下幼苗 ,诱导生根 。
1
.
4 G U S 活性分析
用组织化学法〔’“〕测定转化愈伤组织和转化植株叶片的 G U S 活性 。
2 实验结果
2
.
1 培养
植物离体培养中外植体及其愈伤组织的分化频率直接影响转化效率 。在 M S B 培养
基中添加各种不同的激素成
表 1 植物激素对亚麻下胚轴不定芽分化的影响 ‘ 分 , 观察亚麻下胚轴外植体
T a b l e 1 E f fe e ‘ o f p h y , o h o r m o n e s o n s h o o t 的愈伤组织形成和器官分化
d i f f e r e n ‘ia ‘io n f r o m h y p o c o , y l e x p la n , 5 o f f la x 情况 (表 l ) 。亚麻下胚轴切段
出 芽 的
外植体数
N o
. o f
e x P l a n r s
w i t h
s h o o t s
出芽率 (环 )
F e e q u e n e y
o f s h o o t
r e g e n e r a t l o n
培 养 在 附 加 B A 0 . 5一
Zm g / L 和 生 长 素 ( N A A 或
I A A ) 0一 0 . sm g / L 的 M S B
培养基上 , 7d 左右下胚轴开
始膨大 , 从 切 口周 围首先形
成黄色或浅黄色 愈伤组织 ,
随后整个外植体逐渐脱分化
为愈伤组 织 。光照培养 15 一
Z od 后 , 开 始分化形成不定
芽 。试验表明 , 亚麻下胚轴具
有强的再生能力 , 在多种 不
同激素组合的条件下 , 均 能
以较高 的频率诱导 分化 出
Zm g / L 和 I A A 0 . s m g / L 时 , 愈伤组
.勺‘曰刃5JU|卜户On八沐丫矛r
-aU七名了巨OJ”‘L粼催N(xPul工孟之人少ec激素组合
P h y t o h o r m o n e
e o m b i n a t io n
( m g / I
,
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内jcon八曰月了,‘一二JO口‘任月bQ亡怡6n b亡Jg曰n6t了‘匀月任匕O1人,目三,孟,自100UnC自咋J几l曰,d八舀j八C工」B A 0
.
5
B A I
B A Z
B A 0
.
5 + N A A 0
. 0 2
B A I + N A A 0
.
0 2
B A Z+ N A A 0
. 0 2
B A 0
.
5 + I A A 0
.
5
B A I 十 IA A 0 . 5
B A Z+ IA A 0
.
5
M SB 基本培养基
M SB b a s i e m e d iu n 、
芽 , 最高可达 90 % 以上 (表 1 ) 。M S B 培养基附加 BA
武 汉 植 物 学 研 究 第13 卷
织上不仅形成许多不定芽 , 尚观察到有胚状体分化 , 表明这种激素组合有 良好的效果 。在
附加 B A l m g / L 和 N A A 0 . 02 m g / L 的 M S B 培养基上 , 亚麻下胚轴分化形成的不定芽数
量较多 , 且多数形态正常 。将不定芽连同愈伤组织转移到含 B A 0 . l m g / L 和 IB A 0 . Zm g /
L 的 M S 伸长培养基上 , 可迅速伸长生长 , 形成幼苗 。
2
.
2 转化
经根癌农杆菌 P G v 2 2 6。( pBI 1 2 1) 感染的亚麻下胚轴切段在无选择压力的情况下培
养 5一 7d , 启动细胞分裂和分化 。然后 , 将开始膨大的下胚轴切段转移到含 K m 50 m g / L 的
选 择培养基上 , 可形成愈伤组织和不定芽 (图版 I : 1 ) 。经 K m 50 m g / L 筛选 3 0d 后 , 多数
不定芽 白化死亡 , 仅极少数不定芽保持绿色 , 并可在伸长培养基上生长成苗 (图版 I : 2 ) 。
在含 K m 50 m g / L 的选择培养基上形成的愈伤组织大多褐化 , 少数生长正常 , 色泽淡黄 。
将此种 K m 抗性愈伤组织继代培养在不含 K m 的 M S B 分化培养基 (附加 BA Zm g / L 和
I A A 0
.
sm g / L) 上 , 分化 出不定芽 。将不定芽转入含 K m 50 m g / L 的 M S 伸长培养基上 , 部
分不定芽可伸长生长成苗 , 其余则逐渐 白化死亡 。这表明最初在选择培养基上形成的不定
芽或从愈伤组织分化的不定芽中 , 有相当数量的非转化体 。因此 , 适当延长筛选时间是十
分必要的 。经 60 一70 d 的筛选后 , 得到 5株 K m 抗性苗 , 转化频率 (K m 抗性苗 /接种的外植
体总数 )约为 2 % 。将小苗从基部切下 , 诱导生根 , 长成完整植株 。
2
.
3 转化体的 GU S 活性分析
取上述筛选的 K m 抗性愈伤组织和植株叶片 , 用组织化学法测定细胞 G U S 表达活
性 。试验结果表明 , K m 抗性愈伤组织和再生的 K m 抗性植株大多能表达 G U S 酶活性 , 而
对照不显蓝色 (图版 I : 3一 6 ) 。这证实外源 GU S 基因可能已整合到亚麻细胞基因组中并
得到稳定表达 。在所筛先的 5株 K m 抗性植株中 , 仅有 1株未检测到 G U S 活性 , 表明其是
非转化体 。推测可能是 由于在大量未转化苗中 , 有极少数苗对 K m 产生 了一定的耐性所
致 。或者仅 N P T I 基因插入到细胞基因组 中 , 而 GU S 基因丢失 。这一问题尚待进一步探
讨 。
3 讨论
我们的试验表明 , 亚麻5一 7d 龄的下胚轴具有极佳的再生能力 , 是一个 良好的再生系
统 。而且 , 早期的研究 ( S m i th 和 T o w ns en d , 1 9 0 7) 指出 , 亚麻是一个易被农杆菌感染的双
子叶植物 , 可形成冠瘦瘤或发状根仁5 〕。由此可见 , 探讨亚麻转化的条件 , 建立一个较为理想
的转化系统应是可能的 。但是 , Z h an 等 〔, 〕用根癌农杆菌感染亚麻子叶和下胚轴外植体 , 仅
获得转化的愈伤组织 , 不能分化出苗 , 或者筛选得到的均是 “假阳性 ”苗 。推测可能是转化
愈伤组织细胞 “交叉保护 ” ( 。 r o s s p r o t e e t )未转化苗 , 使其产 生 Km 耐性所致 。 J o r d a n 和
M o H u g h e n[ ’‘〕也指 出 , 从转化愈伤组织难于再生转化苗 。上述结果似乎表明 , 农杆菌感染
细胞后 , 存在某种 尚未明了的因素 , 可能干扰细胞分化和再生过程 , 从而不能诱导器官分
化 。 D o n g 和 M c H u g h e n 改善转化条件 , 获得亚麻转基因植株[4] 。但他们发现 , 在选择培养
基上形成的再生植株中 , 80 %以上为“假阳性苗 ” , 检测不到 G U S 活性 , 这些苗被称为“ es -
。a p e s ”L4, “
, ’2〕。产生这种现象的原因可能是仅有少数细胞被转化 , 这些转化细胞可以保护
大量的非转化细胞 , 使之不受选择剂的作用 , 导致分化出苗[’] 。我们在试验 中也观察到 , 亚
麻愈伤组织中转化细胞和非转化细胞掺杂在一起 , 形成嵌合体 。用组织化学法检测 G U S
第 4期 李学宝等 : 亚麻下胚轴离体培 养和转化的研究 3 4 7
活性时 , 仅部分细胞呈蓝色反应 , 而另一些细胞不显蓝色 。因此 , 从这些嵌合愈伤组织来源
的苗 , 必须在选择培养基上进一步筛选 ,淘汰“逃逸 ”的非转化体 。
如何提高转化效率 , 一直是许多研究者关注的问题 。在亚麻的转化 中 , 一些研究者采
用预培养 , 增加外植体的伤 口 面积以及延长共培养时间等方法 , 使转化频率有所提高[’] 。
我 们在 以往的研究 [ls 一 , 5〕中证明 , 乙 酞丁香 酮等多酚类物 质可 以显著提高 转化细 胞的
GU S 表达活性 。因此 , 我们在亚麻 的转 化中用乙酞丁香酮和 章鱼碱预培养农杆菌 , 活化
vi r 基因 , 促进 T 一D N A 向亚麻细胞转移 。外植体一农杆菌共培养结束后 , 先在无选择 压力
的情况下培养5一 7d , 促进细胞启动分裂和分化 ; 然后再转移到选择培养基上 , 有利于已转
化的细胞形成胚性细胞团 , 避免或降低 K m 对分化的抑制作用 , 从而导致由转化细胞起源
的器官分化 , 形成不定芽 , 其转化频率 为2 % 。
综上所述 , 我们通过外植体一农杆 菌共培养法 , 将外源 G U S 和 N P T I 基 因导入亚麻
细胞 , 获得稳定表达 G U S 活性的亚麻转化植株 。这为研究亚麻 的遗传转化和利用植物基
因工程技术改 良亚麻品种提供了一些 实验依据 , 具有一定的科学意义 。
参 考 文 献
2
3
4
5
6
7
8
9
l 0
1 1
G r e e n A G , M a r s h a l l D R
.
I s o l a t io n o f i n d u e e d m u r a n t s i n l i n s e e d ( 瓜, : u m u si t a r i s s i n : u m ) h a v in g r e d u e e d lin o l e n i e
a e id e o n t e n t
. E uP 勺t i e a , 1 9 8 4 , 3 3 ( 4 ) , 3 2 1一 3 25
J o r d a n M C , M e H u g h e n A
.
G ly p h o s a t e t o l e r a n t f l a x p l a n t s f r o n , A g r o b a e t e r i u m 一m e d i a t e d g e n e t r a n s fe r
.
P l a n t Ce l l
R 叻 , 1 98 8 , 7 ( 5 ) : 2 8 1一 2 8 4
D o n g J Z , M e H u g h e n A
. P a t t e r n s o f t r a n s fo r m a t i o n i n t e n s i t y o n f l a x h y p o e o t y l s i n o e u l a t e d w i t h A g ro b a c t e 石 u m
r u m efa e i e
, , 5 . p l a , :t Ce zl 尺叻 , 1 9 9 1 , 10 ( 1 0 ) : 5 5 5一 5 6 0
D o n g J 2
.
M e H u g h e n A
.
A n im p r o v e d p r o e e d u r e fo r p r o d u e r i o n o f t r a n s g e n i e fl a x p la n r s u s i n g A g ro b a c te ri u m
t u m efa c i e
, : 5
.
p l a , : t S c ,
, 1 9 9 3 , 88 ( l ) : 6 1一 7 1
Z h a n X C
,
J o n e s D A
,
K e e r A
.
R e g e n e r a t i o n o f f l a x p l a n r s t r a n s f o r m e d b y A g r ob a e t e ri u m r h i z o g e , : e s
.
P l a ,: t 几肠l
B i o l , 1 9 8 8
,
11 ( 6 ) : 55 1一 5 59
M u r a s h ig e T , S k o o g F , A r e v i s e d m e d i u m f o r r a p id g r o w r h a n d b io a s s a y s w i t h t o b a e e o t i s s u e e u l t u r e
.
P hy s io l
P l a , : r
, 1 96 2 , 1 5 ( 5 ) : 4 7 3一 4 9 6
G a m b o r g ( ) I
,
M i l le r R A
,
( ) j im a K
.
N u t r i e n r r e q u i r e m e n t s o f s u s p e n t io n e u l t u r e o f s o y b e a n r o o t e e l l s
.
E xP Cc l l
R e ,
, 1 9 6 8
,
50 ( 2 ) : 1 5 1一 1 5 8
C h . l t o n M D
,
C u r r i e r T , F a r r a n d s o r a l
. A g r 记沾a c r e ri u m t u n : 亡为 e论, : s D N A a n d P S g b a e t e r io p h a g e DN A n o t d e t e e -
t e d i n e r o w n g a l l t u m o r s
.
p roc N a r l A e a 己 S e i (U S 月 )
,
1 9 7 4
,
71 ( 7 ) : 3 6 7 2一3 6 7 6
W i n a n s S C
,
K e r s t e t t e r R A
,
N e s t e r E W
.
T r a n s e r ip t io na l r e g u l a t i o n o f t h e v i r A a n d v i r G g e n e s o f A g ro ba c t e ri u n 吕
t u m e j 乙e i e , : s , J B a c r e月 0 2 , 1 95 5 , 170 ( 9 ) : 4 0 4 7一 4 0 5 4
J e f fe r s o n R A , K a v a n a g h T A
,
Be v a n M w
.
G US f u s io n : 卜g l u e u r o n id a s e a s a s e n s i t iv e a n d v e r s a t i le g e n e f u s io n
m a r k e r in h ig h e r p l a n t s
. E MB O J
, 1 9 8 7 , 6 ( 1 5 ) : 3 9 0 1一3 9 0 9
J o r d a n M C , M e H u g h e n A
.
T r a n s f o r n 、e d e a l l u s d o e s n o t n e e e s s a r i ly r e g e n e r a t e t r a n s fo r m e d s h o o t s
.
P l a n t Ce l l
R e P
, 19 8 8
,
7 ( 6 ) : 2 8 5一 2 8 7
M e H u g h e n A
,
J o r d a n M C
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R e e o v e r y o f t r a n s g e n i e p l a n r s f r o m ‘e s e a p e ’ s h o o r s
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P l a , : r Ce l l R护 , 1 9 8 9 , 7 : 6 1 1一6 1 4
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,,J1人, l
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‘任舀,且电.二
P L A N T R E G E N E R A T I O N A N D T R A N S F O R MA T I O N
O F L I N U M U S I T A T I S S I MU M
H Y P O C O T Y L I N V I T R口
L i X u e b a o C h e n G u a n g r o n g J i n Bo
( Z泥户a 材m 。 , : t 硬 B io lo 盯 , N o rm a l U , , rs i ty of Ce 一:r ra l Ch i o a W u h a , : 4 3 0 0 70 )
A b s t r a e t S h o o t s r e g e n e r a t e d f r o m h y p o e o t y l e x P l a n t s o f L i” u m u s i t a t i s s im u m o n M S B
d if f e r e n t ia t i o n m e d i u m u n d e r e o n d i t i o n o f l ig h t ( 2 5
’
C , 2 0 0 0 l x , 1 2 h / d )
.
o p t im a l s h o o t
d if fe r e n t ia t i o n m e d i u m w a s M S B m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h BA 2 m g / L a n d IA A 0
.
5
m g / L
, w h ie h r e s u l t e d in 9 7 % o f s h o o t r e g e n e r a t i o n f r e q u e n e y
.
T h e h y p o e o t y l e x p l a n t s
w e r e i n fe e t e d b y A g ro b a e t e r i u m t u m e fa e i e n s s t r a i n P G V 2 2 6 0 ( p B I 1 2 1 ) e o n t a i n i n g N P T
1 a n d G U S g e n e s
, a n d s u b e u l t u r e d o n M S B s e l e e t io n m e d i u m e o n t a i n i n g k a n a m y e in 5 0
m g / L t o s e l e e t t r a n s f o r m a n t s
.
T h e n
, t h e t r a n s fo r m e d s h o o t s w e r e r o o t e d
.
S t a b le e x p r e s
-
5 io n o f G U S g e n e i n t h e t r a n s f o r m e d e a l l i a n d p l a n t s w a s e o n f ir m e d b y h i s t o e h e m ie a l a s -
s a y o f t h e G U S a e t iv i t y
.
T h e t r a n s fo r m a t io n f r e q u e n e y o f fl a x h y p o e o t y l w a s a b o u t Z%
.
K e y w o r d s L i n u m u s i t a t i s s im u m
, A g ro ba e r e r i u m t u m ej h c i e n s
,
H y p o e o t y l e u l t u r e i n v i t
-
ro
,
T r a n s fo r m a t i o n