全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(12): 2185−2191 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由高等学校学科创新工程计划“111”项目(B12006)和国家自然科学基金项目(31071450)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 李加纳, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn
Received(收稿日期): 2011-12-01; Accepted(接受日期): 2012-07-05; Published online(网络出版日期): 2012-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121008.1258.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.02185
甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立
林 呐 刘列钊 殷家明 王 瑞 柴友荣 李加纳*
西南大学农学与生物科技学院 / 重庆市油菜工程技术研究中心 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 利用黄籽甘蓝型油菜自交系建立和优化了遗传转化系统。首先构建了由质粒 pCNR 与 Δ6-脂肪酸脱氢酶基
因插入到植物的高效表达载体 pCAMBIA2301G。利用在 Murashige和 Skoog培养基(含有 200 μmol L–1乙酰丁香酮)
培养 5~7 d的下胚轴外植体与农杆菌株 LBA4404共培养 63~69 h (pCNR), 再于芽诱导培养基上培养 3个月诱导芽再
生。在最佳条件下, 平均转化效率约为 1.3%。转化植株的 GUS 分析和 PCR 分析结果表明, 外源基因成功导入甘蓝
型油菜。Southern杂交表明, 这些转化子含有目标基因 1~2个拷贝。用气相色谱分析转基因植物种子的脂肪酸, γ-亚
麻酸含量达 8.2%。
关键词: 甘蓝型油菜; Δ6-脂肪酸脱饱和酶; 转化
Establishment of Transformation System Using Inbred Line of Yellow-Seeded
Brassica napus
LIN Na, LIU Lie-Zhao, YIN Jia-Ming, WANG Rui, CHAI You-Rong, and LI Jia-Na*
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University / Chongqing Rapeseed Engineering & Technology Research Center / Engineering
Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China
Abstract: In this study, we established a transformation system using an inbred line of yellow-seeded Brassica napus. Hypocotyl
explants precultured for 5–7 d on Murashige and Skoog medium containing 200 μmol L–1 acetosyringone were cocultured with
Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 (pCNR) for 63–69 hours. The plasmid pCNR was constructed by inserting Δ6-fatty
acid desaturase gene from Rhizopus stolonifer into plant high-efficient expression vector pCAMBIA2301G. Kanamycin-tolerant
shoots were regenerated on shoot induction medium for three months after Agrobacterium inoculation. The average transforma-
tion efficiency was about 1.3% under optimal conditions. Results from GUS assay and PCR analysis of transformed plants indi-
cated that the introduced gene was integrated into B. napus genomes. The result of Southern blot revealed that those transformants
carried one or two copies of the goal gene. The fatty acids of the transgenic plant seeds were analyzed by GC, and the γ-linolenic
content was 8.2%.
Keywords: Brassica napus; Δ6-fatty acid desaturase; Transformation
甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物, 应用遗
传工程技术能有效地将新基因导入油菜[1]。尽管已
报道了很多转基因油菜, 但不同品种转化效率都表
现出不同且普遍偏低, 这在很大程度上限制了转基
因技术的使用[2-3]。油菜中农杆菌介导转化受供体植
株年龄、外植体类型[4]、培养条件等的影响。即使
目前的遗传转化方法对大多数主要作物类型可行 ,
但也仅仅应用于每一类少数再生频率很高的品种。
目前应用于转化实验的芸薹属栽培种的数目很
有限[4]。过去, 甘蓝型油菜转化方法主要应用在加拿
大低芥酸油菜特性的春油菜品种(Westar)[5]中, 但该
品种生长期太短, 在田间已经被高产量的栽培种替
代。黄籽油菜栽培种具有较低皮壳纤维素含量、较
高含油量及较高田间产量, 在中国将会替代许多黑
籽栽培种。因此, 未来新的栽培种需要从细胞质导
入新基因的材料中寻找。
本研究的主要目标是获得高效的再生体系和利
用黄籽品系 GH01 优化参数建立一个有效的转化体
2186 作 物 学 报 第 38卷

系。自交系材料 GH01 通过含双元载体 pCNR 的农
杆菌品种 LBA4404 进行转化, 含 Δ6-脂肪酸脱氢酶
基因(GenBank 登录号为 AY795076)[6]的质粒 pCNR
由我们实验室构建, Δ6-脂肪酸脱氢酶基因来源于匍
枝根霉, 能产生一种限制性内切酶(Δ6-脂肪酸脱氢
酶), 它能使亚油酸转化成 α-亚麻酸和 γ-亚麻酸, γ-
亚麻酸对人体非常有益。我们的最终目标是使本身
不带 Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的甘蓝型黄籽油菜转基
因后带有此基因。
1 材料与方法
1.1 菌种和质粒
实验中的根癌农杆菌菌种是含 pCNR [7]的
LBA4404 [8]。pCNR是个含卡拉霉素基因和 GUS基
因的双元载体[9](图 1)。
1.2 植株材料
2 个来源于甘蓝型黄籽的自交系材料 GH01 和
SH01, 作为外植体进行愈伤组织培养, 检测下胚轴
的再生频率, 3次重复。下胚轴为 5~7日龄, 作为外
植体被切成 5 mm长的切段(每个品系 100切段)培养
在分化培养基中。2周后, 考察芽和愈伤组织形成的
频率。
1.3 农杆菌的培养和与外植体的共培养
在含 50 mg L–1卡拉霉素的 50 mL液体培养基
YEP [10]的无菌培养瓶中培养农杆菌的单克隆菌株,
28 , ℃ 于 200~210转 min−1的摇床上, 暗培养振荡过
夜。转化培养基可见表 1。
弱光下, 下胚轴切段被预培养在 Y1 培养基(表
1)上 5~7 d, 过夜培养的农杆菌菌液浓度(OD600)达到
0.4~1.5时, 将以 1∶1比例稀释的液体MS培养基转
入装有 100~200 μmol L–1 乙酰丁香酮的小培养皿,
将植物材料浸渍在菌液中 5~10 min并不断振荡。外
植体收集后用干燥的无菌滤纸去掉多余的菌液, 再
把清洗后的外植体接入含 Y1培养基的培养皿中。用
封口膜密封培养皿, 并在 22~28℃黑暗条件下共培
养 2~3 d。
1.4 压力筛选
用 300 mg L–1羧苄青霉素的 MS培养基清洗感
染的外植体, 防止附着的农杆菌继续生长, 并将其
转入 F1-Cab-Km培养基中。经过 15~20 d培养后, 下
胚轴长出的愈伤组织被筛选后移入含 10~100 mg L–1
的卡拉霉素和 100~300 mg L–1羧苄青霉素的 F2-Km-
Cab培养基中再生芽, 经过 40~60 d培养后, 将再生
芽转入生根培养基中长成完整植株。
大约培养 12周后, 绿色愈伤组织形成。绿色愈
伤组织形成率(%)=带绿色愈伤的外植体数/外植体数×
100, 芽形成效率(%)=芽的数目/外植体数目×100。
1.5 β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)活动的检测
按 Jefferson [11]的方法进行组织化学 GUS染色。



图 1 转化载体 pCNR 的 T-DNA 区域部分线性图
Fig. 1 Schematic diagram of a part of the T-DNA region of transformation vector pCNR
RB: 右端; LB: 左端; P-napin: 编码种子贮存蛋白的启动子; Npt II: 新霉素磷酸转移酶基因; T-nos: 根癌农杆菌 Ti质粒胭脂碱合酶基
因的终止子; P-35S: 花椰菜花叶病毒 35S启动子; GUS: β-葡萄糖苷酸酶基因。
RB: right border; LB: left border; P-napin: promoter of encoding seed storage protein; Npt II: gene for neomycin phosphotransferase; T-nos:
terminator of nopaline synthase; P-35S: promoter of Cauliflower mosaic virus; GUS: gene for β-glucuronidase.

表 1 组织培养和转化的培养基
Table 1 Medium used for tissue culture and transformation
培养基
Medium
成分
Composition
培养时间
Cultured time (d)
预培养基 Pre-cultured medium (Y1) MS medium, 6-BA 1.0 mg L–1, 2,4-D 2 mg L–1 4–7
共培养基 Co-cultured medium Y1 medium, ACS 200 μmol L–1 2–3
筛选培养基 Selected medium (F1) MS medium, 6-BA 4.0 mg L
–1, 2,4-D 0.5 mg L–1, Km 100–200 mg L–1,
Cab 300 mg L–1, AgNO3 6 mg L–1
15–30
分化培养基 Differentiation medium (F2) MS medium, 6-BA 2.0 mg L
–1, NAA 0.1mg L–1, Km 60 mg L–1, Cab 100
mg L–1, AgNO3 6 mg L–1
40–60
生根培养基 Rooting medium MS medium, NAA 0.5 mg L–1, Km 60 mg L–1 15–20

第 12期 林 呐等: 甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立 2187


将下胚轴和叶片组织浸入 X-gluc 水溶液中(含 0.5
mg L–1 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸环己胺盐,
0.5%聚乙二醇辛基苯基醚, 20%甲醇和 50 mmol L–1
磷酸钠, pH 7.0)。反应的混合液在 37℃培养过夜。
为去掉叶绿素, 把外植体浸入酒精中脱色。
有些重要的因素会影响转基因植物再生, 例如
外植体预培养时间、农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度、
共培养时间等。为测试农杆菌转化的效率, 用组织
化学 GUS染色法检测不同预培养时间(设定 5个时
间)、共培养时间(设定 6 个时间)、乙酰丁香酮浓度
(设定 4 种浓度)以及农杆菌浓度(设定 6 种浓度)的
影响, 通过数据分析, 确定最佳条件。此方法也用
于卡拉霉素抗性植株的愈伤组织、根、花和角果的
检测。
1.6 PCR和 Southern杂交分析
按 CTAB法[12]从转基因植株和非转基因对照植
株的叶片组织中把基因组 DNA提取出来。设计编码
基因 RnD6D区域的 2条特异引物, 用于基因组DNA
扩增这个长 1.4 kb的基因片段。RnD6D基因扩增的
正向引物序列 5′-ATCTAGAATGAGTACATTAGAT
CGTCCTAT-3′有 30个碱基的寡核苷酸, 反向引物序
列 5′-AGAGCTCGAAAGATTTTATTTTATGCTTTCT
AAAAGG-3′有 37 个碱基的寡核苷酸。PCR 的总体
积是 25 µL, 含 10 ng的模板 DNA、2.5 µL 10×PCR
缓冲液、1.5 µL 25 mmol L–1 MgCl2、0.5 µL 10 mmol
L–1 dNTPs混合液、5 µmol L–1正反引物各 1 µL、0.25
µL Taq 酶以及一些无菌水。PCR 反应 30 个循环,
94℃预变性 2 min, 循环包括 94 1℃ min, 54 1℃ min,
72 2℃ min。以 0.8%琼脂糖胶电泳扩增 DNA片段,
紫外透射仪显像, 数码相机拍照。
用 Hind III酶降解约 55 μg基因组 DNA, 用含
TAE缓冲液的 0.8% (W/V)琼脂糖胶电泳, Hind III在
某一点切下了 pCNR 的 T-DNA 区域, 将 DNA 片段
转移到尼龙膜上, 以 RnD6D 基因编码区域为探针,
通过构建地高辛引物和地高辛荧光检测试剂进行杂
交和检测(Roche Diagnostics, 瑞士), 按地高辛检测
试剂盒(Roche Diagnostics)说明书进行冲洗和检测。
1.7 GC脂肪酸分析
按 Rücker 和 Röbbelen [13]的方法, 将每个转化
株自交种子(50 mg)放入气相色谱仪中分析脂肪酸成
分, 以含 γ-亚麻酸的月见草(Oenothera erythrosepala
Borb.)种子作为对照。使用日本岛津公司带有 DEGS
0.125毫米×30柱和 FID检测器的 GC-2010仪器进行
色谱分析。运行参数为 : 分流比 100∶1, 柱温度
180℃, 柱速度 50 mL min–1, 气化室温度 250℃。
将 1~2颗样品种子放入 5 mL离心管, 加入 1∶1
的石油醚: 乙醚溶液 3 mL后研磨、破碎, 磨 0.5 min。
吸出混合溶液后放入 5 mL另一离心管(耐有机溶剂
的材料)中, 在超声波清洗器中室温水浴 10~20 min。
吸 2 mL澄清透明液体于另一 5 m离心管, 并添加 1
mL 0.4 mol L−1甲醇溶液混合, 然后在室温静置 30
min。加 2 mL 蒸馏水后振荡, 然后 10 000×g 离心
1~2 min备用。从样品中吸出澄清透明液体放入气相
色谱仪的样品瓶, 并把瓶子放在自动注入器中进行
测试。
脂肪酸含量用脂肪酸总和的百分比表示。检测
到的脂肪酸有棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)、亚油酸
(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、二十碳烯酸(C20:1)和芥酸
(C22:1)。
2 结果与分析
2.1 甘蓝型黄籽油菜的再生频率
表 2 表明, 自交系 SH01 有较低的芽形成频率,
而黄籽自交品系 GH01 有较高的芽形成频率, 因此,
GH01被用于进一步实验。
2.2 组织化学 GUS染色检测
2.2.1 预培养时间 预培养时间对转化效率的影
响通过农杆菌侵染外植体 GH01 下胚轴(图 2-a)来检
测。外植体预培养 5~7 d会产生大量具有 GUS阳性表
现的愈伤组织(图 2-b)。按照卡平方测验(P<0.01) [14],
所有预培养时间都差异显著(表 3)。最低 GUS 阳性表
现在没有预培养的外植体上。结果表明, 预培养时间显
著影响农杆菌侵染油菜的效率(表 4)。

表 2 甘蓝型黄籽油菜的芽再生频率
Table 2 Shoot regeneration frequency in yellow-seeded B. napus (%)
芽再生频率 Shoot regeneration frequency 材料
Material 重复 1 Repeat No. 1 重复 2 Repeat No. 2 重复 3 Repeat No. 3
平均
Average
SH01 18.24 16.36 20.38 18.33
GH01 38.69 51.28 61.35 50.44

2188 作 物 学 报 第 38卷




图 2 外植体下胚轴(a)和愈伤组织(b) GUS 基因的表达
Fig. 2 Expression of GUS gene in hypocotyls explants (a) and
callus (b)

所有共培养时间按卡平方测验也表现极显著差异
(P<0.01)。
2.2.2 共培养基上的乙酰丁香酮浓度 乙酰丁香
酮能提高农杆菌转入寄主植株的能力并被放入各种
培养基中用于细菌和植物组织共培养[15-17]。共培养基
中检测了乙酰丁香酮的 4 种浓度(0~300 μmol L–1),
结果含有 200 μmol L–1乙酰丁香酮的培养基有最高
的侵染能力(表 5), 并且按卡平方测验(P<0.01), 这
个浓度和其他较低浓度比较差异极显著。尽管侵染
GH01 的这个浓度和其他较高浓度间没有显著差异,
但下胚轴切段在较高浓度乙酰丁香酮存在下有褐变
的趋势, 影响芽的再生。
2.2.3 农杆菌浓度 农杆菌浓度是提高侵染力很
重要的因素。通常情况下, 对数期生长的农杆菌具
有最高的侵染力。4种 MS培养基稀释后的农杆菌浓
度(OD600值 0.2~1.2)中, OD600值 1.0~1.2有利于外植
体的侵染(表 6), 并且按卡平方测验(P<0.01), 农杆
菌浓度对下胚轴转化效率影响差异极显著。这也表
明农杆菌浓度直接影响浸染效率。
2.3 转化
在含 100~200 mg L–1卡拉霉素的筛选培养基上
培养外植体 2 个月后, 大量卡拉霉素抗性的愈伤组
织再生出来。转入含 60 mg L–1卡拉霉素的芽分化培
养基 4 个月后获得卡拉霉素抗性植株。经 3 次重复
实验, 最终有 775 个愈伤组织、26个绿色愈伤组织

表 3 预培养时间对农杆菌侵染后 GH01 下胚轴转化效率的影响
Table 3 Effect of preculture periods on transformation efficiency in hypocotyls of GH01 with Agrobacterium tumefaciens strain
预培养时间
Preculture time
外植体数
No. of explants
GUS阳性外植体数
Number of GUS+ explants
GUS阳性外植体效率
Frequency of GUS+ explants (%)
χ2 χ20.01,4
0 d 87 22 25.29
3 d 99 30 30.30
5 d † 108 78 72.22 †
7 d † 94 84 89.36 †
8 d 99 43 43.43
116.774 13.28
LBA4404是用作浸染培养液。外植体在 25℃, 黑暗条件下被共培养 3 d。† 表示较好的结果和较好的实验条件(下同)。
LBA4404 was used as inoculum. Explants were cocultured for 3 days at 25°C in the dark. † denotes better results and better experimental con-
dition (the same below).

表 4 共培养时间对 GH01 下胚轴转化效率的影响
Table 4 Effect of coculture periods on transformation efficiency in hypocotyls of GH01
共培养时间
Co-culture time
外植体数
No. of explants
GUS阳性外植体数
No. of GUS+ explants
GUS阳性外植体效率
Frequency of GUS+ explants (%)
χ2 χ2 0.01,5
12 h 80 0 0
24 h 90 0 0
48 h 99 44 44.44
63 h † 92 76 82.61 †
69 h † 90 73 81.11 †
72 h 90 22 24.44
256.742 15.09

表 5 乙酰丁香酮浓度对 GH01 下胚轴转化效率的影响
Table 5 Effect of acetosyringone concentration on transformation efficiency in hypocotyls of GH01
乙酰丁香酮浓度
Concentrations of acetosyringone
外植体数
No. of explants
GUS阳性外植体数
No. of GUS+ explants
GUS阳性外植体效率
Frequency of GUS+ explants (%)
χ2 χ20.01,3
0 μmol L–1 98 20 20.40
100 μmol L–1 88 34 38.64
200 μmol L–1 † 94 72 76.60 †
300 μmol L–1 87 40 45.98
63.269 11.34
第 12期 林 呐等: 甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立 2189


表 6 农杆菌浓度对 GH01 下胚轴转化效率的影响
Table 6 Effect of Agrobacterium concentration on transformation efficiency in hypocotyls of GH01
农杆菌浓度
Concentration of Agrobacterium (OD600)
外植体数
No. of explants
GUS阳性外植体数
No. of GUS+ explants
GUS阳性外植体效率
Frequency of GUS+ explants (%)
χ2 χ20.01,4
0.2 87 10 11.49
0.4 99 31 31.31
0.6 84 50 59.52
0.8 76 48 63.16
1.0 † 110 86 78.18 †
1.2 † 98 65 66.33 †
118.171 15.09

和 13 株芽从 971 个外植体中再生出来。经 PCR 扩
增和组织化学 GUS染色证实这 13株芽都是 RnD6D
基因的转化株。
组织培养和农杆菌培养的最佳条件是: 下胚轴
被预培养 5~7 d, 农杆菌菌株 LBA4404 培养后加入
200 μmol L–1乙酰丁香酮与之共培养 63~69 h。在这
些条件下, 转化的平均效率是 1.3% (即每 300 个外
植体有 4个转化株)。在 GH01转化株和非转化株的
根和叶的 GUS表达有显著差异(图 3)。同时, 转化植
株的 PCR揭示每一株都插入了目的基因(图 4-a), 且
RnD6D基因长度为 1 419 bp。



图 3 在不同时期 GH01 的 T0 代转化株和野生型 GH01 的 GUS
检测
Fig. 3 T0 generation transformants of GH01 and wild type
GH01 GUS stain in different periods
a: 转化株的幼根; b:转化株的角果; c: 野生型 GH01的角果; d:
转化株的幼叶; e:转化株的花; f: 野生型 GH01的叶。
a: transformant young root; b: transformant young pod; c: wild type
GH01 young pod; d: transformant young leaf; e: transformant
flower; f: wild type GH01 leaf.

转化苗移植到大田生长后, 我们观察了整个植
株的生长状况。花和角果的 GUS表达揭示了转化植
株与对照植株的不同(图 3)。叶片 DNA的 Sourthern
杂交反应这些转化株都带有 1~2 个目的基因拷贝
(图 4-b)。对转基因植株、对照植株和月见草(Oenothera
erythrosepala Borb., 包含 γ-亚麻酸)的气相色谱分析
(图 5)表明, 与 γ-亚麻酸浓度达 10.85%的月见草(滞
留时间为 5.838 min)(图 5-c)比较, 在转基因油菜(图


图 4 PCR 和 Southern 杂交对 T0 代转基因甘蓝型黄籽油菜中
RnD6D 基因的检测
Fig. 4 Detection of RnD6D gene in T0 generation transgenic
yellow seeded B. napus with PCR and Southern blot
a: 1: DNA标记; 2~3: 质粒的 PCR产物(阳性对照); 5, 7: 非转化
植株的 PCR产物(阴性对照); 4, 6: 2个Km抗性植株的 PCR产物。
b: 2, 3, 9: 对照(非转化株); 1, 4~8: 独立实验获得的转化株。
a: 1: DNA marker; 2–3: PCR products of plasmid (positive control);
5, 7: PCR products of untransformed control plant (negative con-
trol); 4, 6: PCR products of two Km-resistant plants. b: 2, 3, 9:
control (non-transformant); 1, 4–8: transformants obtained by in-
dependent experiments.

5-a)中, γ-亚麻酸(滞留时间 5.922 min)的浓度达到
8.20%。
从图 5 可看到油菜籽中含有几种脂肪酸, 即棕
榈酸(C16:0)(滞留时间约 3.7 min)、油酸(C18:1)(滞留
时间约 5.0 min)、亚油酸(C18:2)(滞留时间约 5.2
min)、亚麻酸(C18:3)(滞留时间约 5.8 min)、二十碳
烯酸(C20:1)(滞留时间约 7.3 min)和芥酸(C22:1)(滞
留时间约 10.0 min)。同对照植株相比较, 转化株的
油酸含量减少及亚油酸含量增加。结果表明, Δ6-脂
肪酸脱氢酶基因(RnD6D)不仅使亚油酸脱氢成为亚
麻酸而且使油酸脱氢成为亚油酸。脂肪酸含量发生
了很多变化。
3 讨论
不同种类甚至同种类不同基因型的材料有利于
转化的条件都是不同的。在本实验中, GH01作为导
入基因的受体, 不仅因它有黄籽油菜的优势, 而且
组织培养时它有很高的再生频率。
2190 作 物 学 报 第 38卷



图 5 GC 脂肪酸曲线表明 γ-亚麻酸在转基因植株中表达
Fig. 5 GC fatty acids profile showing the γ-linolenic acid expressed in the transgenic plant
a: 转基因植株(T1); b: 对照植株; c: 月见草。灰色垂直箭头标示-亚麻酸滞留时间。
a: transgenic plant (T1); b: control plant; c: evening primrose. The gray vertical arrow indicated the γ-linolenic acid retention time.

培养条件很大程度上影响了转化效率, 例如预
培养时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、农杆菌
浓度等等。所有共培养时间按卡平方测验(P<0.01)
均表现显著差异。同样的结果在西兰花[18]和白菜型
油菜[19]上也有报道。同时, Godwin等[15]和 Takasaki
等[19]在白菜型油菜上使用 200 μmol L–1乙酰丁香酮
获得了较高效率的农杆菌侵染力。Henzi 等[20]在发
根农杆菌侵染西兰花上用 200 μmol L–1乙酰丁香酮
也获得同样的结果。本实验与别的实验不同处是 :
以 OD600为 1.0~1.2 的根癌农杆菌侵染预培养 5~7 d
的外植体并且在含 200 μmol L–1乙酰丁香酮的培养
基中共培养 2~3 d 会产生最高的转化效率, 表明经
过较长预培养的外植体能承受较高选择压, 而其他
的因素则直接影响侵染效率。平均的转化效率仍很
低, 只有 1.3%。Metz等[18]报道在白菜型油菜和西兰
花上直接用芽转化可获得较高的(卡拉霉素抗性株)转
化效率。但我们用该法未能获得黄籽品种的转化株。
另外, 通过我们实验室构建的载体能成功地把
目的基因转入到甘蓝型油菜。GUS基因的表达能有
效地检测转基因植株, 因它连接有 35S 启动子, 又
能在转基因植株的任何部位表达。PCR 和 Southern
杂交证实 GUS表达的植株含有 RnD6D基因。
Southern 杂交中观察到植株中含 1~2 个目的基
因拷贝。大多数的转基因品系含单拷贝或单个简单
插入点, 多拷贝插入经常会导致不寻常的表达或分
离模式[21]。不少于一个拷贝数目的基因导入植株的
许多研究证实有基因沉默的现象[22]。与单拷贝基因
品系比较, 在基因表达上含不只一个拷贝的转基因
品系可能更不稳定。我们的研究也发现含 2 个目的
基因拷贝的转基因植株 GUS表达不稳定。这就是育
种上利用多拷贝转基因植株仍有很多问题的原因。
在转基因植株脂肪酸表达图谱中 γ-亚麻酸的含量达
到 8.2%, 同时脂肪酸含量(油酸和亚油酸)的变化证实
Δ6-脂肪酸脱氢酶基因能加速脱氢反应。Δ6-脂肪酸脱
氢酶基因的其他功能和 T3代分离模式会通过以后转
基因植株的生长过程及分子生物学方法检测出来。
4 结论
建立了甘蓝型黄籽油菜转化体系。接种农杆菌
第 12期 林 呐等: 甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立 2191


后, 卡拉霉素抗性芽在芽诱导培养基上生长 3 个月获
再生芽。转化株籽粒的 γ-亚麻酸含量达 8.2%。
References
[1] Knutzon D S, Thompson G A, Radke S E, Johnson W B, Knauf
V C, Kridl J C. Modification of Brassica seed oil by antisense
expression of a stearoly acyl carrier protein desaturase gene. Proc
Natl Acad Sci USA, 1992, 89: 2624–2628
[2] Shi S-W(石淑稳), Zhou Y-M(周永明), Sun X-C(孙学成), Zhang
X-L(张献龙). Transformation of Brassica napus with herbicide
resistance gene. J Huazhong Agric Univ (华中农业大学学报),
1998, 17(3): 205–210 (in Chinese with English abstract)
[3] Xu B-B(许本波), Xie L-L(谢伶俐), Tian Z-H(田志宏), Yan
H(严寒), He Y(何勇). Study on genetic transformation system of
yellow-seed rapeseed (Brassica napus L.). Acta Agric Jiangxi (江
西农业学报), 2007, 19 (8): 4–6 (in Chinese with English ab-
stract)
[4] Poulsen G B. Genetic transformation of Brassica. Plant Breed,
1996, 115: 209–225
[5] Khan M R, Rashid H, Ansar M, Chaudry Z. High frequency
shoot regeneration and Agrobacterium-mediated DNA transfer in
canola (Brassica napus). Plant Cell Tissue Organ Cult, 2003, 75:
223–231
[6] Leng H(冷虹), Li J-N(李加纳), Lu H(陆合), Chai Y-R(柴友荣),
Yin J M(殷家明). Construction of seed-specific expression vec-
tor of Δ6-fatty acid desaturase gene. Chin Agric Sci Bull (中国农
学通报), 2006, 22: 66–70 (in Chinese with English abstract)
[7] Hiei Y, Ohta S, Komari T, Kumashiro T. Efficient transformation
of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and se-
quence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J, 1994, 6:
271–282
[8] Hood E E, Chilton W S, Chilton M D, Fraley R T. T-DNA and
opine synthetic loci in tumors incited by Agrobacterium tumefa-
ciens A281 on soybean and alfalfa plants. J Bacteriol, 1986, 168:
1283–1290
[9] Ohta S, Mita S, Hattori T, Nakamura K. Construction and ex-
pression in tobacco of a beta-glucoronidase (GUS) reporter gene
containing an intron within the coding sequence. Plant Cell
Physiol, 1990, 31: 805–813
[10] An G, Ebert R R, Mitra A. Binary vectors. In: Gelvin S B, Schil-
perroort R A, eds. Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht:
Kluwer Academic Publishers, 1988. A3: pp 1–19
[11] Jefferson R A. Asaaying chimeric genes in plants: the GUS gene
fusion system. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5: 387–405
[12] Doyle J J, Doyle J L. A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull, 1987, 19: 11–15
[13] Rücker B, Röbbelen G. Impact of low linolenic acid content on
seed yield of winter oilseed rape (Brassica napus L.). Plant
Breed, 1996, 115: 226–230
[14] Tsukazaki H, Kuginuki Y, Aida R, Suzuki T. Agrobacterium-
mediated transformation of a doubled haploid line of cabbage.
Plant Cell Rep, 2002, 21: 257–262
[15] Godwin I, Todd G, Lloyd B F, Newbury H J. The effects of ace-
tosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation
vary according to plant species. Plant Cell Rep, 1991, 9: 671–675
[16] Godwin A K, Testa J R, Handel L M, Liu Z, Vanderveer L A,
Tracey P A, Hamilton T C. Spontaneous transformation of rat
ovarian surface epithelial cells: association with cytogenetic
changes and implications for repeated ovulation in the etiology of
ovarian cancer. J Nat Cancer Inst, 1992, 84: 592–601
[17] Holford P, Hernandez N, Newbury H J. Factors influencing the
efficiency of T-DNA transfer during co-cultivation of Antir-
rhinum majus with Agrobacterium bumefaciens. Plant Cell Rep,
1993, 11: 196–199
[18] Metz T D, Dixit R, Earle E D. Agrobacterium tumefaciens medi-
ated transformation of broccoli (Brassica oleracea var. italica)
and cabbage (B. oleracea var. capitata). Plant Cell Rep, 1995, 15:
287–292
[19] Takasaki T, Hatakeyama K, Ojima K, Watanabe M, Toriyama K,
Hinata K. Factors influencing Agrobacterium-mediated transfor-
mation of Brassica rapa L. Breed Sci, 1997, 47: 127–136
[20] Henzi M X, Christey M C, McNeil D L. Factors that influence
Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of broccoli
(Brassica oleracea L. var. italica). Plant Cell Rep, 2000, 19:
994–999
[21] Deroles S C, Gardner R C. Analysis of T-DNA structure in a
large number of transgenic petunias generated by Agrobacte-
rium-mediated transformation. Plant Mol Biol, 1988, 11:
365–377
[22] Stoger E, Fink C, Pfosser M, Heberle B E. Plant transformation
by particle bombardment of embryogenic pollen. Plant Cell Rep,
1995, 14: 273–278