全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17( 4) : 362～370
Journal of Wuhan Botanical Research
棉花生物技术研究概况
Ⅱ.棉花分子生物学研究
张献龙 孙济中
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 武汉 430070)
REVIEW OF THE STUDY ON BIOTECHNOLOGY
OF COTTON
II. STUDY IN MOLECULAR BIOLOGY OF COTTON
Zhang Xianlong Sun Jizhong
( S tate K ey L abor atory f or Genet ic Imp rov ement of Crop s, H uazhong A gr icul tur al Univ ersity Wuhan 430070)
关键词 棉花, 生物技术, 分子生物学
Key words Co tton, Bio technolog y, Molecular biolog y
分子生物学的发展对于阐明遗传的本质,改进育种的技术和方法均具有重要作用。其中分子标记被
认为是将来育种中进行辅助选择的重要手段。作物的分子生物学研究近些年来有了很大发展,棉花的分
子生物学研究开展较晚, 但已取得一些成就,现分别综述如下。
1 进化及资源研究
最近认为,棉花约有 50 个二倍体和四倍体棉种〔1〕,其中的 2 个四倍体种陆地棉和海岛棉的生产占
95% , 而且约 97%在其起源地以外种植。野生种具有很多有益性状 ,研究棉属的进化和资源对于充分利
用棉属资源十分重要。Percy 等〔2〕用同功酶对 153 个海岛棉品种进行了分析, 以确定它们的起源、扩散类
型和关系。其结论为, 变异的最大中心在南美的西北部, 陆地棉向海岛棉的渗透非常高( 22%～50% ) ,但
对于中美和加勒比海的海岛棉来说, 这种渗透很小。
Wendel等〔3〕利用同功酶对代表多个形态和地理分布的 538份材料进行了分析, 对其中 84 份进行
RFLP分析, 发现有 2 个变异中心, 1个为墨西哥-危地马拉 ,另 1 个为加勒比海。同其它植物相比,陆地
棉的遗传变异居平均水平, 可当代陆地棉的遗传结构贫乏。认为陆地棉种质系茅叶棉不应成为一个明显
的种。他们研究的结果表明海岛棉基因向陆地棉渗透很常见,可陆地棉内来自其它种的遗传物质极少。
同年, Wang 等〔4〕发现,所有海岛棉栽培种也存在可观的陆地棉遗传物质的渗入,认为陆地棉向 91 个海
岛棉栽培种的渗透在 10%～20%之间, 可有 1个栽培品种P ima S-2很特殊, 表现出 84%的陆地棉渗入,
收稿日: 1998-04-07,修回日: 1998-07-10。第一作者:男, 1963年3月出生,教授(博士) ,从事作物遗传育种研究。
霍英东教育基金资助项目。
陆地棉的渗入降低了海岛棉纤维的品质。棉花资源的多态性在种间和种内表现明显不同,一般来说,多
态性在近缘种之间较小, 而在远缘种之间较大〔5〕。
种间杂交和渗透是植物进化的重要程序,但二倍体水平的物种形成的实质尚未解决, Wendel等〔6〕
利用质体和核基因组的分子标记法研究了比克棉的特殊进化史。澳大利亚是二倍体棉种资源最丰富的
国家, 比克棉是形态上相似的澳大利亚 3 个棉种之一(即比克棉、澳州棉和纳尔逊氏棉) ,它们一起称为
H ibiscoidea 派。Wendel等的研究结果与早期的形态学资料相反, cpDNA 突变位点的进化枝分析将比克
棉与斯特提棉统一了起来, 而它们在形态上是完全不同的分类学派( St ur tia)。只有很少的突变位点能将
比克棉和斯特提棉的质体基因组区分开 ,但这 2 个棉种的 cpDNA 至少在 33个突变位点(共统计 640个
位点)与澳州棉和纳尔逊氏棉不同。同功酶标记和核基因组 rDNA 限制性位点突变的系统发育分析不支
持这两个高度不同的进化枝。而且,基于 83个核基因组标记的系统发育学表明,比克棉与澳州棉和纳尔
逊氏棉比比克棉与斯特提棉有更近的亲缘关系。所以Wendel等认为,比克棉具有一个双向系统发育祖
先。他们设想曾存在这样一种杂交, 斯特提棉或一个相似种作为母本, 与一个系谱的父本杂交,产生澳州
棉和纳尔逊氏棉, 因为他们在比克棉中没检测到任何斯特提棉的核基因。他们认为母本核基因组的贡献
后来在杂种中消除。可能存在几种细胞质转移机制,包括杂种作为母本进行多次回交, 转移到父本供体
中, 还可能存在重组核基因组的选择和一种无融合生殖——半配生殖。他们的研究证实了种间细胞质转
移的进化可能性, 认为二倍体物种的形成或许是通过网状的物种形成。此外,他们的研究提供了一个母
本核基因组不长期存在而向父本进行细胞质渗透的事例。
6 8
7 9
10
11 12
1 5
23 4
D 基因组二倍体 D genome diploid
草棉 G. herbaceum
中棉 G. arboreum
达尔文氏棉 G. darwinii
海岛棉 G. barbadense
夏威夷棉 G. tomentosum
黄褐棉 G. mustelinum
陆地棉 Gossypium hirsutum
30个突变
图 1 四倍体和二倍体棉种的进化〔1～12表示第 1～12个
突变位点( Wendel, 1989) 〔7〕〕
Fig. 1 Wagner parsim on y t ree for Gossypium b ased on r est rict ion s ite
los s/ gain mutat ions in cpDNAs〔1～12 show mu tat ion s ites ( Wendel , 1989)〕
在此之前, Wendel〔7〕对二倍
体及四倍体种的 560 个位点进行
了 cpDNA 分析,发现新世界四倍
体棉种含有旧世界棉细胞质, 认
为所有异源四倍体的细胞质供体
是一个 A 基因组二倍体与一个
类同于中棉和非洲棉的叶绿体基
因组。四倍体基因组 种间的
cpDNA 差异仅限于 1～6 个突变
位点, 从而认为四倍体棉种是近
期起源的。用 25 个限制性内切酶
研究了 26 个棉种的 cpDNA , 认
为棉种的进化关系如图 1所示。
D 基因组
D genome
A 基因组
A genome
陆地棉 G. hisutum
夏威夷棉 G. tomentesum
达尔文氏棉 G. darwinii
海岛棉 G. barbadense
黄褐棉 G. mustelium
图 2 棉属四倍体的进化关系
(Dejoode 等基于 cpDNA 和 rDNA 分析, 1992)
Fig. 2 Phylog enet ic hypothes is of allotet raploid goss ypium
species based on par simony an alysis of cpDNA and
rDNA rest rict ion site variat ion ( Dejoode DR, et al , 1992)
3 年之后, Dejo ode 等〔8〕利用叶绿体和核
糖体 DNA 限制性位点变异评估异源四倍体
的系统发生,将 5个异源四倍体分成 2 个进化
枝(见图 2)。
同功酶的分析支持上述结果, 夏威夷棉
与陆地棉的同功酶位点有 82%的相似性, 而
夏威夷棉与海岛棉仅有 65%的相似性。另外,
夏威夷棉与陆地棉有 11 个共同的位点在海岛
棉中不存在,而夏威夷棉与海岛棉仅有 1个共
同位点在陆地棉中不存在, 说明夏威夷棉与
陆地棉比与海岛棉在进化上更具有一个近期
363 第 4期 张献龙等:棉花生物技术研究概况Ⅱ.
祖先。夏威夷棉种内的遗传多态性很有限, 尽管陆地棉及海岛棉都曾在岛内栽种,但没有发现它们向夏
威夷棉渗透的同功酶证据。
现有当家品种在形态上是难以区分的, 用分子标记可以检测出现有品种的变异程度。从美国的 4个
主要种植区收集了 24 个当代品种,用 111个 RFLP 标记进行了分析,有 122 个位点表现出了变异〔9〕,发
现当代品种在杂合度、遗传多样性、位点分离率上有很大变异。有两个种植带表现出了主要差异,东部棉
区表现出高杂合性( 4. 4% ) ,较高的遗传多样性( 0. 19) , 且多态性位点的百分率较高(比平均高 57% ) ; 相
反, D elta 棉区具有最低的杂合性( 0. 3% )、低遗传多态性( 0. 05)和低的多态性位点百分率( 16% )。
分子标记还可用来区分关系十分密切的品种,如 RAPD标记。M ultani等〔10〕用 30 个随机引物对陆
地棉 12个品种和 1 个品系,以及 1 个海岛棉种进行 RAPD 指纹分析。在 453 个标记中, 69个 ( 15. 2% )为
海岛棉 Pima S-7 特有,在剩下的标记中, 128 个( 33. 3% )在所有 13 个陆地棉中均存在。遗传距离聚类分
析表明, 系统发育关系与已知的谱系很一致, 10 个品种都具有特殊的 RAPD 标记以相互区分开。甚至很
近缘的品种,如 Sicala V-1和 Sica la V-2、Siokr a L22 和 Siokr a L23、CS7s 和 CS8s 分别有 12、5 和 13 个
不同的 RAPD 标记。用 RAPD 标记对棉花优良品种资源进行分析研究的还有 T atineni等〔11〕、耿川东
等〔12〕、郭旺珍等〔13, 14〕、王心宇等〔15〕。
2 分子作图
2. 1 DNA 抽提技术的逐步改进
棉花由于含有多酚、多糖和单宁等,致使其高质量的DNA 分离曾一度困难,因为上述物质在细胞裂
解后能与 RNA 和 DNA 结合,利用传统的抽提方法难以去除。这种情况在其它植物中也存在, 如 Mal-
vaceae。提取液中加入 PVP对于提高核酸质量很关键〔16〕, Pa terson 等〔17〕建立起一个快速抽提棉花基因
组 DNA 以用于 RFLP 或 PCR 分析的技术程序。他们做了一些改进, 尤其是用葡萄糖调节渗透压,用
PVP 结合酚类物质, DIECA 使酚氧化酶失活, 另外还用了一些普通的抗氧化剂,如 Vc和巯基乙醇。同
年, T urley 等〔18〕也建立起了一个认为十分好的方法,利用叶和子叶分别提取DNA。子叶来自暗处生长 3
d 或光下生长 2 d 的幼苗, 叶片取自茎尖下 3～5 叶。他们认为他们建立起的方法有 4个优点: 可重复;纯
化的 DNA 大于 50kb; 限制性内切酶能有效降解 DNA;可用于大规模提取。另外, V r oh 等〔19〕认为,提取
DNA 时加入活性炭可改善质量。从各个研究结果来看,似乎 CsCl梯度离心是获得高质量 DNA 的必经
之路〔20〕。此外, M omtaz 等〔21〕曾建立了一个有效的分离高质量 mRNA 的技术程序。
2. 2 文库构建
构建基因组文库或其它文库对于棉花分子作图,基因的定位、分离与克隆十分重要;同时也是研究
棉花基因组结构与组成的基础性工作。Wing〔22〕所在的实验室建立了棉花的 YAC ( yeast ar tificial chro-
mosome)库, 产生了 800 个以上的 YAC 克隆,平均插入片断为 50～250 kb, 他们正致力于物理图谱的构
建和图谱辅助的基因分离。Baker 等〔23〕为了研究陆地棉 DNA 重复因子的组成结构,建立了陆地棉的
Cosmid 基因组文库。
Pat erson 领导的研究小组开展了卓有成效的建库工作〔24〕,他们用海岛棉品种 P ima S 6建立了基因
组文库,载体为 pBluescr ipt KS( + ) , 其目的是分析棉花的重复 DNA 序列。在此之前,他们曾构建过雷蒙
地棉、草棉、陆地棉、海岛棉等棉种的基因组文库和陆地棉的 cDNA 文库, 并用库中分离出的 DNA 片断
作探针成功地构建了棉花的第一个 RFLP 图谱〔25〕。
BAC 库是另一种非常重要的 DNA 文库, 对于棉花物理图谱的绘制、依据图谱进行的基因分离与克
隆工作亦十分重要。目前库的克隆数已达 30 000 个,详细情况可参看王坤波的综述文章〔26〕。T exa s A &
M 大学张红斌领导的小组在这方面具有很突出的成就, 建立了多个棉花 BAC 库, 并在很多方面已投入
使用 (私人通讯)。此外 ,为了研究基因的表达和差异分析, 很多实验室建立了一些棉花的 cDNA 文
库〔16, 27～30〕。
364 武汉 植 物学 研究 第 17卷
2. 3 分子图谱
一般认为异源四倍体陆地棉来源于一个非洲或亚洲棉的 A 基因组与美洲棉的 D 基因组杂交〔20, 31〕。
在目前已经知道的 26 个连锁群中,只有 65 个基因定位于 17 个连锁群上, 其中仅 12个连锁群与染色体
对应了起来。棉花的细胞学连锁群的构建就十分困难,可以想象构建其分子图谱的难度。科学家并没有
因为困难而放弃这方面的工作。Shappley 等〔32〕采用 2 个陆地棉品种的杂交组合的 F2 群体, 进行了
RFLP 作图, 利用 73 种酶/探针组合分析了 HS46×MAR 群体。利用 6 个探针/酶组合分析了 HS46×
PD5363群体。最近, 他们有了更详细的结果〔33〕, 利用 HS46×M AR 群体建立了 2 个连锁群, 1 个为
123 cM , 9 个位点,另 1个 0. 5 cM , 2 个位点,其它 14个位点不存在连锁关系。ST453×M315 的 50 株 F2
群体的分析结果, 产生 24 个多态性片断, 13 个多态性位点, 6 个位点构成 3 个连锁群,每个含 2 个位点,
其它 7 个不连锁。
Cantrell等〔34〕曾在 RAPD 图谱的构建方面做了工作, 并设想在标记有关基因方面有一定用途。Saha
等〔35〕利用陆地棉×海岛棉群体进行了 RAPD 作图, 用陆地棉的单体、单端体和代换系确定 RAPD 标记
所在的染色体。
棉花分子图谱最有成就的工作应属 Pater son 领导的研究小组〔25〕, 他们利用陆地棉×海岛棉建立了
详细的 RFLP 图谱。把 705个 RFLP 位点分成 41 个连锁组,覆盖染色体 4 675 cM , 平均间距 7. 1 cM ,约
有 21. 7%的探针的 RFLP 在2 个或多个位点有分离, 在图中占 37. 5% ( 265 个位点) , 棉花DNA 1 cM 的
平均物理长度为 400 kb 左右。
3 基因组分析
Reinisch 等〔25〕在构建棉花的 RFLP 时检测了陆地棉与海岛棉在核基因组成上的差异, 发现 46. 2%
的核 DNA 探针能检测到 2 个种的差异。物理上较大的 A 亚基因组重复 DNA 在重组方面是钝化的,
RFLP在 D 基因组中比较丰富, 有的 RFLP具有重复位点,重复位点分析表明, 有 11对部分同源染色体
区, 2个表现出同源序列, 大部分因倒位而表现出差异, 至少有 1 对因易位而表现出差异。大多数部分同
源染色体涉及不同亚基因组的染色体, 他们推断这一结果可以反映 1. 1～1. 9 百万年前 n= 13 和 n= 26
的多倍化过程。另外,根据结果他们判断至少在 25 百万年前,存在另一个较早的多倍化事件产生 n= 13
的棉花, 棉花基因组 1 cM 含约 400 kb。
1 年后,该研究组又对棉花大多数重复 DNA 的结构进行了研究〔24〕。利用 4 种平口末端限制酶降解
海岛棉 DNA 构建基因组文库,从库中分离出的重复 DNA 因子代表着四倍体棉种 60%～70%的总重复
DNA,占整个基因组的 30%～36%。经过交叉杂交和 Sout hern 印迹将推定含有核重复序列的 313个克
隆划分为 103 个家系。对这 103 个重复DNA 家系进行了基因组组织、甲基化类型和 DNA 变异等方面的
分析。同其它真核基因组一样, 散布重复因子是棉花基因组最丰富的重复 DNA 类型。具有高拷贝数( >
104)的少数串联重复家系同其它高等植物基因组相比,可能是棉花基因组的独特特征。散布重复具有甲
基化的倾向, 而串联重复在很大程度上没有甲基化。不同四倍体棉种重复 DNA 因子总拷贝数以及所有
组成成分变异很小, 说明四倍体棉种起源较晚的假说是正确的。
同年, Baker 等〔23〕为了更好地了解陆地棉的进化特性, 从 Cosmid 基因组文库中挑选 1 719个重组体
以检测重复特性, 这些重组体平均插入片断 34 kb,代表陆地棉单倍体基因组的 2. 6% ～4. 4%。利用微
卫星、串联重复、转座子、低拷贝基因(过氧化氢酶 )和一个叶绿体基因作探针。在 4 个二核苷酸中, ( CT )
n 和( GT ) n 分别以 3. 6%和 1%的频率出现, 而( AT ) n 与 1 个单克隆杂交, ( GC) n 和叶绿体基因不同任
何克隆杂交, 串联重复的 rDNA 顺反子能同 1 719 个克隆中的 60 个杂交, 他们估计,类似于 copia 家族
的逆向转座子以成千拷贝存在。对所有探针的分析结果表明,陆地棉基因组含有 61%的单一序列和低
拷贝 DNA, 与前人用其它方法的分析结果一致。
RFLP 图谱的成功绘制为棉花基因组研究提供了全新的机会。棉花中存在着丰富的 DNA 分子标记
365 第 4期 张献龙等:棉花生物技术研究概况Ⅱ.
位点〔36〕,大约 20%的 DNA 探针的 RFLP 在 2 个或多个位点分离,对异源四倍体部分同源染色体的鉴定
有很大帮助。例如, 6 号和 25 号染色体在整条染色体表现出共同的基因顺序。13 对部分同源染色体中已
鉴别出 11 对,绝大多数部分同源染色体可由 1个或多个倒位区分开。
4 关于Lea ( Late embryogenesis-abundant)基因家族的研究
研究表明, 有几种 mRNA 与未知功能的一些多肽有关 ,它们在棉花胚胎发生晚期的子叶中很丰富,
但在萌发过程中迅速消失〔37〕。这些 mRNA 称为 Lea ( Late embryogenesis-abundant ) mRNA。Ga lau 等〔38〕
克隆了 18 个陆地棉 Lea mRNA 序列的 cDNA , 并进行了特性分析。每个 mRNA 可能受 AD基因组中某
一个亚基因组的 1个 Lea 基因编码。Lea mRNA 属于通常在调节 mRNA 中起作用的两个相关组。第 1
类中的 6 个成员各自的转录水平在胚成熟早期有 2 个短暂的高峰, 在干化前 3 天有 1个高峰。第 2类的
12个成员的转录水平在胚成熟晚期迅速增加,在干化前 3天或干化期有 1个高峰。第 2 类 mRNA 在早
期也有几种积累类型 ,一些 mRNA 与贮藏蛋白或第 1 类mRNA 有重叠。在胚胎发生过程中, L ea mRNA
至少是通常情况下的 10到 1 700倍, 而在萌发前 1天则仅为胚胎发生过程中的1/ 15～1/ 220。ABA 可以
调节 Lea mRNA 的生成, 但不是最初调节子。每 1 类 Lea 基因的协调积累很复杂, 表明Lea mRNA 丰度
受多因子调节。每 1 个 Lea基因家系含有 2 个活跃的部分同源基因( alloalleles)。进一步的研究表明〔39〕,
大多数 Lea基因的总 RNA 转录本在体外发育研究中表现出功能, 所以体外转录应能很有效地测定它们
的丰度。同时, G alau 等对它们的相对作用及相互关系进行了研究。Lea 基因家族的研究对于基因表达,
发育遗传研究均具有重要参考价值。
1 年以后, G alau 等〔40〕利用 cDNA 作探针,采用 RFLP 技术确定了在所有异源四倍体和几个二倍体
棉种中的 21个基因的拷贝数。豆球蛋白 A、豆球蛋白 B 和 18 个单一的从异源四倍体陆地棉中分离出来
的 Lea基因的 cDNA 序列,在二倍体和 A、D、E 和 F 染色体组中以单拷贝存在,但在陆地棉中为 2 个拷
贝。EcoRⅠ或 BamHⅠ酶切 DNA 印迹分析通常在 A 和 D基因组中区分出 2个不同大小的片段。陆地
棉中 RFLP 的保守性使得这些片段的大多数分布在各自的亚基因组上。
5 基因的分离与克隆
进入 90 年代,棉花基因的分离与克隆取得了很大进展。据不完全统计, 目前至少分离出了 17 个基
因(见表 1)。这些基因将来在棉花遗传改良中有很大潜在应用价值。基因分离的手段多采用 cDNA 文库
的差异筛选法, 也有采用异源同类基因从棉花 cDNA 或基因组文库中筛选的办法。对这些基因的结构已
有所研究, 但其表达和实际应用工作仍处于初级阶段。
表 1 棉花基因的分离与克隆
T able 1 Isolation and cloning o f genes in cott on
基因 Gene 来源 Origin 结构特征 Characterist ics 参考文献 Reference
叶绿体 a/b 结合蛋白基因
L hcb1* 1 Acala sj-5 无内含子 Ander son等, 1993〔41〕
L hcb3* 1 Coker 201 含 210和 330 bp的 2个内含子 Ander son等, 1993〔41〕
液泡 H+ -ATP 酶 69 kD催化亚基基因 Acala sj-2 蛋白质编码区 G+ C含量 44. 9% Wilkins , 1993〔42〕
核糖体蛋白 L41 DPL62 (G+ C) % = 36. 6%编码区为 50. 6% Turley 等, 1994〔43〕
H+ -ATP 酶亚基 B基因 Acala sj-2 蛋白编码区( G+ C) % = 45. 2% Wan 等, 1994〔44〕
核糖体蛋白 S16 DPL62 (G+ C) % = 43. 0%编码区为 52. 6% Turley 等, 1994〔45〕
rbcS基因 陆地棉品种? 2个内含子分别为 101 bp 和 92 bp S agl iocco 等, 1991〔46〕
光合系统Ⅱ类型Ⅱ叶绿体 a/ b结合蛋白基因 Cab-151 陆地棉品种? 88bp内含子 S agl iocco 等, 1992〔47〕
366 武汉 植 物学 研究 第 17卷
续表 1
基因 Gene 来源 Origin 结构特征 Characterist ics 参考文献 Reference
小孢子发生晚期基因 G9 陆地棉品种? 3内含子 John 等, 1994〔48〕
与纤维发育有关的基因 E6 Cok er312 翻译 2个多肽 John 等, 1992〔49〕
纤维特异性脂质转移蛋白基因 GH6 棉花? 1个136 bp内含子 Liu 等, 1996〔50〕
GH3 棉花? ? M a等, 1995〔51〕
纤维特异性编码胞壁蛋白基因 GCW1 棉花? 富含脯氨酸 T an 等, 1996〔28〕
液泡膜内在蛋白基因Y-T IP 棉花? 2个内含子 Ferguson等, 1996〔52〕
核酮糖二磷酸羧化-加氧酶活化酶基因 rca Acala sJ-2 多基因簇 S alvu cci 等, 1996〔29〕
植物抗毒素基因 CADA CAD C 亚洲棉 ? Heinstein等, 1996〔53〕
叶柄离层基因 Del tapine ? Ch en等, 1996〔30〕
表 2 一些性状的分子标记
T able 2 Molecular marker s to some agr onomic tr aits
性状 T rai ts 标记 Markers 参考文献 Reference
纤维突变体 lili (无纤维) 2个 0. 9 k b RAPD
1个 0. 7 k b RAPD Park等, 1993〔55〕
纤维突变体 imim (未成熟) 0. 7 kb RAPD Park等, 1993〔55〕
热激蛋白基因 7个 RAPD 带 S aha 等, 1993〔56〕
-淀粉酶基因 9个 RAPD 带 S aha 等, 1993〔56〕
纤维强度 6个 RAPD 带 Park等, 1993〔57〕
纤维强度 11个 RAPD 带 Park等, 1994〔58〕
抗角斑病基因 3个QT L, 2个在 A 基因组上 Wright 等, 1996〔59〕
纤维强度 2个RFLP Sh appley 等, 1995〔60〕
胞质雄性不育恢复基因 RAPD 郭旺珍等, 1997〔61〕
麦克隆值 1个RFLP Sh appley 等, 1995〔60〕
6 基因标记与定位
进入 90 年代, 棉花的基因标记
与定位工作取得较大进展。P rice
等〔54〕采用原位杂交技术第 1 个将分
子标记定位在第 9 染色体上。4年后,
Reinisch 等〔25〕建立了第 1 张比较详
细 的 棉花 RFLP 图 谱。RFLP 和
RAPD 技术的发展促进了研究者利
用这些标记标记特定基因的工作。具
体研究工作总结如表 2。
7 原位杂交
Bergey 等〔62〕曾通过原位杂交对
棉花的遗传组成结构进行了研究。Pr ice等〔54〕利用生物素标记大豆 18S- 28S 核糖体 DNA 克隆片段,对
陆地棉减数分裂染色体进行原位杂交, 发现 1 簇核糖体 RNA 顺反子位于 9号染色体的长臂上, 从而成
为第 1 个标记在棉花染色体上的分子标记。原位杂交技术对于确定已克隆的 DNA 片段在染色体上的位
置非常重要。原位杂交定位基因需要有一套细胞遗传材料, 如单体、单端体、易位系等。目前这方面的研
究报道很少, 但原位杂交( ISH)将会与 PCR 结合形成原位 PCR 技术,将使研究更加方便。
8 分子标记与棉花育种
分子标记为棉花育种者提供了新的机会。首先,在棉花中形态标记非常有限, 大约有 80个左右,而
分子标记是无限的; 第二,形态标记对表型一般都有重要影响,而分子标记一般来说对表型没有影响;第
三, 分子标记比形态标记具有更多的共显性,便于遗传分析;第四, 分子标记可在苗期甚至植株的任何部
分的组织检测, 而大多数形态标记需要成熟植株, 有时需要后代;第五, 很多形态标记通常受 2 对基因调
节, 如无蜜腺、无腺体,而分子标记以单基因位点遗传; 最后, 分子标记可以用来确定重要基因的特异碱
基序列。
将分子标记用于棉花纤维品质改良是育种者努力的方向之一。对 Prema×MD5678ne 的 124个 F 2/
F 3后代群体进行了 11个数量性状的 RFLP 分析〔9〕。P rema 低产但高强纤维,纤维细 ; MD5678ne高产但
纤维强度低, 细度差。发现共有 113 个 RFLPs 在与产量、产量成分、纤维特性有关的 118 个位点表现多
态性。统计检测表明, 有 13 个 RFLP对产量效应明显,分别占产量变异的 4. 2%～14. 2%。分别检测到
1 个和 4 个RFLPs 对产量具有超显性和显性效应。大约有38 个RFLPs 与纤维强度和细度显著相关,且
367 第 4期 张献龙等:棉花生物技术研究概况Ⅱ.
90%的正效应来自于 P rema 亲本。
QTL 标记产量是另一个育种者关注的目标,分子标记技术一建立, 就有人考虑用它研究棉花的杂
种优势。杂种优势利用的关键是寻找好的组合, 对 16个亲本的半双列杂交于 1990 年在 Delta 的 3个地
方进行研究〔9〕, 16 个亲本来自于美国的 4个育种地区: 东部、Delta、高原和西部。多数杂种优势( F 2的中
亲优势)都涉及到西部的 Acala 品种。对 16 个亲本采用 203 个随机挑选的RFLPs 进行了分析,品种之间
的遗传距离用于聚类, 聚类结果与它们分别所在的 4 个育种地区非常一致。这一研究还有一个目的就是
研究遗传距离能否用于筛选 F2 优势较高的组合,结果很失望, 因为产量优势与遗传距离之间的相关系
数仅为 r= 0. 08。通常在优良品种或栽培品种之间很难用形态变异区分, 而 RFLP 可用于亲本纯度检测
和杂种杂合性鉴定〔63〕, 分子标记、RFLP 等为此提供了有效的手段。
此外, 分子标记正应用于标记一些重要的农艺性状, 如纤维长度、强度、细度、抗病、抗虫(如无蜜腺)
等, 然后用于分子标记辅助选择育种。长远来看,分子标记可用于鉴定和克隆棉花或其近缘种独有的基
因而为育种服务〔36〕。
参 考 文 献
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