全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18( 3) : 169～173
Journal of Wuhan Botanical Research
水稻单倍体不定芽超低温保存和植株再生
及其遗传稳定性研究

章志宏　胡中立
(武汉大学生命科学学院　武汉　430072)
提　要　通过水稻单倍体幼穗离体培养, 诱导形成了大量的不定芽。将 3 mm 左右的不定芽
转入半固体继代培养基继代培养 7 d,而后转入 1. 8 mL 的安瓿瓶中,冰浴条件下加入预冻了
的冰冻保护剂淹没材料, 在冰上平衡 45～60 min 后, 转入程序降温仪, 以 1. 0℃/ min 的速率
从 4℃降至- 40℃,在- 40℃停留1 h后, 投入液氮保存。将液氮保存30 d左右的不定芽于38～
40℃的水浴中快速解冻, 随即转入半固体的再生培养基, 以待恢复生长并再生植株。结果显
示: 经继代培养的不定芽超低温保存后的成活率为 21%～29% ,再生出苗率为 14%～18% ,
而未经继代培养的不定芽超低温保存后的成活率仅为 8% , 且均不能再生成苗。继代培养基
MS+ 蔗糖 3% + 山梨醇 4%或马铃薯提取液 20%均具有良好的继代培养效果, 有效的冰冻
保护剂为 10% DM SO+ 0. 5 mol/ L 山梨醇。对不定芽经液氮超低温保存的再生植株进行染
色体镜检及 RAPD分析, 结果表明再生植株在染色体倍性及 DNA 水平上仍具有较好的遗传
稳定性。
关键词　水稻, 单倍体, 不定芽, 超低温保存, 再生植株
中图分类号: Q943　文献标识码: A　文章编号: 1000-470X ( 2000) 03-0169-05
REGENERATING PLANTS FROM CRYOPRESERVATED
ADVENTITIOUS BUDS OF HAPLOIDS AND THEIR
GENETIC STABILITY IN RICE
Zhang Zhihong　Hu Zhong li
( Coll ege of L if e S cienc es, W uhan Unive rsity　Wuhan　430072)
Abstract　A lar g e number of adventitious buds w ere induced fr om in vitr o cult ur ed young
panicles of haploids of r ice. T he advent itio us buds subcultured on solidified subcultur e media
at 26℃ for 7 day s w ere loaded into 1. 8 mL plast ic cr yo tubes w ith enough cry opro tectant and
kept on ice for 45～60 min. A fter co oled at a r ate of 1. 0℃/ min dow n t o - 40℃, t he samples
w ere plunged into liquid nitr og en. T he advent itio us buds cr yopr eserv ed for about 30 days


收稿日: 1999-04-29,修回日: 1999-07-16。第一作者:男, 1963年 10月出生,副教授(硕士) ,主要从事植物遗传
学研究。
湖北省自然科学基金资助课题(编号: 97J041)。
w ere thaw ed rapidly in 38～40℃ wat er and then plated on so lidified MS medium containing
3% sucro se, 0. 5 mg / L NAA and 2. 0 mg / L kinetin. A fter plated, 21%～29% of adventitio us
buds r esumed growth and 14%～ 18% regener ated plantlets. The r esults o f this wo rk
indicated that selecting adventitio us buds deriv ed fr om in v itr o cultured young panicles is a
critical facto r f or the success and subcultur ing adventitious buds on MS medium containing
3% sucro se and 4% sorbito l o r 20% pot ato ex tr act is essential to the pro cedure . The
effectiv e cr yopr otectant is 10% DMSO ( dimethyl sulfo x imide ) + 0. 5 mol/ L so rbit ol.
Chromosome ident ifying o f r oo t t ip cell and RAPD analysis o f r egener ating plants indicat ed
that the r egener ating plants have good genet ic stability .
Key words　Ory z a sativ a L , Haploid, Adventit ious bud, Cryopr eserv ation, Regenerat ing
plant
植物组织与细胞超低温保存技术的发展,为植物种质的长期保存提供了新的手段,自
70年代初 Nag 和 Street〔1〕用液氮超低温保存胡萝卜悬浮培养细胞获得成功以来, 迄今通
过超低温保存获得成功的植物材料已达百余种〔2, 3〕。对于不能通过种子繁殖来保存的水稻
( Ory z a sativa L. )单倍体,一方面,由于其愈伤组织及培养细胞在离体培养条件下倍性极
不稳定〔4〕,因此, 不宜通过愈伤组织或培养细胞来进行超低温保存; 另一方面,尽管马铃
薯、花生、豌豆、石竹等植物的茎尖及梨树、桑树、苹果等树木的冬芽超低温保存的成功事
例〔3, 5, 6〕表明,植物茎尖或芽的分生组织具有高度的遗传稳定性和较强的形态发生能力,
是植物种质保存中最有价值的选材之一,但由于水稻茎尖分生组织体积小、生理状态脆
弱,因此至今未见有水稻茎尖超低温保存的成功报道。本研究通过对水稻单倍体幼穗培养
诱导的不定芽进行超低温保存的研究,以建立水稻单倍体长期保存的有效方法。
1　材料与方法
1. 1　材料
水稻品种农垦 58花药培养获得的单倍体单株,经分蘖繁殖后获得的无性系(通过稻
蔸保存)。
1. 2　方法
1. 2. 1　幼穗培养诱导不定芽　参照凌定厚等〔7〕、舒理慧等〔8〕的方法,取第 2次枝梗及颖
花原基分化期到雌雄蕊形成期(幼穗长 3～10 mm)的幼穗, 接种到固体诱导培养基上,
26℃光照培养,诱导不定芽。
诱导培养基: MS+ 蔗糖 3%+ NAA 2 mg / L+ Kinet in 2 mg/ L。
1. 2. 2　不定芽继代培养　将 3 mm 左右的不定芽从培养的幼穗上分离出来, 转入半固体
继代培养基继代培养 7 d。
继代培养基: Ⅰ. MS + 蔗糖 3%+ 山梨醇 4% ;Ⅱ. MS + 蔗糖 3%+ 马铃薯提取液
20%;Ⅲ. M S+ 蔗糖 3%+ 马铃薯提取液 30%。
1. 2. 3　不定芽的超低温保存　将继代培养后的不定芽转入 1. 8 mL 的安瓿瓶中, 冰浴条
件下加入预冻了的冰冻保护剂淹没材料,盖上瓶盖, 于冰上平衡 45～60 m in。
冰冻保护剂:Ⅰ. 10% DMSO (二甲基亚砜) + 0. 5 mol/ L 山梨醇;Ⅱ. 10% DMSO+
0. 5 mo l/ L 甘露醇;Ⅲ. 10% DMSO+ 10%甘油。
170 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　
冰冻降温程序: 将在冰浴上平衡后的安瓿瓶转入程序降温仪, 以 1. 0℃/ min 的速率
从 4℃降至- 40℃, 在- 40℃停留 1 h后,投入液氮保存。
1. 2. 4　不定芽的解冻与再培养　将液氮保存 30 d左右的不定芽从液氮中取出, 迅速投
入 38～40℃的水浴中快速解冻, 并用 MS+ 3%蔗糖的培养液洗涤 3次, 随即转入半固体
的再生培养基于 26℃暗培养 7～10 d后, 再行光照培养。
再生培养基: MS+ 蔗糖 3%+ NAA 0. 5 mg/ L+ Kinetin 2 mg / L。
1. 2. 5　RAPD分析　将不定芽超低温保存后的再生苗移栽到室外,成活并形成较多分
蘖后,随机取 3株分别取幼叶采用 CT AB 法〔9〕抽提总 DNA。RAPD分析参照 Parminder
等〔10〕方法进行, 单个反应体积为 25
L,其中含模板 DNA 10 ng ,随机引物 0. 2
mol/ L ,
dAT P、dT TP、dGTP 和 dCT P 各 200
mol/ L , Tag 酶 0. 5个单位, 10 mmol / L T ris-HCl
( pH 8. 3) , 50 mmol / L KCl, 1. 5 mmol/ L MgCl2, 0. 01%明胶,反应液表面用一滴矿物油
覆盖;扩增反应前先在 95℃预变性 3 min,再按 94℃ 1 m in、36℃ 1 min、72℃ 1. 5 min 循
环 35个周期, 而后在 72℃链延伸 7 m in; 扩增产物用 2%的琼脂糖凝胶电泳, 经 EB
( ethidium br omide)染色后在紫外灯下观察。
2　结果与分析
2. 1　不定芽的诱导
单倍体幼穗接种到诱导培养基上培养 15～20 d,即可通过器官发生途径形成大量的
不定芽,对 68个幼穗的出芽情况的统计表明,每幼穗出芽数 4～13个,平均 7. 3个。将不
定芽转移到再生培养基继续培养 10～15 d,可迅速再生成小植株。
2. 2　继代培养对不定芽超低温保存成活率的影响
表 1　不同的继代培养基对不定芽超低温保存成活率的影响*
Table 1　Effects of differ ent subcultur e media on the sur viving r ate of
cry opreser ved adventitious buds*
继代培养基
Subculture m edia
保存的不定芽数
No. of buds
cr yopr eserved
恢复活力的不定芽
Grow th-resumed buds
个数 No. %
再生成苗的不定芽
Plant-regenerat ing buds
个数N o. %
Ⅰ 165 45 27*** 26 16
Ⅱ 95 28 29*** 17 18
Ⅲ 84 18 21*** 12 14
CK ** 75 6 8 0 0
* 表中结果为 3次重复实验合计数。该项比较实验中, 使用的冰冻保护剂均为 10%
DM SO+ 0. 5 m ol/ L 山梨醇。** 未继代培养的为对照。*** 与对照相比达到 1%水平极
显著差异水平( 1%水平)。
* Th e result s in th e table w ere derived fr om th ree experiments. Cr yopr otectantⅠ( 10%
DM SO+ 0. 5mol/ L s orbitol) w as used in this experiment . ** The ch eck is that of n ot
being subcultured. *** Th e data are s ignif icant ly dif f er ent f rom th at of CK at 1% level.
表1的结果表
明, 经继代培养
的不定芽超低温
保存后的成活率
为21%～ 29%、
再生出苗率为
14%～18%, 而
未经继代培养
的不定芽超低
温保存后的成
活率仅为 8% ,
且不能再生成
苗。从不同继代
培养基作用效果的比较来看,继代培养基Ⅰ、Ⅱ 均具有较好效果, 不定芽超低温保存的成
活率和再生出苗率分别为 27%～29%和 16%～18%。
2. 3　不同冰冻保护剂作用效果的比较
不同冰冻保护剂的作用效果明显不同(表2) ,冰冻保护剂Ⅰ( 10% DMSO + 0. 5 mol/ L
171　第 3期　　　　　　章志宏等:水稻单倍体不定芽超低温保存和植株再生及其遗传稳定性研究
山梨醇)的效果最好,不定芽超低温保存的成活率和再生成苗率分别达到 27%和 16%。冰
冻保护剂Ⅱ、Ⅲ也有一定的保护效果,但明显较冰冻保护剂Ⅰ的效果要差。
表 2　不同冰冻保护剂对不定芽超低温保存成活率的影响*
T able 2　Effect s o f different cr yopr ot ect ant s on the sur viving ability
of cry opr eser ved adventit ious buds*
冰冻保护剂
Cryoprotectants
保存的不定芽数
No. of buds
cr yopr eserved
恢复活力的不定芽
Grow th-resumed buds
个数 No. %
再生成苗的不定芽
Plant-regenerat ing buds
个数N o. %
Ⅰ 165 45 27 26 16
Ⅱ 85 16 19 8 9
Ⅲ 80 10 13 5 6
* 表中结果为 3次重复实验合计数。该项比较实验中,使用的继代培养基均为 MS+ 蔗
糖 3% + 山梨醇 4%。
* T he result s in the table w ere derived from three exper iments . S ubculture medium
used in th is exp eriment w as numberⅠ( MS+ 3% sucros e+ 4% sorbitol) .
2. 4　超低温保存
再生植株的遗传
稳定性
将部分超低
温保存后的再生
小植株移栽到室
外盆中,成活后随
机取 10株分别对
其根尖进行染色
体数鉴定,结果染
色体 数均 为 12
(图 1: 2)。该结果表明, 水稻单倍体幼穗离体培养诱导的不定芽, 经超低温保存后的再生
植株,其染色体倍性仍保持稳定。
1.单倍体不定芽超低温保存后再生成小植株; 2.单倍体不定芽超低温保存
后再生植株根尖细胞的染色体数仍为 12; 3.对超低温保存后再生植株的
RAPD分析结果:泳道 1～3为超低温保存后的再生植株;泳道 4为作对照的
未经超低温保存的原始单倍体植株(此图中用于扩增的随机引物为 RG42,其
序列为 CCGGACTGAG)。
1. Plant let s regenerated f rom cryopreservated advent itiou s buds of haploids ;
2. Th e chromosome number of root t ips of plant regenerated f rom
cryopres ervated advent it iou s buds of h aploid is 12; 3. T he RAPD analysis of
plants regenerated from cryopres ervated advent it ious buds of h aploid: Lan e 1
～ 3 ar e that of ind ivid ual plants r egenerated f rom cryopreservated
advent it ious buds; L ane 4 is th at of origin al h aploid plan t as ch eck ( h ere,
random primer RG42, CCGGACTGAG, was used)
图 1　水稻单倍体不定芽超低温保存后再生植株及其染色体鉴定与 RAPD分析
Fig. 1　Regen erat ing plan t f rom cryopreser vated advent it ious buds of
h aploid s and it s gen et ic stabilit y in rice
RAPD 分析结果(图
1: 3)显示, 对不定芽超低
温保存的再生植株每单
株分别用 30个随机引物
各扩增出 138 条带, 其带
型均与原始的单倍体植
株完全一致, 说明水稻单
倍体幼穗离体培养诱导
的不定芽, 经超低温保存
后的再生植株在 DNA 水
平上仍具有较好的遗传
稳定性。
3　讨论
选材于水稻单倍体
幼穗离体培养诱导的不
定芽是本项研究获得成
功的关键因素之一。水稻
幼穗离体培养诱导的不
定芽,其分生组织起源于体细胞器官发生途径〔7〕, 同茎尖的分生组织一样,具有高度的遗
传稳定性和较强的形态发生能力,因此,是进行超低温长期保存的优良选材。
在超低温保存之前,对不定芽进行继代培养,对提高不定芽超低温保存的成活率和再
生出苗率是必要的。经过了继代培养的不定芽, 组织水分含量降低,细胞质变稠,结构更致
172 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　
密,因而具有较强的抗冰冻能力。这一点与梨树、桑树、苹果等树木的冬芽超低温保存易获
成功的机理一致〔2, 3〕。不同的继代培养基其继代培养效果不同,其中,继代培养基Ⅰ( M S+
蔗糖 3%+ 山梨醇 4% )的继代培养效果较好, 且配制简单、性能稳定; 继代培养基Ⅱ
( M S+ 蔗糖 3%+ 马铃薯提取液 20%)的继代培养效果更佳, 应用潜力更大,其缺点是马
铃薯提取液成分复杂, 其性能易受马铃薯生理状态的影响而不稳定。
参 考 文 献
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173　第 3期　　　　　　章志宏等:水稻单倍体不定芽超低温保存和植株再生及其遗传稳定性研究