全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(3): 462470 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究计划(973计划)项目(2009CB118301), 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2007AA100102-5)和国家科
技支撑计划项目(2008BAD97B01)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王成社, E-mail: wangcs2008@126.com
第一作者联系方式: E-mail: bihuihui826@126.com ** 同等贡献(Contributed equally to the work)
Received(收稿日期): 2011-06-30; Accepted(接受日期): 2011-10-12; Published online(网络出版日期): 2011-12-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20111201.0921.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00462
陕农 138小孢子发育过程中蛋白表达差异的比较分析
毕惠惠 1,** 杨华瑞 1,** 马俊会 1 刘录祥 2 王成社 1,* 许喜堂 1
邹淑芳 1 谢彦周 1
1西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室 / 农学院, 陕西杨凌 712100; 2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 为了寻找小麦单核中晚期愈伤组织诱导率较高的原因, 探讨小麦花药发育的蛋白质代谢机制, 本试验利用
双向电泳技术对陕农 138 小麦小孢子单核中晚期和双核期的全蛋白分析表明, 在等电点 4~7 之间可识别约 450 个以
上清晰的蛋白质点, 检测到差异点 26个, 对其中 14个质量较好、重复性较高的差异表达的蛋白质点采用基质辅助激
光解吸分离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽指纹图谱分析, 并利用Mascot软件在NCBInr数据库搜索, 鉴定出
11个蛋白质点, 另 3个蛋白质点未得到有意义的鉴定, 11个蛋白质点分别被鉴定为 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(1个蛋白
点)、叶绿素抗体结合蛋白(1个蛋白点)、pentatricopeptide重复蛋白 PPR566-6 (1个蛋白点)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂
(1 个蛋白点)、泛素(1 个蛋白点)、S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶(2 个蛋白点)、放氧增强蛋白(2 个蛋白点)和假定蛋白(2
个蛋白点)。这些蛋白质点的功能涉及到糖代谢、蛋白质降解、细胞防卫等代谢过程。
关键词: 蛋白表达; 小孢子发育; 双向电泳; 花药培养; 花药培养力
Analysis of Protein Expression at Different Microspore Development Stages in
Wheat Cultivar Shaannong 138
BI Hui-Hui1,**, YANG Hua-Rui1,**, MA Jun-Hui1, LIU Lu-Xiang2, WANG Cheng-She1,*, XU Xi-Tang1, ZOU
Shu-Fang1, and XIE Yan-Zhou1
1 State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas / College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Institute
of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: To understand the metabolic mechanism of wheat anther development, we analyzed the holoprotein of Shaannong 138
at mid-late mononuclear pollen and binuclear pollen stages using two-dimensional electrophoresis technique. More than 450 clear
protein spots were identified, including 26 differentially expressed protein spots. We selected 14 protein spots with expression
difference at least two times for further separation by means of matrix-assisted laser desorption time of flight mass spectrometry
peptide mass fingerprint analysis (MALDI-TOF-MS) in isoelectric point (pI) of 4–7. After indexing database NCBInr using soft-
ware Mascot, we identified 11 significant protein spots. These protein spots were classified into several groups based on function,
i.e., UDP-glucose pyrophosphorylase (one spot), chlorophyll antibody-binding protein (one spot), pentatricopeptide repeat protein
PPR566-6 (one spot), cysteine protease inhibitor (one spot), ubiquitin (one spot), S-adenosyl-L-cysteine hydrolase (two spots),
oxygen-enhanced proteins (two spots), and putative proteins (two spots). These proteins are involved in glycometabolism, protein
degradation, cell defense, and some other metabolic processes.
Keywords: Protein expression; Microspore development; Two-dimensional electrophoresis; Anther culture; Anther cultural ability
虽然小麦花药培养获得单倍体植株的研究已经
取得了一些成就, 但仍不能在育种中广泛应用, 其
主要原因在于花药培养力低。小麦花药培养力是指
小麦花药在培养过程中的花药出愈率及再分化过程
中幼苗分化率和绿苗率, 其受基因型、花药接种的
时期、培养基及培养条件等多种因素的影响[1], 其中
花药接种时期对出愈诱导率至关重要[2]。小麦花药
离体培养的最佳接种时期是单核中晚期 [3], 这一时
第 3期 毕惠惠等: 陕农 138小孢子发育过程中蛋白表达差异的比较分析 463


期的花药培养力大、出愈率和诱导率高, 但目前还
未能揭示其生理生化机制。
蛋白质是基因表达的最终产物, 也是基因功能
的执行者[4]。蛋白质在特定组织或发育的某一阶段
中表达的功能分析是了解生物学过程的关键。小孢
子发育的变化时期, 也必然伴随着蛋白质的表达和
动态变化, 而且具有一定的时序性。Imin等[5]报道水
稻幼孢子体时期花药蛋白质组特征。通过硝酸银染
色在 pH 6~11的 2-DE胶上检测到 4 000多个蛋白质
斑点, 鉴定出其中 75个斑点(代表 62种蛋白质), 代
表水稻基因组总量的 10%。Kerim等[6]比较了水稻花
粉发育过程中花粉母细胞、四分体、早期幼小孢子、
单细胞花粉、双细胞花粉和三细胞花粉时期花药的
蛋白质组差异, 发现 159 个差异表达的蛋白质斑点,
其中 40个斑点(代表 33种蛋白质)的鉴定结果表明, 这
些蛋白质主要参与糖代谢、细胞延长和伸展等生理
过程, 并且很多蛋白质以多个同工酶的形式存在。
齐延芳等[7]对玉米在花药培养中过氧化物同工酶变
化的谱带分析认为, 过氧化物同工酶可以作为花培
能力选择的一项较为可靠的生化指标。
为了探索小麦花药培养在小孢子单核中晚期出
愈诱导率较高的原因, 探求小麦花药发育过程中的
蛋白质代谢机制, 找到这一时期与小麦花药培养力
表达调控有关的关键蛋白, 本试验利用蛋白质组学
技术, 比较了小孢子不同发育时期蛋白质组的变化,
从而对小孢子发育各时期相关蛋白质或多肽的表达
变化特征以及蛋白质的修饰及互作关系获得更加深
入的了解。
1 材料与方法
1.1 植物材料
陕农 138 是西北农林科技大学育成的小麦优良
新品种, 由新麦 9 号/陕 354 航天诱变系杂交, 并经
花药培养选育而成, 于 2008年 4月通过陕西省农作
物品种审定委员会审定。陕农 138 种子由西北农林
科技大学农学院小麦花培育种课题组提供。
在抽穗前, 通过形态和镜检麦穗上大花、小花
确定小孢子发育时期, 取单核中晚期、双核期的花
药于 4℃下剥取, 置–80℃冰箱保存备用。
1.2 花药总蛋白质的提取
参照 Damerval 等[8]的方法并略作改动, 提取样
品蛋白质。花药中按 100 mg g1比例加入 PVPP, 加
液氮研磨成粉, 用–20℃预冷的蛋白提取液(丙酮配
置, 内含 10%三氯乙酸, 0.07% β-巯基乙醇), 过夜沉
淀蛋白质, 其间振荡多次。–4℃下 20 000g, 离心 30
min, 弃上清液,用含 0.07% β-巯基乙醇的冷丙酮溶
液冲洗沉淀, –20℃静置 1 h 后, –4℃下 20 000×g, 离
心 30 min, 重复 3~4 次, 直至蛋白质沉淀物为纯白
色。取沉淀物冻干成粉存于–80℃备用。提取全程低
温操作且加入 1 mmol L1 PMSF以防蛋白质水解。
1.3 蛋白质裂解及浓度测定
花药蛋白质干粉与裂解液(含 7 mol L1尿素、
4% CHAPS和 65 mmol L1 DTT, 现用现加)充分混
匀, 反复涡旋混合和 32℃水浴 1 h, 使蛋白质充分溶
解, 然后于 24℃下 20 000×g离心 1 h, 取上清液备用。
采用蛋白质定量试剂盒(天根生物科技有限公司), 参
考 Bradford[9]的方法测定蛋白浓度, 4 次重复。用牛
血清蛋白标准品配制不同浓度的系列, 考马斯亮蓝
G250 显色, 测定 595 nm 处的吸光值, 绘制标准曲
线。根据标准曲线计算蛋白质浓度。
1.4 双向凝胶电泳
1.4.1 第 1 向固相 pH 梯度等电聚焦 主要参照
Görg等[10]的方法和Bio-Rad等电聚焦系统操作指南进
行。根据浓度测定结果, 取含花药总蛋白质 330 μg的
样品, 加水化上样液[7 mol L1 尿素+4% CHAPS+ 65
mmol L1 DTT+0.2%IPG 缓冲液(其中 1% pH 3~10,
1% pH 4~6)+0.001%溴酚蓝]至终体积 350 μL, 充分
混匀。沿 PROTAIN IEF Cell型电泳仪(Bio-Rad)聚焦
槽内连续加入。将 17 cm IPG胶条胶面朝下覆盖在
样品上, 室温被动吸收 1 h 后, 加 2 mL矿物油覆盖
胶条。在 20℃条件下主动水化 14 h, 使胶条充分吸
胀,吸收样品。然后以每根 50 μA的极限电流和 20℃
聚焦温度, 进行第 1向等电聚焦电泳。
1.4.2 第 2向 SDS-PAGE电泳 等电聚焦结束后,
胶条依次在平衡液 I (含 6 mol L1尿素, 2% SDS,
0.375 mol L1 Tris-HCl, pH 8.8, 20%甘油, 0.002%溴
酚蓝, 2% DTT)和平衡液 II (含 6 mol L1尿素, 2%
SDS, 0.375 mol L1 Tris-HCl, pH 8.8, 20%甘油 ,
0.002%溴酚蓝 , 2.5% IAA)中各平衡 15 min。在
PROTAIN IEF Cell型电泳系统(Bio-Rad)中电泳, 以
15℃循环水冷却, 采用 12%的分离胶, 用 0.5%琼脂
糖密封液(含 25 mmol L1 Tris-HCl, 192 mmol L1甘氨
酸, 0.5%琼脂糖, 0.002%溴酚蓝)固定胶条, 用 10 mA
恒流电泳 1 h, 再换用 40 mA恒流电泳直至溴酚蓝到
达距胶底部边缘处停止电泳。电泳后银染显色。
为检验双向电泳结果的准确性, 每样品至少 3
次重复。
464 作 物 学 报 第 38卷

1.5 图像扫描及分析
采用 UMAX Powerlook 2100XL 型光密度扫描
仪对 2-DE 凝胶扫描照相, 分辨率设为 600 dpi; 用
PDQuest 8.0.1 软件分析图像, 包括背景消减、斑点
检测、匹配、数据分析等, 获取差异表达蛋白质点。
1.6 差异表达蛋白质点的质谱分析及鉴定
参照陈蕊红等[4]的方法进行差异蛋白质点的胶
内酶解。选择 14个质量好、重复性高差异蛋白质点
送北京华大蛋白质研发中心有限公司进行 MALDI-
TOF-MS 分析, 获得肽质量指纹图谱, 并通过数据
库搜索, 对其进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 小麦花药二维电泳图谱的建立及图谱分析
采用固相 pH梯度 IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳
对陕农 138 小孢子单核中晚期和双核期总蛋白进行
分离, 通过严格一致的操作程序, 并精确控制电泳
温度与电流电压以及样品上样量, 获得分辨率和重
复性较好的 2DE 图谱, 使蛋白质在 2 个方向分离较
好(图 1)。
单核中晚期和双核期的 2-DE图谱十分相似, 等
电点 4~7、分子量 20~100 kD 之间分别可识别 437
和 450个清晰的蛋白质点。2个时期的蛋白质点的等
电点均在 5~6之间, 分子量在 40~90 kD和 26 kD以
下分布比较集中, 蛋白质点差异较大, 而在等电点
6~7, 分子量 26~40 kD之间差异较少(图 1)。
2.2 不同发育时期花药差异表达蛋白比较分析
凝胶上的蛋白质点被检定之后 , 选定一参照
(mastergel), 通过自动匹配显示有 60多个差异点。通
过肉眼观察及手动调整后, 共有差异点 26 个(表 1),
其中单核中晚期比双核期 2 倍以上上调表达的点 6
个, 下调表达的点 10 个, 另外各有 5 个蛋白点在不
同时期表达(表 1和图 1)。图 2显示单核中晚期和双
核期的差异蛋白质点及构型变化。依据差异蛋白质
点在不同花药发育时期的表达变化特点, 将其分成
2 组。A 组表现为蛋白点在双核期出现或表达量高,
而在单核中晚期缺失或表达量低, 如 Z1、Z4 和 Z5
是在双核期出现的蛋白质点, 但是在单核中晚期都
缺失, 差异较明显; 而 L9 和 L3、L4 蛋白质点表现
为量的差异, 其中 L3 和 L4 在单核中晚期几乎看不
到 , 表达丰度很低 , 到双核期表达量上升 , 更多地
参与小孢子发育的代谢途径。Z3蛋白质点在单核中
晚期表现为 2 种蛋白质, 但在双核期表现为一种蛋
白质, 并且表达丰度上调, 质和量都有较大差异。B
组表现为蛋白点在单核中晚期出现或表达量高, 而
在双核期缺失或表达量低。可以看出单核中晚期比
双核期多 5个蛋白质点(S1、S2、S3、S4和 S5), 其
中 S1、S2和 S5 以及周边区域内的大部分蛋白质在
单核中晚期出现或表达丰度高, 而双核期这一区域
内的部分蛋白质缺失或表达丰度低。P3、P6在双核
期表现为量的差异。



图 1 陕农 138花药小孢子单核中晚期(a)和双核期(b)的蛋白质 2DE图谱
Fig. 1 2-DE maps of proteins isolated from anthers at mid-late uninucleate (a) and binucleate pollen (b) stages of Shaannong 138
表达量差异达 2倍以上的蛋白以字母 L或 P加数字表示, 同时期特异表达蛋白以字母 Z或 S加数字表示。
Spots of protein with more than two-time difference in expression are marked with L or P plus a number, specifically expressed protein are
marked with Z or S plus a number.
第 3期 毕惠惠等: 陕农 138小孢子发育过程中蛋白表达差异的比较分析 465


表 1 2个时期差异蛋白点的分子量和等电点值
Table 1 Molecular weight (MW) and isoelectric point (pI) of differential proteins at two stages
蛋白点
Spot
分子量(kD)/等电点
MW (kD)/pI
单核中晚期
MUS
双核期
BS
蛋白点
Spot
分子量(kD)/等电点
MW (kD)/pI
单核中晚期
MUS
双核期
BS
a-P1 103.8/5.61 ↑ ↓ b-L3 20.7/5.28 ↓ ↑
a-P2 103.8/5.73 ↑ ↓ b-L4 19.3/5.35 ↓ ↑
a-P3 62.5/5.84 ↑ ↓ b-L5 11.8/6.13 ↓ ↑
a-P4 51.7/4.96 ↑ ↓ b-L6 21.9/6.22 ↓ ↑
a-P5 43.6/6.78 ↑ ↓ b-L7 20.4/6.11 ↓ ↑
a-P6 36.3/4.76 ↑ ↓ b-L8 30.3/6.61 ↓ ↑
a-S1 78.3/4.95 +  b-L9 17.6/6.49 ↓ ↑
a-S2 77.1/5.10 +  b-L10 30.9/6.68 ↓ ↑
a-S3 52.7/6.03 +  b-Z1 27.8/6.40  +
a-S4 52.7/5.92 +  b-Z2 16.7/6.30  +
a-S5 54.3/5.08 +  b-Z3 36.7/5.21  +
b-L1 32.2/5.32 ↓ ↑ b-Z4 13.8/5.43  +
b-L2 35.6/5.04 ↓ ↑ b-Z5 10.3/5.56  +
↑: 上调; ↓: 下调; +: 特异表达; −: 未表达。
↑: up-regulated; ↓: down-regulated; +: specifically expressed; −: not expressed. MUS: Mid-late uninucleate stage; BS: Binucleate stage.




图 2 单核中晚期和双核期部分差异蛋白质点的放大图
Fig. 2 Enlargements of partial differentially expressed protein
spots at mid-late uninucleate and binucleate stages
i: 单核中晚期; ii: 双核期。蛋白点编号同图 1。
i: the period of mid-late uninucleate pollen; ii: the period of binu-
cleate pollen. The codes of protein spots are the same as those in
Fig. 1.

2.3 差异表达蛋白质点的质谱鉴定
MALDI-TOF-MS 质谱鉴定分析了 14 个差异蛋
白质点, 均获得了肽质量指纹图。图 3示点 b-L4的
MALDI-TOF-MS 分析结果。使用 MASCOT 的软件
搜索蛋白质 NCBInr 绿色植物数据库, 其鉴定结果
列为表 2, 其中 11个蛋白质点得到了成功鉴定, 得分
>71, 其分值的可信度达到显著水平(P<0.05), 这些
蛋白质点分别为 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、叶绿素抗
体结合蛋白、pentatricopeptide重复蛋白 PPR566-6、半
胱氨酸蛋白酶抑制剂、泛素、2 个 S-腺苷-L-半胱氨
酸水解酶、2个假定蛋白及 2个放氧增强蛋白。另有
3 个蛋白点的测定结果未能达到显著水平, 但是根据
获得匹配肽段的匹配率、实验分子量和等电点与理
论值相比较, 推测其蛋白名称, 分别为 2个假定蛋白
和 1个保守的假定蛋白(表 2)。
3 讨论
关于植物小孢子发育不同时期蛋白质组成已有
研究报道, 主要研究的作物有水稻、玉米等, 而在小
麦上同类研究较少。Imin 等[5]在水稻上的研究表明,
在 PH6-11 的 2-DE 胶上有 4 000 多个蛋白质点;
Kerim 等 [6]比较了水稻花粉不同发育时期蛋白质组
的差异, 发现有 159个差异蛋白。杨华瑞等[11]曾作过
小麦不同花粉发育时期蛋白质的单向电泳分析, 发
现有差异带的存在。本研究通过小麦小孢子发育单
核中晚期与双核期的蛋白质组比较, 发现在这 2 个
时期蛋白数量上存在较大差异, 而且部分蛋白质的
表达量也随发育阶段而发生明显变化。当小孢子发
育在单核中晚期时, 有 5 个蛋白点(图 1-a, 点 S1 至
S5)特异表达, 但在双核期未观测到它们的表达; 同
466 作 物 学 报 第 38卷



图 3 点 b-L4的 MALDI-TOF-MS分析
Fig. 3 MALDI-TOF-MS analysis of spot b-L4
A: 蛋白分值; B: 质谱峰值; C:蛋白序列, 匹配肽段以下画线标记。
A: Protein score; B: MS peak; C: Protein sequence, matched peptides are underlined.

时, 6个蛋白点(图 1-a, 点 P1至 P6)在单核中晚期的
表达丰度高于在双核期。当小孢子发育到双核期时,
有 5 个蛋白点(图 1-b, 点 Z1 至 Z5)特异表达, 10 个
蛋白点(图 1-b, 点 L1至 L10)呈上调表达。由此可以
看出, 小麦小孢子发育时期的单核中晚期与双核期
的蛋白质组之间存在明显的差异, 说明基因的表达
具有时序性。对 14 个差异点进行 MALDI-TOF-MS
质谱分析, 其得分大于 71, 分值可信度(P<0.05)达
到显著水平的蛋白质点有 11个, 另有 3个蛋白点的
测定结果未能达到显著水平(表 2)。这些蛋白有些为酶
蛋白, 有些为抑制蛋白, 有些为不确定功能的蛋白。
蛋白质点 a-S5 被鉴定为 UDP-葡萄糖焦磷酸化
酶(UDP-glucose pyrophosphorylase, UGPase)。该酶
在植物、动物和细菌中广泛分布, 是催化 UDP-葡萄
糖合成及焦磷酸化的酶, 催化反应 UTP＋葡萄糖-1-
P→UDP-葡萄糖+PPi。UDP-葡萄糖是高等植物中主
要的活化糖形式, UGPase作为葡萄糖基供体参与蔗
糖、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白
和细胞壁组分的合成代谢[12]。研究表明, 小麦、水
稻等作物的不育花药发育过程中淀粉含量较可育花
药明显下降, 这与淀粉降解的速度、运输、合成受
阻有关[13]。文李等[14]对红莲型细胞质雄性不育性研
究发现, AGPase的大亚基在不育系YTA的单核期花
粉中不表达, 而在保持系 YTB 中表达; 这一基因的
沉默使不育系中淀粉合成受阻, 最终导致花粉不能
正常发育。本试验也获得类似结果, UDP-葡萄糖焦
磷酸化酶只在花药单核中晚期表达, 而在双核期没
有表达, 说明此酶是这一时期花药发育代谢过程中
特异表达的产物, 缺少这一蛋白可能使淀粉合成受
抑制, 引起花药的不育, 最终不能顺利进入双核期。
第 3期 毕惠惠等: 陕农 138小孢子发育过程中蛋白表达差异的比较分析 467


表 2 差异表达蛋白点的 PMF数据库检索的鉴定结果
Table 2 Differentially-expressed proteins identified by PMF query
蛋白点
Spot
NCBInr登录号
NCBInr acc. No.
理论分子量/等电点
Theoretical
MW(kD)/pI
实验的分子量/
等电点
Observed MW(kD)/pI
覆盖率
Coverage
(%)
得分
Score
匹配蛋白
Protein
b-L1 gi|131394 27.42/8.84 32.2/5.32 72 187 Oxygen-evolving enhancer protein 2
b-Z1 gi|131394 27.42/8.84 27.8/6.40 62 160 Oxygen-evolving enhancer protein 2
a-S4 gi|68655456 49.96/5.81 52.7/5.92 29 123 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase
b-L5 gi|213868277 7.54/5.73 11.8/6.13 89 112 ubiquitin
a-S3 gi|68655456 49.96/5.81 52.7/6.03 23 95 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase
a-S5 gi|6136111 51.78/5.20 54.3/5.08 28 95 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase
b-L4 gi|1706276 9.35/5.81 19.3/5.35 65 79 Cysteine proteinase inhibitor A
a-P6 gi|158562858 3.79/8.20 36.3/4.76 100 78 Chlorophyll a-b binding protein 2
a-P1 gi|242078931 110.57/5.68 103.8/5.61 22 76 Hypothetical protein
b-L3 gi|195616488 56.74/9.07 20.7/5.28 21 74 Pentatricopeptide repeat protein PPR566-6
a-P5 gi|159476322 23.90/5.74 43.6/6.78 25 72 Hypothetical protein
a-P2 gi|242078931 110.57/5.68 103.8/5.73 18 56　 Hypothetical protein
b-Z5 gi|222616019 8.87/5.81 10.3/5.56 41 48　 Hypothetical protein
b-Z4 gi|255555837 18.24/5.85 13.8/5.43 16 28　 Conserved hypothetical protein
蛋白点编号中 a、b分别代表图 1中的 a、b, 其他字母和数字与图中蛋白点编号一致。分值可信度未达到显著水平。
Spot codes are the same as those in Fig. 1, and the extra letter “a” or “b” represents the “a” or “b” in Fig. 1. 　 Score credibility is not
significant.

蛋白质点 b-L4 是半胱氨酸蛋白酶的抑制因子,
能与半胱氨酸蛋白酶活性部位结合而抑制该酶的催
化活性, 可以保护细胞免受不合适的内源或外源蛋
白质的水解。陈蕊红等[4]发现半胱氨酸蛋白酶抑制
剂只在可育系花药中表达, 而在不育系中缺失。Zhang
等 [15]指出, 在玉米可育系中, 半胱氨酸蛋白酶抑制
剂是细胞程序化死亡的抑制因子, 其上调表达可能
抑制绒粘层细胞程序化死亡的进程。本研究也得到
相同结果, 从 2-DE图谱中可以看出, 在花药双核期
半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达丰度明显比单核中晚
期高, 这说明半胱氨酸蛋白酶抑制剂在这一时期可
以保护细胞免受其他物质的侵害, 细胞建立防卫体
系, 从而稳定其生长发育。在单核中晚期进行花药
培养容易获得较高的出愈率可能与此有关, 由于花
药组织受到保护呈现较高的生命力, 不易发生败育,
因而奠定了良好的物质基础。
蛋白质点 a-S3、a-S4被鉴定为 S-腺苷-L-高半胱
氨酸水解酶(SAHH), 该酶是生物体内广泛存在的调
节细胞内甲基反应的一个关键酶,能可逆性地催化 S-
腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)分解为腺苷(Ado)、高半胱
氨酸(Hcy) [16]。SAH 是甲硫氨酸代谢的一个中间产
物, 甲硫氨酸可以延迟果实的成熟, 在降低植物生
长活动中, SAHH 的差异累积对种子发育从高度活
跃状态转至静止状态具有一定的作用。SAHH 快速
将 SAH 水解, 防止 SAH 的积累, 抑制了 SAH 依赖
性甲基化反应。在烟草 TCL中证实 SAHH是一种细
胞分裂素结合蛋白, Tanaka等[17]认为 SAHH甲基化
反应对植物形态发生的作用可能是由于 SAHH 缺
乏导致 DNA 甲基化不足而引起基因表达发生变化,
影响 CTK 的生物合成、代谢和信号转导途径, 从而
提高了内源 CTK的水平[18]。佘义斌等[19]在对棉花的
研究中, 发现 SAHH 基因在不同组织、器官中均表
达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。本试
验首次报道 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶在小麦花
药中的表达, 并且 SAHH 只在小孢子发育到单核中
晚期表达 , 而发育到双核期却没有表达 , 这说明
SAHH 很可能在花药发育过程中起基因表达控制开
关的作用, 而且还在细胞分裂、周期调控过程中发
挥重要的调节作用。
蛋白质点 b-L5 为泛素(ubiquitin), 泛素-蛋白酶
体途径是细胞内蛋白质在特定的时间和空间上高度
选择性降解的重要途径。该途径参与细胞内的多种
活动过程, 包括细胞凋亡、MHCI类抗原的递呈、细
胞周期以及细胞内信号转导, 与细胞的一些生理功
能和病理状态有密切联系。陈蕊红等[4]在不育材料
中检测到泛素蛋白连接酶 E2 的高表达, 推测与不
468 作 物 学 报 第 38卷


育性有关。李红霞等[20]利用 SSH技术研究了具有相
同细胞质的雄性不育系及近等基因可育系不育和可
育 cDNA文库的基因表达情况, 结果也表明泛素-蛋
白酶体途径的代谢与小麦雄性不育过程的细胞凋亡
有关。因此泛素可能不仅与花药小孢子的有丝分裂
有密切的关系, 还与小麦花药的不育机制有关。本
试验在花药发育的双核期检测到泛素的高度表达 ,
由此推测, 可能是通过泛素-蛋白酶体途径降解或者
关闭某些与细胞分裂和周期调控有关的关键因子 ,
使细胞终止分裂。朱华国等[21]在对棉花细胞脱分化
过程的研究中推测 SAHH 参与的 SAM 代谢途径与
泛素-蛋白酶体系统对染色质结构和基因表达谱的
改变发挥重要作用, 因此我们认为, 在小麦花药培
养脱分化过程中细胞或机体也很有可能通过泛素-
蛋白酶体途径和 SAHH 参与的 SAM 代谢途径共同
作用使基因或蛋白质在花药发育过程中选择性地表
达调控, 以此来保持代谢系统的正常运行。在双核
期 SAHH有选择性的缺失, 可能是由于泛素-蛋白酶
体途径在花药发育过程中抑制或降解了 SAHH, 使
花药发育从高度活跃状态转至静止状态, 即参与了
正常代谢调控。
蛋白质点 a-L6 为捕光叶绿素 a/b 结合蛋白, 该
蛋白是绿色植物光合系统中的重要蛋白, 其与色素
所形成的蛋白复合体在维持类囊体膜的结构、调节
激发能的分配、光保护以及对各种环境的适应等过
程中都起着重要的作用[22]。同时, 我们还鉴定到蛋
白质点 b-L1、b-Z1均为光系统 II放氧增强蛋白, 是
一种类囊体蛋白, 与叶绿素 a/b 结合蛋白一样, 在
光合原初光反应中具有重要作用。本试验在小麦花
药单核中晚期和双核期中都鉴定到高表达的光系统
II放氧复合体蛋白及捕光叶绿素 a/b结合蛋白, 说明
花药组织中存在叶绿体结构 , 其虽不是光合器官 ,
但可以进行光合作用, 合成少量的碳水化合物, 为
花药的正常发育提供必要的物质和能量。
蛋白质点 b-L3被鉴定为 pentatricopeptide repeat
protein PPR566-6, 大多数植物 PPR蛋白的功能预测
是针对线粒体或叶绿体的。到目前为止, 有证据显
示 PPR 蛋白涉及到细胞器基因组的表达调控, 即
PPR 蛋白是被用作调控原核起源基因组的真核蛋白
质。PPR 蛋白存在于基因表达的所有时期 , 参与
mRNA 的转录、拼接、加工、编辑、翻译和提高
mRNA稳定性。现在假设 PPR 蛋白是序列特异性的
RNA 连接因子, 能够直接识别 mRNA 位点的效应
酶。大量研究表明 PPR 蛋白在线粒体表达产物的加
工过程中具有重要作用。矮牵牛编码的 PPR 蛋白
ORF592 影响细胞质雄性不育相关线粒体基因 pcf
的转录模式, 降低了 PCF 蛋白质的丰度, 表现为转
录水平的调控[23]。萝卜恢复基因(Rfk1/Rfo)编码 PPR
蛋白质 ORF687, 转基因实验结果显示它能够减少
CMS 相关蛋白质 ORF125和 ORF138的丰度, 表现
为翻译水平的调控[24-25]。通过分析 PPR 蛋白的 N
端区域, 发现大多数 PPR蛋白的 N端氨基酸序列有
不少同源性, 具有对细胞器定位的信号肽, 几乎一
半的植物 PPR 蛋白定位于线粒体, 1/4定位于质体[26]。
到目前为止, 只有一种植物 PPR 蛋白位于线粒体或
质体外[27]。这可能是极端罕见的例外, 同时也说明
PPR 蛋白也可能在线粒体或质体外的细胞器中起作
用。而 PPR566-6蛋白的功能目前不是很清楚, 研究
发现此蛋白在苔藓叶绿体中表达, 是随着原丝体在
不同明暗条件下表达的一种特殊蛋白, 可能参与光
能量转化, 为细胞的发育提供物质和能量 [28]。PPR
蛋白在小麦花药发育过程中表达属首次报道, 由以
上近年来对 PPR蛋白的功能研究推测, PPR566-6很
可能是小麦花药线粒体基因表达调控产物, 与恢复
基因和育性有关。该推测有待进一步研究和验证。
蛋白质点 a-P5、a-P1 被鉴定为假定蛋白 , 点
a-P2、b-Z5、b-Z4 得分值没有达到显著水平, 我们
根据其实验分子量和等电点与理论值相比较, 推测
这 3个点也均为假定蛋白, 可能与花药发育的代谢途
径有密切关系, 有待进一步证实。
蛋白质组研究是近年来生物科学研究的新内容,
有许多问题正处于探索阶段。虽然我们从双向电泳
的蛋白质图谱中分别得到了 437 个和 450 个蛋白质
点、也鉴定出了 26个差异蛋白, 并通过质谱分析确
定了蛋白质的名称, 但这只能说明在陕农 138 小孢
子发育的单核中晚期和双核期之间存在蛋白质表达
上的差异。至于这些蛋白质是否囊括了这 2 个时期
的全部蛋白 , 双向电泳的蛋白质点与具体蛋白质
(酶、肽等)的关系如何, 以及这些鉴定出的蛋白质在
小麦小孢子发育代谢中具体起什么作用都是需要深
入研究的重要问题。另外, 本试验只用陕农 138为材
料, 其他材料的结果怎样也值得进一步研究。
小麦花药培养技术育种是近年发展起来的一项
育种新技术, 具有加快变异稳定速度, 提高育种效
率的优点, 但由于其绿苗诱导率偏低, 限制了其作
用的发挥。大量小麦花药培养的研究表明, 单核中
第 3期 毕惠惠等: 陕农 138小孢子发育过程中蛋白表达差异的比较分析 469


晚期的花培诱导率较高 , 而双核期的诱导率极低 ,
几乎为零[1-3]。从本试验和前人的试验结果可以看出,
小麦小孢子发育的单核中晚期与双核期之间存在着
蛋白质表达上的差异 , 且这些蛋白质参与能量代
谢、糖代谢、蛋白降解、防卫反应等, 既有酶蛋白, 又
有抑制蛋白等其他蛋白(表 2)。如果能从培养基的改
良上增添一种物质, 调控基因的表达或蛋白质功能,
延缓或终止小孢子发育 , 使其积聚在单核中晚期 ,
小麦花药培养的效率将会大幅度提高; 如果能改变
小孢子发育的方向, 效果可能更佳, 这一结果暗示
了有望进一步提高小麦花药培养的诱导率。
4 结论
从陕农 138 小孢子发育的单核中晚期和双核期
鉴定了 14个差异表达蛋白质点, 其中 11个蛋白质点
参与能量代谢、糖代谢、蛋白降解、防卫反应等。
UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、
S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶、泛素等蛋白质可能在
花药发育中具有重要意义。
References
[1] Sui X-X(隋新霞), Fan Q-Q(樊庆琦), Li G-Y(李根英), Huang
C-Y(黄承彦). Review on wheat anther culture. J Triticeae Crops
(麦类作物学报), 2005, 25(4): 127–131 (in Chinese with English
abstract)
[2] Wang P(王培), Chen Y-R(陈玉蓉). Effects of growth conditions
of anther-donor plants on the production of pollen plants in wheat
anther culture. Acta Genet Sin (遗传学报), 1980, 7(1): 64–71 (in
Chinese with English abstract)
[3] He D-G(何定岗), Ou-Yang J-W(欧阳俊闻). Response of wheat
anthers at different development stages to culture in vitro. Acta
Genet Sin (遗传学报), 1984, 6(2): 6–9 (in Chinese with English
abstract)
[4] Chen R-H( 陈蕊红), Ye J-X(叶景秀), Zhang G-S(张改生),
Wang J-S(王俊生), Niu N(牛娜), Ma S-C(马守才), Zhao J-X(赵
继新), Zhu J-C(朱建楚). Differential proteomic analysis of an-
ther proteins between cytoplasmic-nuclear male sterility line and
its maintainer in wheat (Triticum aestivum L.). Prog Biochem
Biophys (生物化学与生物物理进展), 2009, 36(4): 431–440 (in
Chinese with English abstract)
[5] Imin N, Kerim T, Weinman J J, Rolfe B G. Characterisation of
rice anther proteins expressed at the young microspore stage.
Proteomics, 2001, 1: 1149–1161
[6] Kerim T, Imin N, Weinman J J, Rolfe B G. Proteome analysis of
male gametophyte development in rice anthers. Proteomics, 2003,
3: 738–751
[7] Qi Y-F(齐延芳), Yang J-C(杨景成), Zhou Z-H(周柱化), Xing
Y-J(邢燕菊), Xu L-H(徐立华), Xu F-Z(许方佐), Qiu D-L(邱登
林). Isozyme analysis of maize (Zea mays L.) inbred lines and an
F2 segregation population during anther culture procedure. Acta
Agric Nucl Sin (核农学报), 2003, 17(3): 191–195 (in Chinese
with English abstract)
[8] Damerval C, Vienne D D, Zivy M. Technical improvements in
two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic
variation detected in wheat seedling proteins. Electrophoresis,
1986, 7: 52–54
[9] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation
of microgram quantities of protein utilizing the principle of pro-
tein-dye binding. Anal Chem, 1976, 72: 248–254
[10] Görg A, Obermaier C, Boguth G, Weiss W. Recent developments
in two-dimensional gel electrophoresis with immobilized pH gra-
dients: wide pH gradients up pH 12, longer separation distances
and simplified procedures. Electrophoresis, 1999, 20: 712–717
[11] Yang H-R(杨华瑞), Ma J-H(马俊会), Liu L-X(刘录祥), Wang
C-H(王成社), Xu X-T(许喜堂), Yang J-R(杨进荣), Zou S-F(邹
淑芳). Comparation analysis of the protein expressed at different
developmental stages of wheat variety Shannong 138. J Triticeae
Crops (麦类作物学报), 2010, 30(4): 680–683 (in Chinese with
English abstract)
[12] Eimert K, Villand P, Kilian A. Cloning and characterization of
several cDNAs for UDP-glucose pyrophosphorylase from barley
(Hordeum vulgare) tissues. Gene, 1996, 170: 227–232
[13] Tian C-E(田长恩), Zhang M-Y(张明永), Liang C-Y(梁承邺),
Huang Y-W(黄毓文 ), Liu H-X(刘鸿先 ). New progress in
physiological biochemistry mechanism of plant male sterility.
Chin Bull Life Sci (生命科学), 1999, 11(suppl): 94–97 (in Chi-
nese with English abstract)
[14] Wen L(文李), Liu G(刘盖), Zhang Z-J(张再君), Tao J(陶钧),
Wan C-X(万翠香), Li S-Q(李绍清), Zhu Y-G(朱英国). Prelimi-
nary proteomics analysis of the total proteins of HL type cyto-
plasmic male sterility rice anther. Hereditas (遗传), 2006, 28(3):
311–316 (in Chinese with English abstract)
[15] Zhang Z X, Tang W H, Zhang F D. Fertility restoration mecha-
nisms in S-type cytoplasmic male sterility of maize (Zea mays L.)
revealed through expression differences identified by cDNA Mi-
croarray and suppression subtractive hybridization. Plant Mol
Biol Rep, 2005, 23: 17–38
[16] Chen X(陈昕), Wang L(王琳). Research progress of S-aden-
osyl-homocysteine hydrolase and its inhibitors. Chin J Med Chem
(中国药物化学杂志), 1998, 8(1): 66–72 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[17] Tanaka H, Masuta C, Kataoka J. Inducible expression by plant
hormones of S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase gene from
Nicotiana tabacum during early flower bud formation in vitro.
Plant Sci Limerick, 1996, 113: 167–174
470 作 物 学 报 第 38卷

[18] Tanaka H, Masuta C, Uehara K. Morphological changes and hy-
pomethylation of DNA in transgenic tobacco expressing antisense
RNA of the S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase gene. Plant
Mol Biol, 1997, 35: 981–986
[19] She Y-B(佘义斌), Zhu Y-C(朱一超), Zhang T-Z(张天真), Guo
W-Z(郭旺珍). Cloning, expression, and mapping of S-adenosyl-
L-homocysteine hydrolase (GhSAHH) cDNA in cotton. Acta
Agron Sin (作物学报), 2008, 34(6): 958–964 (in Chinese with
English abstract)
[20] Li H-X(李红霞), Zhang L-Y(张龙雨), Zhang G-S(张改生), Niu
N(牛娜), Zhu Z-W(朱展望). Construction of cDNA library from
fertility-related genes of male sterile wheat with Aegilops
kotschyi cytoplasm by SSH. Acta Agron Sin (作物学报), 2008,
34(6): 965–971 (in Chinese with English abstract)
[21] Zhu H-G(朱华国), Tu L-L(涂礼莉), Jin S-X(金双侠), Xu L(徐
理), Tan J-F(谭家福), Deng F-L(邓锋林), Zhang X-L(张献龙).
Differential gene expression of cotton initial dedifferentiation.
Chin Sci Bull (科学通报), 2008, 53(20): 2483–2492 (in Chinese)
[22] Sun Q-M(孙钦秒), Leng J(冷静), Li L-B(李良璧), Kuang
T-Y(匡廷云). Recent advances of studies on the structure and
function of the light harvesting chlorophyll A/B-protein complex.
Chin Bull Bot (植物学通报), 2000, 17(4): 289–301 (in Chinese
with English abstract)
[23] Bentolila S, Alfonso A, Hanson M. A pentatricopeptide repeat-
containing gene restores fertility to male-sterile plants. Proc Natl
Acad Sci USA, 2002, 99: 10887–10892
[24] Barr C M, Fishman L.. The nuclear component of a cytonuclear
hybrid incompatibility in Mimulus maps to a cluster of pentatri-
copeptide repeat genes. Genetics, 2010, 184: 455–465
[25] Koizuka N, Imai R, Fujimoto H, Hayakawa T, Kimura Y,
Kohno-Murase J, Sakai T, Kawasaki S, Imamura J. Genetic cha-
racterization of a pentatricopeptide repeat protein gene, orf687,
that restores fertility in the cytoplasmic male-sterile kosena radish.
Plant J, 2003, 34: 407–415
[26] Lurin C, Andres C, Aubourg S, Bellaoui M, Bitton F, Bruyere C,
Caboche M, Debast C, Gualberto J, Hoffmann B, Lecharny A,
Ret M L, Martin-Magniette M L, Renou J P, Szurek B, Taconnat
L, Small I. Genome-wide analysis of Arabidopsis pentatrico-
peptide repeat proteins reveals their essential role in organelle
biogenesis. Plant Cell, 2004, 16: 2089–2103
[27] Ding Y H, Liu N Y, Tang Z S, Liu J, Yang W C. Arabidopsis
glutamine-rich protein 23 is essential for early embryogenesis
and encodes a novel nuclear PPR motif protein that interacts with
RNA polymerase II subunit III. Plant Cell, 2006, 18: 815–830
[28] Mitsuru H, Hiroshi M, Mamoru S. A pentatricopeptide repeat
protein is required for RNA processing of clpP pre-mRNA in
moss chloroplasts. J Biol Chem, 2007, 282: 10773–10782