全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(7): 1067−1074 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30671429, 30971849)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn; 王小佳, E-mail: wxj@swu.edu.cn
第一作者联系方式：E-mail: wwrrb518@hotmail.com; Tel: 13594001094
Received(收稿日期): 2010-02-01; Accepted(接受日期): 2010-04-19.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01067
甘蓝 KAPP编码基因的克隆与序列分析
吴韦铷 1 朱利泉 1,* 李成琼 3 杨 昆 1 唐章林 2 任雪松 3 王小佳 3,*
1 西南大学植物生理生化实验室; 2 重庆市油菜工程中心; 3 西南大学蔬菜学实验室, 重庆 400716
摘 要: 采用 PCR、RT-PCR 及其他分子生物学方法, 以甘蓝基因组 DNA、花蕾 RNA 和叶片 RNA 为模板, 分别对
甘蓝 KAPP gDNA和 KAPP cDNA进行扩增, 分别获得 3 247 bp的 KAPP gDNA片段、1 699 bp的 KAPP cDNA片段、
1 578 bp的花蕾 KAPP2 cDNA片段和 1 581 bp的叶片 KAPP2 cDNA片段。对克隆的甘蓝 KAPP gDNA和 cDNA (结
合报道的 KAPP cDNA)进行比对表明, 甘蓝 KAPP 基因包含 11个内含子, 均符合“GU-AG”剪接规则, 并且克隆得到
的 KAPP cDNA 序列与报道的 KAPP cDNA 序列有 6 处单个碱基的差异, 但两者的氨基酸序列完全一致。然而花蕾
KAPP2 cDNA、叶片 KAPP2 cDNA片段与报道的 KAPP cDNA序列相似性分别为 85.2%和 85.0%。这两个序列分别
在 590 bp和 593 bp处较早出现一个无义突变引起的终止密码子。Blast分析表明, 两基因编码的氨基酸序列与拟南
芥 KAPP氨基酸序列相似性最高, 其次为甘蓝 KAPP氨基酸序列。以已报道的 8种植物 KAPP的 CDS及本实验所克
隆的两个 KAPP2 序列构建分子进化树, 获得序列与甘蓝 KAPP 序列聚为一支。结合比较作图及分子进化树, 推测
KAPP基因在甘蓝基因组上有两个拷贝, 而笔者克隆到的 KAPP2 cDNA序列是其中一个拷贝, 是 KAPP进化过程中突
变失活的拟基因。
关键词: 自交不亲和性; 信号转导; KAPP基因; 甘蓝
Cloning and Sequence Analysis of KAPP Gene in Brassica oleracea
WU Wei-Ru1, ZHU Li-Quan1,*, LI Cheng-Qiong3, YANG Kun1, TANG Zhang-Lin2, REN Xue-Song3, and
WANG Xiao-Jia3,*
1 Plant Physiology and Biochemistry Laboratory of Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Chongqing Rapeseed Technology Research
Center, Chongqing 400716, China; 3 Key Laboratory in Olericulture of Chongqing, Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract: The gDNA and cDNA fragments of KAPP gene were amplified from genomic DNA, bud RNA and leaf RNA in Bras-
sica oleracea by PCR and RT-PCR and other molecular biology methods. We initially obtained a fragment of KAPP gDNA with
length of 3 247 bp, a fragment of KAPP cDNA with length of 1 699 bp, as well as a bud cDNA with length of 1 578 bp and a leaf
cDNA with length of 1 581 bp which were called KAPP2 cDNA of bud and KAPP2 cDNA of leaf respectively. Compared gDNA
with cDNA of KAPP, we found that there were 11 introns in KAPP gene, and these introns all followed typical GU-AG rule. Be-
tween KAPP cDNA which we cloned and KAPP cDNA released there are six nucleotide differences, but they encode a same
amino acid sequence. Sequences analysis of the KAPP2 cDNA which we cloned from bud cDNA and leaf cDNA in Brassica ol-
eracea showed that they share 85.2% and 85.0% identity with the reported KAPP cDNA respectively. We also found that the non-
sense mutation in 590 bp of KAPP2 of bud cDNA and 593 bp of KAPP2 of leaf cDNA led to the early appearance of termination
codon, who’s Blast indicated that both of them shared more identity in Arabidopsis thaliana than in Brassica oleracea. Based on
KAPP cDNA sequence of eight species released by NCBI and two sequences of KAPP2 cDNA cloned in this study, we constructed a
phylogenetic tree of KAPP gene, which showed that the two KAPP2 sequences were in the same group with released KAPP cDNA in
Brassica oleracea. Based on all the above analysis, as well as some view of the comparative mapping research, we speculated that
KAPP gene may have more than one copy in the genome of Brassica oleracea, the KAPP2 sequence cloned in this study may be the
other copies of KAPP gene. Moreover, they are likely to be the pseudogene which was inactivated by mutation during evolution
process. It has an important significance for the deep research between KAPP and self-incompatibility. The results will provide some
new insights into the research of molecular mechanism in SI and molecular evolution in Brassica oleracea.
Keywords: Self-incompatibility; Signal transduction; KAPP gene; Brassica oleracea
1068 作 物 学 报 第 36卷

芸薹属植物中广泛存在的自交不亲和性(self-
incompatibility, SI) ﹑是一种防止近亲繁殖 增加变异
的重要遗传机制。研究表明甘蓝等芸薹属植物的自
交不亲和性在遗传上受一复等位多态性 S 基因座
(S-locus)控制。该座上有 3类基因已先后被分离出来,
它们分别编码 S 位点糖蛋白(S-locus glycoprotein,
SLG)、S位点富半胱氨酸蛋白(S-locus cystein-rich
protein, SCR)和 S 位点受体激酶(S-locus receptor
kinase, SRK)[1-3]。在授粉后的数十分钟内, 花粉中特
异表达的信号分子 SCR与柱头乳突中特异表达的受
体 SRK在 SLG的辅助作用下结合, 触发目前尚未知
晓的信号传导过程, 最终导致水孔蛋白的关闭, 实
现 SI 反应。研究发现包括 SRK 等在内的许多类受
体蛋白激酶(receptor like kinases, RLKs)都被发现能
与激酶结合性蛋白磷酸酶(kinase associate protein
phosphatase, KAPP)相互作用[8-11]。拟南芥 KAPP基
因是作为 RLK5 相互作用的探针被分离出来的, 是
一个单拷贝基因[5-6], 在拟南芥不同组织和不同的发
育时期都有广泛的表达[4]。Vanoosthuyse等[17]利用
酵母双杂交系统证明, 甘蓝的 KAPP 在体外与 SRK
激酶结构域相互作用并且被其磷酸化, 同时 SRK也
被 KAPP 去磷酸化。结合以往的胞内观测, 在一次
自交授粉大约 1 h后, SRK被磷酸化了, 说明 KAPP
可能在 SRK介导的 SI信号转导中起下调作用, 就像
其在 FLS2 等其他受体蛋白激酶介导的信号转导途
径中所起的作用一样[10,15]。由于 SRK 是 SI 反应中
雌蕊一方的首要因子, 它的磷酸化与否直接导致 SI
信号的下游转导, 故 KAPP可能在 SI反应中起重要
的作用。
目前对于甘蓝中 KAPP gDNA序列的克隆与分
析还未见报道, KAPP 与 SI 信号转导途径下游相关
蛋白因子之间是如何共同调节 SI信号转导过程等问
题依然未知。而 KAPP 基因在甘蓝基因组中是否也
与拟南芥中一样只有一个拷贝, 也未见研究说明。
本研究采用 PCR 和 RT-PCR 技术, 在已经克隆和分
析 SI下游信号转导元件MLPK、ARC1和 THL1等的
编码基因的基础上[18-20], 拟对 KAPP gDNA 序列进行
克隆和序列分析, 这对于进一步研究 KAPP 在芸薹属
自交不亲和反应中的分子功能具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝自交不亲和品种 Ky57 与 Ay627 及大肠杆
菌菌株 DH5α, 由重庆市油菜工程中心提供; Plant
RNA(Mini) Kit 购自华舜生物公司, EASYpure 胶回
﹑收试剂盒 EasyTaq Polymerase 和 Trans RT-PCR
SuperMix购自 Transgen公司, pGEM-T Easy Vector
System购自 Promega公司。
1.2 DNA与 RNA提取
3 月初采集甘蓝品种 Ay627 开花前 1~2 d 的花
蕾以及少量叶片, 立即液氮速冻, –70℃保存, 用于
提取总 RNA。参照 Plant RNA(Mini) Kit说明书提取
总 RNA。分别对 Ky57和 Ay627进行幼苗培养后, 用
CTAB法提取总 DNA。
1.3 cDNA链的合成
根据试剂盒说明, 按 20 μL体系分别加入 Total
RNA 8 μL, Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg μL–1) 1 μL,
2×TS Reaction Mix 1 μL, TransScript RT/RI Enzyme
Mix 10 μL, 轻轻摇匀后于 42℃温浴 30 min, 最后
85 5 min℃ 失活 TransScript RT。
1.4 KAPP基因的扩增
采用 Vanoosthuyse等[17]报道的甘蓝 KAPP基因
的 cDNA序列(GenBank登录号为AJ427336)及 TAIR
中公布的拟南芥 KAPP 基因 (GenBank 登录号为
NM_121933)进行同源比对 , 根据比对结果设计并
合成 3 对引物, KAPP-F: 5′-AAGCGAAGAAGATG
GCGATG-3′; KAPP-R: 5′-ATCTGAAGCACCAGCT
GCAC-3′; KAPP′-F: 5′-ACTCTCGGTCAGTAAGC
CATC-3′; KAPP′-R: 5′-AGGCCACACCAACTCTGA
AC-3′; KAPP2: 5′-GCGAGGTTATCGGGAAGCTA-
3′; KAPP2-R: 5′-GTACGCATCACATTAGCTTGAT
C-3′。其中 KAPP-F 和 KAPP-R 位于比对结果中非
常保守的位置, 理论扩增长度为 1 573 bp的 cDNA
片段。而 KAPP′-F和 KAPP′-R则位于比对结果中不
太保守的位置, 用于基因组 DNA 扩增, 且理论上
KAPP-F和 KAPP′-R组合与 KAPP′-F和 KAPP-R组
合扩得的 cDNA片段中间有 162 bp的重叠以用于拼
接。引物 KAPP2-F 与 KAPP2-R 分别是根据报道的
甘蓝 KAPP 基因(AJ427336) 5′端序列及靠近 3′端的
序列设计的 , 理论扩增长度为 1 699 bp。引物为
KAPP′-F与 KAPP-R及 KAPP-F与 KAPP′-R时, PCR
条件为 94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 62℃ 1 min, 72℃ 2 min,
35个循环, 72℃ 10 min; 引物为 KAPP′-F与 KAPP-R
时 PCR参数为 94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 66℃ 1 min,
72℃ 2 min, 35个循环, 72℃ 10 min。引物为 KAPP2-F
与 KAPP2-R时 PCR参数为 94℃ 5 min; 94℃ 1 min,
60℃ 1 min, 72℃ 2 min, 35个循环, 72℃ 10 min。
第 7期 吴韦铷等: 甘蓝 KAPP编码基因的克隆与序列分析 1069


1.5 PCR产物克隆测序与序列分析
经 1% (W/V)琼脂糖凝胶电泳后,用 Gel Extrac-
tion Kit回收 PCR产物, 加 A反应后克隆到 pGEM-T
Vector 中, 然后转化大肠杆菌 DH5α 进行抗氨苄筛
选, 通过菌液 PCR鉴定, 送上海 Invitrogen公司测序,
采用 Blast 程序 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov//blast)
分析序列的同源性, 用 Vector NTI 软件比对基因序
列及氨基酸序列。
1.6 生物信息学分析
从 NCBI 中检索已报道的所有植物 KAPP 基因
的蛋白质序列及 cDNA序列 , 获得 8个物种 11个
KAPP基因的编码蛋白质序列及 cDNA序列(表 1)。
结合所获得的序列结果, 利用软件 Clustalw 对
包括甘蓝在内的 8个物种 KAPP基因的 cDNA 序列
和蛋白质序列进行多重比对分析 , 采用邻接法
(neighgor joining, NJ)构建进化树。

表 1 从 NCBI上获取的 8个物种 KAPP基因的 CDS序列和蛋白质序列
Table 1 CDS and protein sequences of KAPP gene in eight species from NCBI
序列号
No.
种名
Species name
CDS序列号
CDS accession No.
蛋白质序列号
Protein accession No.
1 拟南芥 Arabidopsis thaliana NM_121933 NP_197429.1
2 拟南芥 Arabidopsis thaliana NM_001161248 NP_001154720.1
3 大豆 Glycine max EU350554 ACA57833.1
4 大豆 Glycine max EU350555 ACA57834.1
5 百脉根 Lotus japonicus EU350556 ACA57835.1
6 籼稻 Oryza sativa AF075603 AAC26828.1
7 蓖麻 Ricinus communis XM_002517155 XP_002517201.1
8 秘鲁番茄 Solanum peruvianum EF623825 ABR18801.1
9 玉米 Zea mays NM_001111928 NP_001105398.1
10 玉米 Zea mays U81960 AAB93832.1
11 甘蓝 Brassica oleracea AJ427336 CAD20349.1

2 结果与分析
2.1 KAPP扩增结果
用引物 KAPP-F和 KAPP-R分别对 AY627花蕾
和叶 cDNA进行扩增, 分别获得 1 578 bp和 1 581 bp
的片段, 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳(图 1-A~B)。用
引物 KAPP-F 和 KAPP′-R 以及引物 KAPP′-F 和
KAPP-R 分别对 AY627 和 KY57 基因组 DNA 进行
扩增。测序结果表明, 引物 KAPP-F 和 KAPP′-R 产
物长度分别为 AY627: 1 556 bp和 KY57: 1 555 bp
(图 1-C~E 泳道); 引物 KAPP′-F 和 KAPP-R 产物长
度分别为 AY627: 1 955 bp和 KY57: 1 956 bp (图 1
中 D与 F泳道)。用引物 KAPP2-F和 KAPP2-R分别
对 AY627花蕾 cDNA和叶 cDNA进行扩增, 产物长
度均为 1 699 bp (图 1-G~H)。花蕾 cDNA扩增产物
比叶 cDNA扩增产物浓度高。
2.2 甘蓝 KAPP编码基因的序列分析
2.2.1 KAPP gDNA 的序列分析 将克隆到的甘
蓝 AY627和 KY57的 KAPP基因核序列片段分别进
行拼接,得到 3 247 bp和 3 246 bp, 将 AY627 gDNA
和 KY57 gDNA 与 NCBI 上的 KAPP cDNA 序列
(AJ427336)及用 KAPP2-F 和 KAPP2-R 克隆到的
AY627KAPP cDNA分别进行比对(图 2的 Bo1、Bo2、
Bo3和 Bo4), 结果相同, 即 KAPP编码基因的 gDNA
含 11 个内含子。AY627 中的内含子分别位于 156~
363、548~732、886~977、1 154~1 241、1 401~1 501、
1 646~1 736、1 799~1 941、2 081~2 194、2 290~2 758、
2 875~2 968和 3 102~3 190 bp处, 大小分别为 208、
185、92、88、101、91、143、114、469、94和 89 bp。
KY57 中内含子与 AY627 稍有差异, 前 8 个内含子
完全相同, 第 9个内含子位于 2 290~2 767 bp, 第 10
个位于 2 884~2 971 bp和第 11个位于 3 105~3 190
bp, 长度也稍有差异, 分别为 478、88和 86 bp。这
两个材料的所有内含子剪切方式均符合 GU-AG 规
则(图 2中下画线所示)。
2.2.2 KAPP cDNA 的序列分析 由于最初用
KAPP-F和 KAPP-R扩增 KAPP cDNA时, 获得后面
分析的 KAPP2 cDNA片段。随后用特异性更高的引
物 K A PP2 -F 与 K A PP2 - R 进行扩增 , 测得的
AY627KAPP cDNA序列与 NCBI上的 KAPP cDNA
序列(AJ427336)有 6处差异(图 2的 Bo1和 Bo2), 分
别是 437 bp处的 G被 C代替; 731 bp处的 G被 T代
1070 作 物 学 报 第 36卷


图 1 甘蓝 KAPP基因核 DNA序列与 cDNA序列电泳图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis patterns of KAPP’s DNA
and cDNA from Brassica oleracea
M: DL2000 plus DNA maker; A~B: 以 KAPP-F和 KAPP-R为引
物; C与 E: 以 KAPP-F和 KAPP′-R为引物; D与 F: 以 KAPP′-F
和 KAPP-R为引物; G~H: 以 KAPP2-F和 KAPP2-R为引物; A:
花蕾 cDNA为模板扩增的 KAPP2 cDNA序列; B: 叶片 cDNA为
模板扩增的 KAPP2 cDNA序列; C~D: AY627 gDNA为模板扩增
的 KAPP gDNA序列; E~F: KY57 gDNA为模板扩增的 KAPP
gDNA序列; G: 花蕾 cDNA为模板扩增的的 KAPP cDNA序列;
H: 叶片 cDNA为模板扩增的的 KAPP cDNA序列。
M: DL2000 plus DNA marker; A–B: using primers of KAPP-F and
KAPP-R; C and E: using primers of KAPP-F and KAPP′-R; D and
F: using primers of KAPP′-F and KAPP-R; G–H: using primers of
KAPP2-F and KAPP2-R; A: KAPP2 cDNA sequence amplified
using flower bud cDNA; B: KAPP2 cDNA sequence amplified
using leaf cDNA; C–D: KAPP gDNA sequence amplified using
AY627 gDNA; E–F: KAPP gDNA sequence amplified using KY57
gDNA; G: KAPP cDNA sequence amplified using AY627 flower
bud cDNA; H: KAPP cDNA sequence amplified using AY627 leaf
cDNA.

替; 899 bp处的 T被 C代替; 950 bp处的 A被 C代
替; 1 067 bp处的 G被 A代替和 1 211 bp处的 A被
G代替。用 Vector NTI软件分析, 这 6处均为同义
突变, 对氨基酸序列没有影响。由此可推知, 登录号
为 AJ42766 所相应的材料的 KAPP cDNA 序列与
AY627的 KAPP的编码区也许只能通过同义突变产
生等位形式, 而不能容忍错义突变。
然而, 用引物 KAPP-F和 KAPP-R通过 RT-PCR
扩增所得到的蕾和叶的 KAPP cDNA 序列与 NCBI
上公布的 KAPP 的 cDNA 序列有一定差异(图 2 中
Bo1、Bo5和 Bo6)。Bo5为以 AY627蕾 cDNA为模
板扩增的 KAPP cDNA序列, Bo6为以 AY627叶片
cDNA为模板扩增的 KAPP cDNA序列, 以下分别称
为蕾 KAPP2 cDNA 和叶 KAPP2 cDNA。理论上扩增
片段的长度应为 1 573 bp, Bo5与 Bo6测序后分别得
到 1 578 bp和 1 581 bp, 两者序列相似性为 99.7%,
唯一的差异是 Bo5在 495 bp处比 Bo6少“AAG”3个
碱基。Bo5 与 KAPP 的 cDNA 序列(AJ427336)一致
性为 85.2%, Bo6 与其一致性为 85.0%。并且由图 2
可知 , 蕾 KAPP2 cDNA (Bo5)和叶 KAPP2 cDNA
(Bo6)与已知的 KAPP 基因(AJ427336)以及本实验克
隆的 KAPP 基因之间的差异主要在前 600 bp, 其间
有多处缺失, 最大的缺失见于 422 bp 处, 其余均为
单个碱基或两个碱基的差异。而在 261 bp左右有一
段高“CT”含量的插入(图 2 中第 2 行灰色字体部分),
此外在这两个序列的 336~384 bp和 495~502 bp都发
现了与 KAPP gDNA序列中的第 2内含子和第 3内
含子序列一致性极高的部分(如图 2中第 3行中间的
大片灰色背景区域)。推测扩增得到的 KAPP2 cDNA
所对应的 KAPP2 gDNA序列在此处和 KAPP gDNA
的剪接方式有所差异, 但它们的序列相似度很高。
此外在 Bo5的 590 bp与 Bo6的 593 bp处均分别较
早地出现了无义突变引起的终止密码子 T(U)GA (图
2中黑框所示)。对 Bo5和 Bo6的氨基酸序列分析发
现, 蕾 KAPP2 cDNA(Bo5)通过预测仅编码 192个氨
基酸残基, 叶 KAPP2 cDNA (Bo6)仅编码 193个氨基
酸残基这两个氨基酸序列相似性高达 98.5%, 而
NCBI 上公布的 KAPP 的 cDNA 却编码 563 个氨基
酸残基, 并含 FHA 和 PP2C 两个保守结构域。用
Blast分析 Bo5与 Bo6发现, 在 NCBI上的序列中与
它们的 cDNA 序列相似性最高的仍是甘蓝的 KAPP
cDNA 序列。用 Protein Blast 和结构域保守性
(conserved domains)分析他们预测编码的氨基酸序
列发现, 与它们相似性最高的是拟南芥 KAPP 的氨
基酸序列, 其次是甘蓝的, 在这两个预测序列中并
未发现任何结构域。
2.3 KAPP的分子进化分析
分析 8 种植物的 KAPP 基因的编码序列(coding
sequence, CDS), 其两两比对的结果见表 2, 甘蓝与拟
南芥的 KAPP基因的 CDS序列相似性最高, 为 80.2%,
其次是百脉根、蓖麻、大豆和番茄。在 8个物种中, 百
脉根和大豆的序列相似性最高为 83.5%, 甘蓝和籼稻
的序列相似性最低, 为 52.7%。图 3 表明 8 个物种的
13 个 cDNA 序列中, 番茄分为单独的一支, 玉米和水
稻一支, 而大豆、百脉根、蓖麻、拟南芥和甘蓝聚为
另一支。最后一支又分为拟南芥、甘蓝一组, 百脉根
和大豆一组, 蓖麻则单独一组。这与 Barbazuk等[27]根
据已完成的和正在进行的已有的植物的基因组测序结
果所构建的进化树的结果基本相同。甘蓝和拟南芥同
属十字花科, 百脉根和大豆同属豆科, 而它们同蓖麻
一起都属于双子叶植物, 玉米、水稻和番茄都属单子
叶植物。本实验通过 RT-PCR克隆得到的甘蓝 KAPP2
第 7期 吴韦铷等: 甘蓝 KAPP编码基因的克隆与序列分析 1071



图 2 甘蓝 KAPP基因组序列与 cDNA序列比对结果
Fig. 2 Sequence comparison of KAPP gDNA and cDNA from B. oleracea
*表示 5个碱基以上的比对结果连续相同的部分。Bo1: NCBI上公布的甘蓝 KAPP cDNA序列(AJ427336); Bo2: 甘蓝 AY627KAPP cDNA
序列; Bo3: 甘蓝 AY627KAPP核基因组序列; Bo4: 甘蓝 KY57KAPP核基因组序列; Bo5: 以甘蓝 AY627蕾 cDNA为模板, KAPP-F和
KAPP-R为引物扩增得到的蕾 KAPP2 cDNA序列: Bo6: 以甘蓝 AY627叶 cDNA为模板, KAPP-F和 KAPP-R为引物扩增得到的叶
KAPP2 cDNA序列; 用下画线标出内含子剪切位点。
* indicates similar part in alignment results of more than five bases. Bo1: KAPP cDNA sequence of B. oleracea from NCBI (accession No.
AJ427336); Bo2: KAPP cDNA sequence of B. oleracea AY627; Bo3: KAPP gDNA sequence of B. oleracea AY627; Bo4: KAPP gDNA
sequence of B. oleracea KY57; Bo5: sequence amplified from the cDNA of flower bud of B. oleracea AY627 by using primer KAPP-F and
KAPP-R; Bo6: sequence amplified from the cDNA of leaf of B. oleracea AY627 by using primer KAPP-F and KAPP-R; the splicing sites of
introns of KAPP genomic sequence was underlined.

蕾 cDNA和 KAPP2叶 cDNA与NCBI上的甘蓝 cDNA
序列在聚类分析中聚在一起, 但分成了两支, 结合前
面序列分析结果, 推测克隆得到的KAPP2的 cDNA序
列可能是 KAPP基因的另外的拷贝。
1072 作 物 学 报 第 36卷

表 2 甘蓝与其他植物 KAPP基因 CDS序列的相似性
Table 2 Similarity of KAPP gene’s CDS in Brassica oleracea and some other species (%)
物种
Species
甘蓝
Brassica
oleracea
拟南芥
Arabidopsis
thaliana
大豆
Glycine max
百脉根
Lotus
japonicus
蓖麻
Ricinus
communis
番茄
Solanum
peruvianum
籼稻
Oryza sativa
拟南芥 Arabidopsis thaliana 80.2
大豆 Glycine max 61.1 62.9
百脉根 Lotus japonicu 61.3 63.1 83.5
蓖麻 Ricinus communis 61.6 65.3 68.0 67.1
番茄 Solanum peruvianum 60.0 61.1 65.6 66.2 65.8
籼稻 Oryza sativa 52.7 53.8 56.7 56.8 54.8 57.1
玉米 Zea mays 56.9 56.6 59.1 59.7 57.1 58.8 78.7

图 3 KAPP基因的遗传进化树
Fig. 3 Genetic dendrogram of KAPP gene

3 讨论
3.1 KAPP基因的功能
以甘蓝花蕾为材扩增, 获得 KAPP cDNA 序列,
结合 Vnoosthuyse 等[17]利用酵母双杂交系统证明甘
蓝的 KAPP在体外与 SRK激酶结构域相互作用并且
被其磷酸化, 为 KAPP可能在 SRK的下调中起作用
提供了进一步的证据。研究表明, KAPP具有通过去
磷酸化作用减弱 SI信号转导途径运行的结构基础。
几乎所有 KAPP分子都具有 N末端 I型膜定位信号
域(N-terminal type I membraneanchor)、激酶互作域
(kinase interaction domain, KI)和 PP2C 型催化域
(protein phosphatase type-2C, PP2C)。其中激酶互作
域(KI)因包含一个“叉状结构”基序(forkhead-associat-
ed, FHA) 而 被 称 为 KI-FHA (kinase-interacting
FHA)[21]。拟南芥 RLK5 激酶与 KAPP 结合时需要
RLK5 处于自磷酸化状态 , 表明 KAPP 可能识别
RLK5 上被磷酸化的丝氨酸或苏氨酸或两者都识别
并与之结合[22]。KAPP 在体外也可以与 CLV1 结合,
结合与否取决于 CLV1 的磷酸化状态[14-15,23]。另外,
拟南芥的KAPP可以通过其自身的 FHA域对类受体
蛋白激酶信号路径进行负调控, 这在植物的发育中
尤为重要[23]。根据这些分析 KAPP可能也以类似方
式介导 SI信号转导途径。它很可能通过与磷酸化的
SRK结合并将其去磷酸化, 从而对 SI信号转导途径
起到下调作用。对于这种分子机理的进一步确定和
深入研究, 将对揭示 SI 信号转导的机制具重要意义,
并可望为细胞信号转导的分子生物学研究提供新
内容。
3.2 KAPP 基因在甘蓝基因组上很可能有两个拷
贝
比较遗传作图研究发现甘蓝与拟南芥之间存在
广泛的共线性关系。但其共线性区域间的重复次数
尚无定论, 一般倾向于有 3个拷贝。而近年更多序
列方面的比较研究发现, 甘蓝与拟南芥之间的共线
性关系是很复杂的, 甘蓝在进化过程中发生了大量
基因水平和染色体水平的重组事件, 导致不存在偏
好性的基因的丢失现象[16]。KAPP 基因在拟南芥中
是一个单拷贝的基因 [5-6], 推测甘蓝中不只一个拷
贝。结合此观点, 推测本实验中根据已报道的甘蓝
KAPP cDNA序列与拟南芥 KAPP cDNA的保守区设
计引物(覆盖编码区)所扩增出来的 KAPP2序列很可
第 7期 吴韦铷等: 甘蓝 KAPP编码基因的克隆与序列分析 1073


能是 KAPP另一个拷贝。对于 KAPP基因的拷贝数,
我们通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridi-
zation, FISH)实验表明在甘蓝的同一个染色体组中
最多观察到两对同源的荧光信号(另文发表)。据此,
推测 KAPP 基因在甘蓝染色体组中只有两个拷贝。
根据芸薹属植物基因组三倍化假说以及比较基因组
学的部分观点, 甘蓝中应该有 3 个 KAPP 对应于拟
南芥 KAPP基因, 但本实验克隆和 FISH结果都说明
只有两个, 推断可能 KAPP 基因没有经过三倍化或
者三倍化不久后又丢失了一个拷贝。
分子进化学认为基因在倍增的最初产物是两个
相同的基因, 选择压力保证其中一个能继续提供倍
增前由单基因拷贝所提供的蛋白功能, 而另一个则
不必经受同样的选择压力, 能够积累随机突变。多
数情况下这种突变使倍增产生的新基因失活变为拟
基因。在研究 α 和 β 珠蛋白基因家族的拟基因序列
时发现, 似乎最常见的失活突变是发生在基因编码
区的移框和无义突变[25]。此外有人预见插入/缺失突
变对于基因组进化的贡献比碱基突变还要大得多。
它不仅可以像碱基突变那样造成基因组的多态性 ,
甚至还可以通过原基因外显子和内含子上的插入或
缺失使基因序列结构发生变化, 而导致基因组中新
基因的产生 [24]。然而由于遗传冗余(genetic redun-
dancy)的发现, 这对基因进化的解释就更加复杂。当
一个基因组中有两个基因具有相同功能时就会产生
遗传冗余[24]。功能基因可以满足生化需要而冗余基
因的序列就会发生改变。因此前面提及的拟基因也
可以说是发生突变失活的冗余基因保留下来的拷
贝。本研究克隆的两个组织材料的 KAPP2 cDNA,
分别在 590 bp和 593 bp处较早地出现了无义突变引
起的终止密码子 T(U)GA。并且在靠近 5′端的前 500
bp有多处缺失, 最大一处位于 442 bp长度为 33 bp,
一处插入以及单碱基或两个碱基的差异, 还发现了
与 KAPP 基因内含子极相似的序列。它们所编码的
氨基酸序列通过 Blast 分析发现拟与南芥的氨基酸
序列相似性最高达 58%, 其次是与甘蓝的氨基酸序
列, 达 46%, Blast E值分别是 2e−38和 2e−36。Zhang
等[27]提出的确定拟基因的标准是：(1) 与编码已知
蛋白质的序列高度相似(Blast E值＜1e−10, 氨基酸相
似程度大于 40%); (2) 与已知功能基因进行比对 ,
不含超过 60 bp的空洞; (3) 与相似基因比较, 覆盖
了其 70%的编码序列区域; (4) 包含功能缺失移码
或者提前的终止密码子以及多腺嘌啉尾部序列。由
此可以推测克隆到的 KAPP2基因是 KAPP基因在进
化过程中突变失活的冗余基因, 并且在芸薹属植物
漫长的进化过程中通过不断累计突变并没有产生新
的功能, 而只是以冗余基因的身份一直保留在甘蓝
的基因组中。
4 结论
通过对 KAPP 基因的克隆发现甘蓝 KAPP 基因
包含 11个内含子 , 它们均符合“GU-AG”剪接规则 ,
而且 KAPP 基因在甘蓝基因组中并非单拷贝的, 克
隆到的 KAPP2 基因就可能是其另一个拷贝并且是
其进化过程中突变失活的拟基因。
References
[1] Nou I S, Watanabe M, Isogai A, Hinata K. Comparison of
S-alleles and S-glycoproteins between two wild populations of
Brassica campestris in Turkey and Japan. Sex Plant Reprod,
1993, 6: 79−86
[2] Schopfer C R, Nasrallah M E, Nasrallah J B. The male determi-
nant of self-incompatibility in Brassica. Science, 1999, 286:
1697−1700
[3] Stein J C, Howlett B, Boyes D C, Nasrallah M E, Nasrallah J B.
Molecular cloning of a putative receptor protein kinase gene en-
coded at the self-incompatibility locus of Brassica oleracea.
Proc Nat Acad Sci USA, 1991, 88: 8816−8820
[4] Cohen P T W. Novel protein serine/threonine phosphatases: va-
riety is the spice of life. Trends Biochem Sci, 1997, 22: 245−251
[5] Stone J M, Collinge M A, Smith R D, Horn M A, Walker J C.
Interaction of a protein phosphatase with an Arabidopsis serine-
threonine receptor kinase. Science, 1994, 266: 793−795
[6] Torii K U. Receptor kinase activation and signal transduction in
plants: an emerging picture. Curr Opin Plant Biol, 2000, 3:
361−367
[7] Clark S E, Williams R W, Meyerowitz E M. The CLAVATA1
gene encodes a putative receptor kinase that controls shoot and
floral meristem size in Arabidopsis. Cell, 1997, 89: 575−585
[8] Braun D M, Stone J M, Walker J C. Interaction of the maize and
Arabidopsis kinase interaction doamins with a subset of recep-
tor-like protein kinases: implication for transmembrane signaling
in plants. Plant J, 1997, 12: 83−95
[9] Park A R, Cho S K, Yun U J, Jin M Y, Lee S H, Sa-
chetto-Martins G, Park O K. Interaction of the Arabidopsis re-
ceptor protein kinase Wak1 with a glycine-rich protein, AtGRP-3.
Biol Chem, 2001, 276: 26688−26693
[10] Gómez-Gómez L, Bauer Z, Boller T. Both the extracellular leu-
cine-rich repeat domain and the kinase activity of FLS2 are re-
quired for flagellin binding and signaling in Arabidopsis. Plant
Cell, 2001, 13: 1155−1163
1074 作 物 学 报 第 36卷

[11] Li J, Wen J Q, Lease K A, Doke J T, Tax F E, Walker J C. BAK1,
an Arabidopsis LRR receptor-like protein kinase, interacts with
BRI1 and modulates brassinosteroid signaling. Cell, 2002, 110:
213−222
[12] Shah K, Russinova E, Gadella T W Jr, Willemse J, De Vries S C.
The Arabidopsis kinase-associated protein phosphatase controls
internalization of the somatic embryogenesis receptor kinase 1.
Genes, 2002, 16: 1707−2003
[13] Cabrillac D, Cock J M, Dumas C, Gaude T. The S-locus recep-
torkinase is inhibited by thioredoxins and activated by pollen
coat proteins. Nature, 2001, 410: 220−223
[14] Williams R W, Wilson J M, Meyerowitz E M. A possible role
forkinase-associated protein phosphatase in the Arabidopsis
CLAVATA1 signaling pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 1997,
94: 10467−10472
[15] Stone J M, Trotochaud A E, Walker J C, Clark S E. Control of
meristem development by CLAVATA1 receptor kinase and
kinase-associated protein phosphatase interactions. Plant Physiol,
1998, 117: 1217−1225
[16] Li Y-Y(李媛媛), Fu Y-D(傅廷栋), Ma C-Z(马朝芝). Advances
of comparative genomics in Brassica. Chin Bull Bot (植物学通
报), 2007, 24(2): 200−207 (in Chinese with English abstract)
[17] Vanoosthuyse V, Tichtinsky G, Dumas C, Gaude T, Cock J M.
Interaction of calmodulin, a sorting nexin and kinase-associated
protein phosphatase with the Brassica oleracea S-locus receptor
kinase. Plant Physiol, 2003, 133: 919−929
[18] Zhao Y-B(赵永斌), Zhu L-Q(朱利泉), Wang X-J(王小佳).
Cloning and sequences analysis of m locus protein kinase gene
from Brassica oleracea. Acta Agric Sin (作物学报), 2006, 32(1):
46−50 (in Chinese with English abstract)
[19] Liu D(刘东), Zhu L-Q(朱利泉), Wang X-J(王小佳). Cloning
and characterization of SRK-binding protein THL1 gene from
Brassica oleracea L. in self-incompatibility signaling process.
Acta Hort Sin (园艺学报), 2003, 30(1): 56−58 (in Chinese with
English abstract)
[20] Liu D(刘东), Zhu L-Q(朱利泉), Wang X-J(王小佳). Cloning
and sequences analysis of ARC1 protein gene, a substrate of
SRKin SI signal transduction from Brassica oleracea. Acta
Agron Sin (作物学报), 2004, 30(5): 427−431 (in Chinese with
English abstract)
[21] Li J, Smith G P, Walker J C. Kinase interaction domain of
kinase-associated protein phosphatase, a phosphoprotein binding
domain. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 7821−7826
[22] Braun D M, Walker J C. Plant transmembrane receptors: new
pieces in the signaling puzzle. Trends Biochem Sci, 1996, 21:
70−73
[23] Philip W B. Receptor kinases in plant development. Trends Plant
Sci, 1998, 3: 384−388
[24] Nowak M A, Boerlijst M C, Cooke J, Smith J M. Evolution of
genetic redundancy. Nature, 1997, 388: 167−170
[25] Brown T A. Yuan J-G(袁建刚) trans. Genomes 2 (基因组 2).
Beijing: Science Press, 2006. pp 538−544 (in Chinese)
[26] Barbazuk W B, Fu Y, McGinnis K M. Genome-wide analyses of
alternative splicing in plants: opportunities and challenges. Ge-
nome Res, 2008, 18: 1381−1392
[27] Zhang Z, Carriero N, Gerstein M. Comparative analysis of proc-
essed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends
Genet, 2004, 20: 62−67