全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(8): 1425−1434 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中国烟草总公司重点科技项目(110201002006)资助。
第一作者联系方式: E-mail: qijm863@163.com, Tel: 0591-87644898
Received(收稿日期): 2011-12-15; Accepted(接受日期): 2012-04-16; Published online(网络出版日期): 2012-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120511.1806.022.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01425
应用 ISSR与 SRAP分析烟草种质资源遗传多样性及遗传演化关系
祁建民 1 梁景霞 2 陈美霞 1,3 徐建堂 1 牛小平 1 周东新 4 王 涛 5
陈顺辉 6
1福建农林大学作物科学学院 / 作物遗传育种与综合利用省部共建教育部重点实验室, 福建福州 350002; 2山东省济宁市生物化学工
业办公室, 山东济宁 272000; 3宁德师范学院生物工程系, 福建宁德 352100; 4福建省龙岩市烟草科学研究所, 福建龙岩 364000; 5福建
南平烟草分公司, 福建南平 353000; 6福建省烟草科学研究所, 福建福州 350003
摘 要: 应用 ISSR 与 SRAP 两种分子标记, 研究国内外 96 份烟草种质的遗传多样性及不同栽培类型种质的遗传演
化关系。表明烟属种间具有丰富的遗传多样性, 种间的遗传相似性(GS)在 0.28~0.58之间, 遗传分化系数(Gst)为 0.83。
普通栽培种品种间遗传多样性水平较低, 品种间的遗传相似性在 0.61~0.99 之间, 栽培种内的遗传多样性为烤烟>晒
晾烟>白肋烟>香料烟。当相似系数在 0.67作切割线时, 基于 2种标记的 96份烟草种质资源的聚类结果显示: (1)普通
烟草栽培品种材料 91份聚在同一大类, 而黄花烟、黏烟草、浅波烟草、哥西氏烟草、香甜烟草 5个种也分别为单独
的个类, 同普通烟草栽培种类群完全区别开来; (2)从进化上看, 烤烟和晒晾烟间的遗传进化关系最近, 香料烟和黄花
烟之间的亲缘关系较远; 普通烟草栽培种中国内外来源的烟草品种亲缘关系极其相近, 遗传分化现象甚微; (3) 2 种
分子标记虽然原理不同, 但分析结果趋势相近(r=0.68, P=1.000)。
关键词: 烟草; ISSR; SRAP; 遗传多样性; 遗传演化
Genetic Diversity and Evolutionary Analysis of Tobacco (Nicotiana tabacum L.)
Germplasm Resources Based on ISSR and SRAP Markers
QI Jian-Min1, LIANG Jing-Xia2, CHEN Mei-Xia1,3, XU Jian-Tang1, NIU Xiao-Ping1, ZHOU Dong-Xin4,
WANG Tao5, and CHEN Shun-Hui6
1 Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops / College of Crop Science of Fujian Agriculture
and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2 Biochemistry Industrial Office of Jining, Jining 272000, China; 3 Department of Biological Engi-
neering of Ningde Normal University, Ningde 352100, China; 4 Fujian Longyan Tobacco Science Institute, Longyan 364000, China; 5 Nanping To-
bacco Branch Company, Nanping 353000, China; 6 Fujian Tobacco Science Institute, Fuzhou 350003, China
Abstract: In order to explore on the genetic diversity and genetic evolution among cultivated types and wild species in the genus
Nicotiana, 96 tobacco accessions from China and abroad were studied with ISSR and SRAP analysis. Both molecular markers
revealed high genetic diversity among species of Nicotiana (genetic similarity = 0.28–0.58) and low genetic diversity among 91
cultivated tobacco lines (Genetic Similarity = 0.61–0.99). Genetic differentiation index (GST) among species of Nicotiana was
0.83. The order of genetic diversity index within different cultivated types was cured tobacco>suncured tobacco>burley to-
bacco>oriental tobacco. When the similarity coefficient was 0.67 as the cutting line, the cluster results of 96 tobacco accessions
based on SRAP and ISSR were as follows: (1) UPGMA analysis showed that all 91 culture varieties clustered into one group
separating from N. rustica, N. glutinosa, N. repanda, N. gossei, N. suaveolens. (2) The cured tobacco has close genetic relation-
ship with suncured tobacco, and oriental tobacco was far away from N. rustica. There was little genetic differentiation between
cultivated tobacco lines from China and those from other countries. (3) The correlation coefficient between genetic distance ma-
trixes based on ISSR and SRAP was 0.68, indicating that the basic results of the two types of markers are consistent. In conclusion,
ISSR and SRAP are efficient in generating more accurate information on genetic background, relationship and evolution of to-
bacco germplasm. The results of this research would be favorable for further practices in tobacco breeding.
Keywords: Tobacco (Nicotiana tabacum L.); Inter-simple sequence repeat (ISSR); Sequence-related amplified polymorphism
(SRAP); Genetic diversity; Evolution
1426 作 物 学 报 第 38卷

烟草(Nicotiana tabacum L.)起源于美洲、大洋洲
及南太平洋的一些岛屿, 根据烟草的生物学性状、
烟叶化学品质及栽培调制方法的不同, 可将烟草分
为烤烟、晒晾烟、白肋烟、香料烟、黄花烟和野生
烟等不同类型。近年来生产中使用的骨干品种日益
集中, 导致我国烟草种质和生产上所用的品种遗传
基础日益狭窄。利用分子标记技术研究烟草种质资
源多样性, 有利于科学评价这些种质资源的亲缘关
系, 对于烟草杂交育种中亲本选择有重要的应用价
值。随着分子标记的快速发展, 国内外学者在 DNA
水平上对烟草种质资源的遗传多样性开展了大量研
究。1994年 Coussirat[1]首先用 160个 RAPD随机引
物分析 32个烟草品种, 其中仅有 9个引物显示出品
种间的多态性。随后许明辉等[2]、杨友才等[3]和郭金
平等[4]利用 RAPD 标记进行聚类分析, 供试材料完
全区分开来, 但整体而言烟草品种间能扩增出多态
性的引物比例较低, 而且标记分析的稳定性也相对
较低。祁建民等[5]、肖炳光等[6]、傅冰等[7]和梁景霞
等 [8]利用简单重复序列标记(ISSR)的聚类结果与种
间遗传分化相吻合, 表明栽培种内的品种遗传基因
较单一遗传基础相对狭窄, 应在育种上重视发掘和
利用烟草野生种的遗传潜力。Ren等[9]、杨友才等[10]
和李凤霞等 [11]采用了扩增片段长度多态性标记
(AFLP), 尽管其多态性效率较高, 但操作较复杂。刘
建丰等[12]和刘艳华等[13]采用序列相关扩增多态性标
记(SRAP)将同种类型的烟草基本聚合在同一种类群
中, 表明 SRAP 标记较为适合烟草种质资源遗传多
样性研究。叶兰钦等[14]和刘胜传等[15]使用共显性的
微卫星 DNA 标记(SSR)显示了重要应用价值, 但目
前烟草中 SSR标记数量有限。因多数研究者仅应用
单一分子标记类型 , 随后杨友才等 [16]利用 200 条
RAPD引物和 4对 AFLP引物分析 48份烟草种质材
料, 获得了相似但不完全相同的结果, 两者都可将
48份烟草资源分为黄花烟草群和普通烟草群两大类
群, 后者又可被进一步分为 4 组。陶爱芬等[17]采用
ISSR和 IRAP两种分子标记, 对国内外 28份烟草种
质资源聚类分析, 并对 2种方法的结果予以比较。聂
琼等[18]利用 8 对 SSR 引物和 8 个 ISSR 引物 2 种标
记技术相结合的方法, 分析了 23份烟草种质遗传多
样性, 表明两类标记的结果相似但不完全相同, 但
是 2 种标记的聚类结果都与多数品种的亲缘关系基
本一致, 说明这 2 种标记均可用于烟草种质资源的
遗传多样性分析。上述研究仅针对数量较少的烟草
种质资源或烤烟类型, 较少涉及不同类型、不同来
源地烟草种质的遗传演化关系。在烟草育种上, 因
缺乏对种质资源遗传演化的全面认识, 限制了育种
家对种质资源的科学应用与创新。本研究利用 ISSR、
SRAP 两种分子标记结合的方法, 试图揭示烟草种
质资源遗传多样性与亲缘关系, 并进一步探讨不同
类型和不同来源地烟草种质资源的遗传演化关系 ,
为烟草遗传育种利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
96 份材料(表 1), 包括普通烟草栽培种(N. ta-
bacum)的 91份栽培品种以及黏烟草(N. glutinosa)、
浅波烟草(N. repanda)、哥西氏烟草(N. gossei)和香甜
烟草(N. suaveolens) 4个烟草野生种和 1份黄花烟(N.
rustica)栽培种 , 涵盖烟草属的 3 个亚属(普通烟亚
属、黄花烟亚属、碧冬烟亚属)中的 6 个种, 栽培品
种包含烤烟、晾晒烟、白肋烟和香料烟等类型。上
述材料分别来自于中国、美国、加拿大、津巴布韦、
坦桑尼亚、秘鲁、澳大利亚、墨西哥和土耳其, 包
含主要烟草生产国的主要烟草类型。
1.2 烟草基因组 DNA提取
在福建农林大学教学农场种植供试材料。按梁
景霞等[19]的方法提取幼苗嫩叶 DNA, 用 RNA/DNA
calculator 检测 DNA 的浓度和纯度, 统一稀释到 40
ng μL−1, –20℃保存备用。
1.3 ISSR-PCR与 SRAP-PCR扩增
ISSR与 SRAP的反应体系、扩增程序及产物检
测等参见祁建民等[6]和梁景霞等[20]的方法。
1.4 数据分析
分别统计每一引物对供试材料所扩增的清晰可
辨的总带数, 依据条带的有无, 有记为“1”, 无记为
“0”, 构建二维数据矩阵。利用 NTSYSpc2.11软件计
算种质资源间遗传相似性系数 GS, 采用 UPGMA法
对 96份种质资源进行分子聚类分析[20]。应用 TFPGA
软件[21]对种质资源的 ISSR、SRAP的遗传相似系数
矩阵的相关性进行 Mantel检验[22]。利用 PopGen1.31
软件[23]估算不同类型烟草以及国内外栽培烟草的遗
传多样性参数, 即等位基因位点数(Ao)、有效等位基
因位点(Ae)、Nei 的遗传多样度[24](H)、多态性谱带
百分比(PPB)、遗传分化系数(Gst)与基因流(Nm)、
Nei’s遗传距离及遗传一致度[25], 并用 UPGMA法对 6
个种间烟草类型进行遗传演化关系的分子聚类分析。
第 8期 祁建民等: 应用 ISSR与 SRAP分析烟草种质资源遗传多样性及遗传演化关系 1427


表 1 供试材料的编号、品种名称、种名、类型及来源
Table 1 Number, name, species, type, and origin of 96 tobacco accessions
编号
Code
材料名称
Name of accessions
种名
Species
类型
Type
来源
Origin
1 红花大金元 Honghuadajinyuan N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国云南 Yunnan, China
2 永定 401 Yongding 401 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
3 永定 1号 Yongding 1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
4 翠碧 1号 Cuibi 1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
5 大黄金 Dahuangjin N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国山东 Sandong, China
6 特字 1号 Tezi 1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
7 云花 1号 Yunhua 1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
8 云选 2号 Yunxuan 2 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
9 湖里种 Hulizhong N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
10 大叶密目 Dayemimu N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
11 田心烟 Tianxinyan N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
12 长汀本地种 Changtingbendizhong N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
13 红坊 7208 Hongfang 7208 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
14 73-1-1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
15 6103 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
16 香甜烟草 Xiangtianyancao N. suaveolens 野生种 Wild tobacco 澳大利亚 Australia
17 永定 400 Yongding 400 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
18 蒲优 1号 Puyou 1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
19 大仑种 Dalunzhong N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
20 西坡柳叶 Xipoliuye N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
21 密叶尖 Miyejian N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
22 金烟 6号 Jinyan 6 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
23 78-20 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
24 4-4 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
25 岩烟 97 Yanyan 97 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
26 C2 N.tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
27 中烟 100 Zhongyan 100 N.tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国青岛 Qingdao, China
28 云烟 4号 Yunyan 4 N.tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国云南 Yunnan, China
29 云烟 2号 Yunyan 2 N.tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国云南 Yunnan, China
30 中烟 90 Zhongyan 90 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国青岛 Qingdao, China
31 丰字 1号 Fengzi 1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国青岛 Qingdao, China
32 岩烟 89 Yanyan 89 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国云南 Yunnan, China
33 云烟 87 Ynyan 87 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国云南 Yunnan, China
34 云烟 85 Yunyan 85 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国云南 Yunnan, China
35 革新 3号 Gexin 3 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国青岛 Qingdao, China
36 沙县高杆 Shaxiangaogan N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
37 沙县中杆 Shaxianzhonggan N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
38 仙游晒红烟 Xianyoushaihongyan N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
39 龙岩晒烟 Longyanshaiyan N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
40 松香种 Songxiangzhong N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
41 永安晒烟 Yong’anshaiyan N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
42 沙县晒烟 Shaxianshaiyan N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国福建 Fujian, China
43 G140 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
44 金花 1号 Jinhua 1 N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国陕西 Shaanxi, China
45 Md10 N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 美国 America
46 督叶尖杆种 Duyejianganzhong N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国浙江 Zhejiang, China
1428 作 物 学 报 第 38卷

(续表 1)
编号
Code
材料名称
Name of accessions
种名
Specific name
类型
Type
来源
Origin
47 铁把子 Tiebazi N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 中国山东 Shandong, China
48 Ky14 N. tabacum 白肋烟 Burley tobacco 美国 America
49 白肋 21 Burley 21 N. tabacum 白肋烟 Burley tobacco 美国 America
50 Ky17 N. tabacum 白肋烟 Burley tobacco 美国 America
51 白肋 37 Burley 37 N. tabacum 白肋烟 Burley tobacco 美国 America
52 H423 N. tabacum 晾晒烟 Sun-cured tobacco 美国 America
53 Hiks 55 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 加拿大 Canada
54 Delhi 76 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 加拿大 Canada
55 K326 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
56 Nc 89 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
57 Nc 82 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
58 Nc 37NF N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
59 Nc 27NF N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
60 Mc 944 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
61 KE1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 津巴布韦 Zimbabwe
62 KE2 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 坦桑尼亚 Tanzania
63 WE12 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
64 Nc 2326 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
65 Val16 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
66 Delgold N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 加拿大 Canada
67 Va 432 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
68 浅波烟草 Qianboyancao N. repanda 野生种 Wild tobacco 墨西哥 Mexico
69 RG11 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
70 Nc55 N.tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
71 K346 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
72 G80 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
73 白花 G28 Baihua G28 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
74 Reams158 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
75 K358 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
76 TI245 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
77 黄花烟 Huanghuayan N. rustica 黄花烟 Rustica tobacco 南美 America
78 G70 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
79 K399 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
80 G28 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
81 Coker 319 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
82 Coker 139 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
83 Florida 301 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
84 南罗德西亚 Nanluodexiya N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
85 Coker176 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
86 Nc567 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 美国 America
87 革新 1号 Gexin 1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国青岛 Qingdao, China
88 乔庄多叶 Qiaozhuangduoye N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国河南 Hunan, China
89 哥西氏烟草 Gexishiyancao N. gossei 野生烟 Wild tobacco 澳大利亚 Australia
90 茂选 1号 Maoxuan 1 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国青岛 Qingdao, China
91 台烟 5号 Taiyan 5 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国台湾 Taiwan, China
92 台烟 6号 Taiyan 6 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国台湾 Taiwan, China
93 台烟 7号 Taiyan 7 N. tabacum 烤烟 Flue-cured tobacco 中国台湾 Taiwan, China
94 Basma Uovina N. tabacum 香料烟 Oriental tobacco 土耳其 Turkey
95 SamSum N. tabacum 香料烟 Oriental tobacco 土耳其 Turkey
96 黏烟草 Nianyancao N. glutinosa 野生种 Wild tobacco 秘鲁 Peru

第 8期 祁建民等: 应用 ISSR与 SRAP分析烟草种质资源遗传多样性及遗传演化关系 1429


2 结果与分析
2.1 ISSR与 SRAP标记的遗传多态性分析
在 90个 ISSR引物中共筛选出带型稳定、多态
性比较好的引物 18个(表 2), 对 96份种质进行 PCR
扩增, 所扩增条带的分子量一般都在 2 000 bp以内,
共扩增出 314 条谱带, 平均每个引物扩增 19 条, 最
多 25条(825), 最少 7条(818), 其中多态性条带 299
条, 多态性比率(PPB)为 95.2%。从 160对 SRAP引
物组合中共筛选出 16对引物组合(表 3), 基于 SRAP
标记所扩增的条带一般都在 1 500 bp 以内, 共扩增
出 255条谱带, 其中多态性条带 238条, 多态性比率
(PPB)为 93.3%。在检测烟草基因组遗传多态性上,
这些引物都表现出较显著的检出效率。从带型上看,
每条引物对普通烟草栽培品种的扩增都有共有的谱
带, 而对其他烟草种都能扩增出与普通烟栽培种相区
别的特异带型(图 1), 可以用于烟草遗传多样性分析。
2.2 基于 ISSR与 SRAP标记的烟草种质资源的
聚类分析
在 ISSR和 SRAP分子标记分析中, ISSR检测的
是 2 个 SSR 之间的一段短的 DNA 序列上的多态
性[27]。SRAP 检测的是基因的编码框(ORFs)区域的
多态性 [27], 表现的是特定基因内含子区域的不同 ,
为集中基因组 DNA 水平上更为全面的遗传多态性
信息, 本研究把 ISSR与 SRAP两种标记的多态性信
息合并后, 应用NTSYS软件对种质资源进行聚类分
析(图 2)。从聚类图上看, 当在遗传相似系数(GS)为
0.67 处作截值时, 91 份普通栽培烟草品种聚为同一
大类, 黄花烟、黏烟草、浅波烟草、哥西氏烟草、
香甜烟草作为单独的个类同 91份普通烟草栽培品种
完全区分开; 当遗传相似系数 GS为 0.848处再次作
截值时, 聚在同一大类的 91 份普通栽培品种, 又可
细分为一个大类群(I)和一个小类群(II), I、II类群又
由不同的进化层次上的若干个小亚类群组成。其中
I亚类群占供试普通烟草栽培品种总数的 69.2%, 说
明现有普通烟草栽培品种遗传基础较为狭窄, 大部
分烟草品种亲缘关系较近。
2.3 烟草种间及普通烟草种内的遗传分化分析
基于 ISSR、SRAP 标记分析的烟草亚属间的遗
传相似系数都表现较小, ISSR标记 GS在 0.28~0.58
之间, SRAP标记 GS在 0.36~0.55之间; 基于 2种标
记分析的烟草亚属间遗传分化系数 (Gst )分别为
0.8328 和 0.8319, 即烟草亚属间的遗传变异量占总

表 2 ISSR引物序号与序列
Table 2 ISSR primers used and their sequences
编号
Code of primer
引物序列
Sequence (5′–3′)
编号
Code of primer
引物序列
Sequence (5′–3′)
编号
Code of primer
引物序列
Sequence (5′–3′)
807 (AG)8T 826 (AC)8C 844 (CT)8RC
809 (AG)8G 830 (GT)8G 848 (CA)8RG
812 (GA)8A 834 (AG)8YT 855 (AC)8YT
815 (CT)8G 836 (AG)8YA 856 (AC)8YA
818 (CA)8G 841 (GA)8YC 866 (CTC)5
825 (AC)8T 843 (CT)8RA 873 (GACA)4
R=(A, G), Y=(C, T).

表 3 SRAP引物组合及序列
Table 3 SRAP primers used and their sequences
引物组合
Primer pair
引物序列
Sequence (5′–3′)
引物组合
Primer pair
引物序列
Sequence (5′–3′)
引物组合
Primer pair
引物序列
Sequence (5′–3′)
M1E4 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTTGA M2E7
TGAGTCCAAACCGG AGC
GACTGCGTACGAATT CAA M4E6
TGAGTCCAAACCGG ACC
GACTGCGTACGAATT GCA
M1E6 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATT GCA M2E8
TGAGTCCAAACCGG AGC
GACTGCGTACGAATTCA M6E10
TGAGTCCAAACCGG ACA
GACTGCGTACGAATTCAT
M1E7 TGAGTCCAAACCGG ATA GACTGCGTACGAATTCAA M18E2
TGAGTCCTT TCCGG TCC
TGAGTCCTT TCCGG TGC M8E8
TGAGTCCAAACCGG ACT
GACTGCGTACGAATTCA
M1E9 TGAGTCCAAACCGG ATA GACTGCGTACGAATT AG M18E7
TGAGTCCTT TCCGG TCC
GACTGCGTACGAATTCAA M7E8
TGAGTCCAAACCGG ACG
GACTGCGTACGAATT CA
M1E16 TGAGTCCAAACCGG ATA GACTGCGTACGAATT GTC M4E4
TGAGTCCAAACCGG ACC
GACTGCGTACGAATTTGA M10E6
TGAGTCCAAACCGGAAA
GACTGCGTACGAATTGCA
M2E1 TGAGTCCAAACCGG AGC GACTGCGTACGAATT AAT

1430 作 物 学 报 第 38卷



图 1 引物 836对 96份烟草材料的 ISSR扩增图谱
Fig. 1 ISSR landing patterns of 96 tobacco resources amplified with primer 836

遗传变异量的 83%。属于普通烟草栽培种的 91份栽
培品种间的遗传相似系数表现较大, ISSR 标记 GS
平均为 0.78, SRAP标记 GS平均为 0.795; 普通栽培
种内不同栽培类型间的遗传分化系数 Gst 较小, 基
于 ISSR、SRAP标记分析的类型间 Gst分别为 0.2794
和 0.5269, 基因流 Nm 分别为 1.2896 和 0.4490。以
上说明烟草属的遗传变异主要发生在亚属水平上 ,
而普通栽培种内不同栽培类型间存在着一定程度的
基因流。
2.4 不同类型烟草的遗传多样性及遗传演化分析
基于 ISSR、SRAP 复合分子标记的烤烟、晒晾
烟、白肋烟、香料烟和野生烟的遗传多样性指标(表
4), 烟草野生种的遗传多样性指数(H)最高, ISSR 与
SRAP 分别为 0.273、0.274, 等位基因数目(Ao)、有
效等位等位基因数(Ae)、多态性位点百分比(PPB)等
指标均表现最大; 烤烟的遗传多样性指数(H)表现次
之, 两种标记分别为 0.147 和 0.157, Ao、Ae、PPB
等指标均小于野生烟而大于其他栽培类型烟草; 香
料烟的遗传多样性指数(H)在两种标记中都表现为
最低, 分别表现为 0.042、0.024。因此, 烟草野生种
种间的遗传多样性的水平最高, 而普通栽培种内的
遗传多样性水平表现为烤烟>晒晾烟>白肋烟>香料
烟, 2种标记表现的趋势一致。
综合分析 2种分子标记显示(表 5), 烤烟和其他
类型烟草的遗传一致度分布在 0.677~0.985之间, 其
中与晒晾烟的遗传一致度最高, 2种标记均达到 0.90
以上, 说明烤烟和晒晾烟的遗传背景最为相似; 香
料烟和黄花烟间的遗传一致度最小, 说明香料烟和
黄花烟遗传差异最大。按照 UPGMA 法聚类(图 3)
可以看出, 6种类型烟草的遗传演化关系可分为 5个
进化层次, 在亚属分化水平上, 普通烟亚属(全部栽
培品种)和碧冬烟亚属(4 个供试烟草野生种)的亲缘
关系较近, 而与黄花烟亚属亲缘关系较远; 现有普
通栽培种不同栽培类型的进化关系表现为烤烟、晒
晾烟和香料烟较近, 聚为同一个小亚类中, 而与白
肋烟亲缘关系较远。以上结果表明烟草属亚属的遗传
分化及普通栽培种不同栽培类型间的遗传演化过程。
2.5 烟草普通栽培种国内外种质资源的遗传分
化与遗传多样性分析
在供试的 91份普通烟草栽培品种中, 来源于中
国各省份的烟草有 50份, 来源于美国、加拿大、津
巴布韦、坦桑尼亚、土耳其等国的烟草共计 41份。
利用 POPGENE 分析遗传分化系数(Gst)与基因流
(Nm), 基于 ISSR、SRAP 标记的国内外栽培烟草间
Gst分别为 0.037与 0.0246, 基因流(Nm)分别为 13.01
与 19.83, 因此, 我国烟草和国外烟草并没因为地理
关系而存在遗传分化现象, 国内外栽培烟草遗传背
景极其相似。基于 2 种标记的国内外栽培烟草的等
第 8期 祁建民等: 应用 ISSR与 SRAP分析烟草种质资源遗传多样性及遗传演化关系 1431




图 2 基于 ISSR与 SRAP的 96份烟草种质资源的分子聚类图
Fig. 2 Phylogenetic tree of 96 tobacco accessions based on ISSR and SRAP data

表 4 基于 ISSR、SRAP的不同烟草类型间的遗传多样性水平
Table 4 Genetic diversity among different tobacco types based on ISSR and SRAP analysis
等位基因数目(Ao)
Number of alleles
有效等位等位基因数(Ae)
Effective number of alleles
多态性位点比例(PPB)
Percentage of polymorphic loci
(%)
遗传多样性指数(H)
Genetic diversity
index
类型
Type
ISSR SRAP ISSR SRAP ISSR SRAP ISSR SRAP
野生烟 Wild tobacco 1.816 1.820 1.445 1.446 81.57 81.96 0.273 0.274
烤烟 Flue-cured tobacco 1.439 1.451 1.250 1.272 43.92 45.10 0.147 0.157
晾晒烟 Sun-cured tobacco 1.294 1.306 1.138 1.188 29.41 30.59 0.091 0.109
白肋烟 Burley tobacco 1.204 1.188 1.173 1.130 20.39 18.82 0.084 0.073
香料烟 Oriental tobacco 1.102 1.059 1.072 1.042 10.20 5.88 0.042 0.024

位基因数目(Ao)、有效等位等位基因数(Ae)、多态性
位点数比例(PPB)、遗传多样性指数(H)等指标(表 6)
也都非常相近。这些结果表明, 我国栽培烟草与国
外栽培烟草有共同血缘关系, 且多态性水平较一致,
说明我国烟草栽培品种的基因源多数与国外引进的
种质资源血缘有密切关系。
1432 作 物 学 报 第 38卷

表 5 基于 ISSR、SRAP烟草各类型间的遗传一致度和遗传距离
Table 5 Genetic identity and genetic distance among tobacco types based on ISSR and SRAP analysis
白肋烟 BT 晾晒烟 ST 香料烟 OT 黄花烟 RT 野生烟 WT 烤烟 FT 类型
Type ISSR SRAP ISSR SRAP ISSR SRAP ISSR SRAP ISSR SRAP ISSR SRAP
白肋烟 BT 0.962 0.800 0.920 0.724 0.640 0.584 0.740 0.719 0.966 0.819
晾晒烟 ST 0.038 0.223 0.919 0.885 0.657 0.680 0.770 0.761 0.983 0.985
香料烟 OT 0.083 0.322 0.085 0.122 0.653 0.613 0.730 0.651 0.945 0.912
黄花烟 RT 0.447 0.538 0.420 0.386 0.427 0.490 0.756 0.701 0.677 0.695
野生烟 WT 0.301 0.330 0.261 0.273 0.315 0.430 0.280 0.355 0.792 0.773
烤烟 FT 0.034 0.199 0.017 0.016 0.057 0.092 0.391 0.363 0.233 0.258
上三角为遗传一致度, 下三角为遗传距离。
Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) of different tobacco type. BT: burley tobacco; ST:
sun-cured tobacco; OT: oriental tobacco; RT: rustica tobacco; WT: wild tobacco; FT: flue-cured tobacco.



图 3 烟草不同类型间群遗传一致度 UPGMA聚类分析图
Fig. 3 Dendrogram of different tobacco types based on genetic
identity
3 讨论
3.1 ISSR与 SRAP分子标记间的比较
本研究结果显示, ISSR 和 SRAP 两种标记虽原
理不同, 但在烟草上分别基于 2 种标记分析的结果
较为相近, ISSR、SRAP 标记分析的 91 份普通栽培
品种的遗传相似系数分别为 0.78和 0.795, 且两者在
揭示不同类型、不同来源地烟草的遗传多样性水平
上也较接近, 用 Mantel-test 对 2 种标记检测的遗传
相似系数矩阵进行相关性检测, 结果存在着极显著
的相关(r=0.68, P=1.000)。相对而言, 基于 ISSR标记
检测的遗传多态性检出率略高于 SRAP 标记, 这可
能是烟草存在着大量微卫星变异所致。
3.2 烟草种间、不同栽培类型及不同来源地品种
间的遗传分化
供试的烟草种质资源隶属于烟草属的 6个不同
的种, 普通栽培种包含国内外的烤烟、晾晒烟、白
肋烟、香料烟等不同的栽培类型。因国内烟草野生
近缘种资源有限, 供试的黄花烟、黏烟草、浅波烟
草、哥西氏烟草、香甜烟草等烟草类型各仅有 1份。
从遗传分化系数Gst可知, 种间的遗传分化最大, 栽
培种内不同栽培类型间存在一定程度的遗传分化 ,
而国内外来源的栽培烟草遗传背景相似性较高。这
说明经过长时间的遗传演化, 烟草种间的遗传差异
已非常明显, 现有普通烟草栽培种与其近缘野生种
已产生了明显的遗传变异; 而不同栽培类型烟草品
种在基因组水平上没有明显的遗传分化, 主要因为
烤烟、晾晒烟、白肋烟、香料烟均为普通烟草, 其
烟叶品质因调制方法不同化学性质也不相同, 但在
基因组水平上的差异仍比较小, 更多的是烟草在特
定生态环境下基因表达和调控上的差异。我国现有
栽培烟草品种与国外栽培烟草之间并无明显本质上
的遗传分化, 这是因为世界烟草主产国的烟草育种
基本上是从美国早期育成的品种基础上发展起来的,
新品种都与其有血缘关系。这一结果与王元英等[28]
对现有主要育成品种的亲缘系谱分析一致, 他们发
现现有育成品种中直接或间接含有金星 6007、特字

表 6 基于 ISSR、SRAP的国内与国外烟草的遗传多样性水平
Table 6 Genetic diversity within different tobacco types based on ISSR and SRAP analysis
等位基因数目(Ao)
Number of alleles
有效等位等位基因数(Ae)
Effective number of alleles
多态性位点比例(PPB)
Percentage of polymorphic loci
(%)
遗传多样性指数(H)
Genetic diversity
index
来源
Origin
ISSR SRAP ISSR SRAP ISSR SRAP ISSR SRAP
中国 China 1.4078 1.4157 1.2291 1.2631 40.78 41.57 0.1368 0.1495
其他国家
Other countries
1.4039 1.4078 1.2328 1.2522 40.39 40.78 0.1355 0.1450

第 8期 祁建民等: 应用 ISSR与 SRAP分析烟草种质资源遗传多样性及遗传演化关系 1433


400、红花大金元血缘的品种占 84.33%, 而这些品种
都是在美国品种的基础上选育而成的。另一方面 ,
烟草是较为严格的自花授粉作物, 通过异交引入外
源基因的可能性相对较小。
3.3 烟草野生种有利基因发掘与栽培种的利用
创新
王元英等[28]对中美主要烟草品种亲缘关系分析
表明, 现有育成品种单一, 遗传基础狭窄已是世界
烟草育种面临的主要问题。基于 2 种标记的分析表
明, 烟草野生种的遗传多样性远大于其他栽培类型,
Bogani等[29]与 Ren等[30]的研究也证实了这一点。烟
草野生种中常具有栽培烟草所不具有的重要基因 ,
特别是在抗病、抗逆及特殊品质方面, 且其基因多
为显性, 易于遗传。因此克服种间远缘杂交的不育
性, 或通过有利基因的克隆与生物工程的方法, 可
实现有利基因从野生种向栽培种的转移, 对提高目
前栽培烟草品种的抗性与品质, 创造遗传基础更丰
富、具有特殊作用的烟草品种新类型有着广阔的应
用前景。
4 结论
96 份烟草资源的 2 种分子标记分析, 揭示出烟
属种间具有丰富的遗传多样性; 聚类结果可将普通
烟草、黄花烟、黏烟草、浅波烟草、哥西氏烟草、
香甜烟草区别开来; 普通烟草遗传相似性较高, 烤
烟和晒晾烟间的遗传进化关系最近, 香料烟和黄花
烟之间的亲缘关系较远; 普通烟草栽培种中国内外
来源的烟草品种亲缘关系极其相近, 遗传分化现象
甚微。

致谢：感谢福建龙岩烟草公司郭启彦等提供烟草种
质资源。
References
[1] Coussirat J C. Genetic diversity and varietal identification in the
species Nicotiana tabacum by RAPD markers. Annaesddll Ta-
bacum, 1994, 26: 1–7
[2] Xu M-H(许明辉), Zheng M-H(郑民慧), Liu Y-Z(刘彦中). Ge-
netic diversity and identification in varieties of Nicotiana to-
bacum by RAPD marker. Seed (种子), 1998, (5): 23–25 (in Chi-
nese with English abstract)
[3] Yang Y-C(杨友才), Yu S-H(余硕辉), Yin H-Q(尹晗琪). Studies
on genetic diversity of 48 tobacco varieties by RAPD analysis.
Subtrop Plant Sci (亚热带植物科学), 2008, 37(3): 10–14 (in
Chinese with English abstract)
[4] Guo J-P(郭金平), Zhu H-L(朱惠丽), Zhou Y-F(周以飞), Pan
D-R(潘大仁), Chen S-H(陈顺辉), Wu S-X(巫升鑫). Genetic di-
versity and genetic relationship analysis of some flue-cured to-
bacco germplasms based on RAPD. Chin Tob Sci (中国烟草科
学), 2009, 30(suppl): 15–18 (in Chinese with English abstract)
[5] Qi J-M(祁建民), Wang T(王涛), Chen S-H(陈顺辉), Zhou
D-X(周东新), Fang P-P(方平平), Tao A-F(陶爱芬), Liang
J-X(梁景霞), Wu W-R(吴为人). Genetic diversity and genetic
relative analysis of tobacco germplasm based on inter-simple se-
quence repeat (ISSR). Acta Agron Sin (作物学报), 2006, 32(3):
373–378 (in Chinese with English abstract)
[6] Xiao B-G(肖炳光), Yang B-C(杨本超). Assessment of genetic
diversity among tobacco germplasms by ISSR markers. Sci Agric
Sin (中国农业科学), 2007, 40(10): 2153–2161 (in Chinese with
English abstract)
[7] Fu B(傅冰), Liu D-Q(刘迪秋), Li W-Z(李文正), Chen L-M(陈丽
梅), Li K-Z(李昆志). Genetic diversity analysis of 25 tobacco
germplasm resources by ISSR molecular marker. J Anhui Agric
Sci (安徽农业科学), 2008, 36(3): 898–901 (in Chinese with
English abstract)
[8] Liang J-X(梁景霞), Qi J-M(祁建民), Fang P-P(方平平), Wang
T(王涛), Chen S-H(陈顺辉), Zhou D-X(周东新), Tao A-F(陶爱
芬), Liang K-J(梁康迳), Wu W-R(吴为人). Genetic diversity and
genetic relative analysis of tobacco germplasm based on in-
ter-simple sequence repeat (ISSR). Sci Agric Sin (中国农业科学),
2008, 41(1): 286–294 (in Chinese with English abstract)
[9] Ren N, Timko M P. AFLP analysis of genetic polymorphism and
evolutionary relationships among cultivated and wild Nicotiana
species. Genome, 2001, 44: 559–571
[10] Yang Y-C(杨友才), Zhou Q-M(周清明), Yin H-Q(尹晗琪), Zhu
L-S(朱列书). Studies on genetic diversity and relationship in to-
bacco germplasms by AFLP analysis. Sci Agric Sin (中国农业科
学), 2006, 39(11): 2194–2199 (in Chinese with English abstract)
[11] Li F-X(李凤霞 ), Wang W-F(王卫锋 ), Wang L(王鲁 ), Cui
M-M(崔萌萌), Sun Y-H(孙玉合). Fluorescent AFLP analysis of
genetic diversity and evolutionary relatives of Nicotiana genus.
Sci Agric Sin (中国农业科学), 2010, 43(12): 2418–2427 (in
Chinese with English abstract)
[12] Liu J-F(刘建丰), Wang Z-D(王志德), Liu Y-H(刘艳华), Mou
J-M(牟建民). Application of SRAP on analysis of genetic diver-
sity in tobacco germplasms. Chin Tob Sci (中国烟草科学), 2007,
28(5): 49–53 (in Chinese with English abstract)
[13] Liu Y-H(刘艳华), Wang Z-D(王志德), Mou J-M(牟建民), Liu
J-F(刘建丰), Dai P-G(戴培刚). Genetic diversity analysis on
different tobacco populations. Chin Tob Sci (中国烟草科学),
2009, 30(suppl): 19–24 (in Chinese with English abstract)
[14] Ye L-Q(叶兰钦), Xin M-M(辛明明), Du J-K(杜金昆), Xie
C-J(解超杰), Li Y-P(李永平), Zhou Q-M(周清明). Genetic di-
versity revealed by SSR markers of the tobacco cultivars. Chin
Agric Sci Bull (中国农学通报), 2009, 25(1): 56–62 (in Chinese
with English abstract)
[15] Liu S-C(刘胜传), Liu R-X(刘仁祥), Lei H-M(雷红梅), Chen
C-Y(陈春艳). Genetic diversity of some tobacco germplasms by
1434 作 物 学 报 第 38卷

using SSR technique. Guizhou Agric Sci (贵州农业科学), 2009,
37(7): 1–3 (in Chinese with English abstract)
[16] Yang Y-C(杨友才), Zhou Q-M(周清明), Yin H-Q(尹晗琪).
Analysis of genetic diversity in tobacco germplasm by RAPDs
and AFLPs. J Agric Biotechnol (农业生物技术学报), 2006,
14(4): 585–593 (in Chinese with English abstract)
[17] Tao A-F(陶爱芬), Liu Z-H(刘中华), Qi J-M(祁建民), Zhou
D-X(周东新), Wang T(王涛), Chen S-H(陈顺辉). Comparison
and analysis of IRAP and ISSR molecular methods used for as-
sessment of genetic diversity in tobacco. J Wuhan Bot Res (武汉
植物学研究), 2009, 27(6): 589–594 (in Chinese with English ab-
stract)
[18] Nie Q(聂琼), Liu R-X(刘仁祥). Genetic diversity of 23tobacco
germplasm resources by SSR and ISSR analyze. Southwest China
J Agric Sci (西南农业学报), 24(1): 15–19 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[19] Liang J-X(梁景霞), Qi J-M(祁建民), Wu W-R(吴为人), Zhou
D-X(周东新), Chen S-H(陈顺辉), Wang T(王涛), Tao A-F(陶爱
芬). DNA extraction and establishment of SRAP reaction system
in tobacco. Acta Tab Sin (中国烟草学报), 2005, 11(4): 33–38 (in
Chinese with English abstract)
[20] Nei M, Li W H. Mathematical model for studying genetic varia-
tion in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci
USA, 1979, 76: 5269–5273
[21] Miller M P. Tools for Population Genetic Analysis (TFPGA),
version 1.3. Northern Arizona University, Flagstaff, 1997
[22] Mantel N. The detection of disease clustering and a generalized
regression approach. Cancer Res, 1967, 27: 209–220
[23] Yeh F C, Yang R C, Boyle T, Ye Z H, Mao J. XPOPGENE, the
user friendly shareware for population genetic analysis. Molecular
Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Ed-
monton, Canada, 1997
[24] Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations.
Proc Natl Acad Sci USA, 1973, 70: 3321–3323
[25] Nei M. Genetic distance between populations. Am Nat, 1972, 106:
283–292
[26] Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D. Genome fingerprinting by
simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reac-
tion amplification. Genomics, 1994, 20: 176–183
[27] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism
(SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction:
its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor
Appl Genet, 2001, 103: 455–461
[28] Wang Y-Y(王元英), Zhou J(周健). Main tobacco assortment
blood reasons of China and the United States analysis and to-
bacco breeding. Acta Tab Sin (中国烟草学报), 1995, (2): 11–22
(in Chinese with English abstract)
[29] Bogani P, Lio P, Intrieri M C, Buiatti M. A physiological and mo-
lecular analysis of the genus Nicotiana. Mol Phylogenet Evol,
1997, 7: 62–70
[30] Ren N, Timko M P. AFLP analysis of genetic polymorphism and
evolutionary relationships among cultivated and wild Nicotiana
species. Genome, 2001, 44: 559–571