全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(5): 743−747 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2006AA10A213和 2007AA091601）；中国科学院知识创新工程重要方向项目（KSCX2-YW-
N-007）
作者简介: 尹恒（1982–），在读博士，专业方向：糖生物学和分子生物学。
*
通讯作者(Corresponding author): 杜昱光。Tel: 0411-84379061; E-mail: dyguang@gmail.com
Received(收稿日期): 2007-11-08; Accepted(接受日期): 2007-12-21.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00743
受壳寡糖诱导的油菜MAPK基因的克隆与分析
尹 恒1,2 杨金丽1,2 李曙光1 赵小明1 白雪芳1 马小军1 杜昱光1,*
(1中国科学院大连化学物理研究所生物技术部, 辽宁大连 116023; 2 中国科学院研究生院, 北京 100049)
摘 要: 利用油菜 cDNA芯片差异显示得到一个可被壳寡糖诱导的, 与已知植物丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)同源性
高达 94%的 cDNA片段, 利用 cDNA末端快速扩增(RACE)的方法得到了该片段全长, 与拟南芥中 AtMPK4具有高同
源性, 故将其命名为 BnMPK4 登录到 NCBI GenBank(DQ206628)。用生物信息学方法分析, 该基因属于植物 MAPK
的 B家族, 具有植物MAPK典型的 TXY保守区域, 在 C端也含有一个在 B家族中保守的 CD区。利用半定量 RT-PCR
检测发现 BnMPK4在叶片中表达且可被茉莉酸(JA)和壳寡糖诱导, 但对水杨酸(SA)和脱落酸(ABA)响应不明显。推测
该基因在壳寡糖诱抗信号转导和 JA/ET信号通路中起关键作用。
关键词: 壳寡糖; 油菜; BnMPK4; JA/ET信号通路
Cloning and Analysis of BnMPK4, A Novel MAP Kinase Gene Induced by
Oligochitosan in Brassica napus
YIN Heng 1,2, YANG Jin-Li1,2, LI Shu-Guang1, ZHAO Xiao-Ming1, BAI Xue-Fang1, MA Xiao-Jun1, and
DU Yu-Guang1,*
(1 Biotechnology Department, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning; 2 Graduate University of
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China)
Abstract: Oligochitosan prepared by enzymatic hydrolysis of chitosan is a potential plant defense elicitor, but how the oligochi-
tosan induces the resistance of plants to pathogens is still unclear. So we try to explore the signal transduction pathways of oli-
gochitosan inducing defense. We isolated a new cDNA coding for mitogen-activated protein kinase (MAPK), designated BnMPK4
(GenBank: DQ206628), from oilseed (Brassica napus L.) based on our former microarray data. BnMPK4 encodes a
373-amino-acid protein with high sequence similarity to previously reported plant MAPK genes such as AtMPK4 and belongs to
the B subgroup of plant MAPK. Bioinformatic analysis showed BnMPK4 contains one phosphorylation motif (TEY) and a con-
served CD domain in its C-terminal extension. By using Semi-Quantitative RT-PCR technique we found that BnMPK4 had a con-
stitutive expression in seedling leaves and was further up-regulated by treatment with plant hormone jasmonic acid (JA) and fun-
gal elicitor oligochitosan but did not respond to salicylic acid (SA) and abscisic acid (ABA). These results suggest a role for
BnMPK4 in oligochitosan-induced and JA/ET-regulated defense signalling pathway.
Keywords: Oligochitosan; Brassica napus L.; BnMPK4; JA/ET signaling pathway
20世纪 60年代以来, 寡糖素被作为一种植物诱
抗剂应用于农业生产中, 围绕其展开的研究也是当
前植物保护领域的一个研究热点[1]。壳寡糖是使用
最广的寡糖素之一, 它由几丁质脱乙酰基后, 酸解
或酶解而得, 在植物病害防治上具有抑制病原菌侵
染、诱导植保素生成、激发植物自身抗性等作用[2-3]。
本实验室应用酶解反应膜分离耦合技术制备得到壳
寡糖[4], 其聚合度为 2~10, 对植物病害的控制有明
显的效果[5]。油菜是我国重要的油料经济作物, 但菌
核病严重影响其产量和品质 [6], 我们生产的壳寡糖
农药已被应用于油菜菌核病的防治工作中, 有一定
的效果, 但机理尚不明了, 影响了其更广泛的应用,
744 作 物 学 报 第 34卷

故本实验室着力于阐明壳寡糖在油菜中的诱抗机
理。初期工作中, 我们利用油菜cDNA芯片筛选出油
菜中 393 个壳寡糖应答基因片段[7], 对这些基因进
行功能注释、宏观分析, 并挑选出一些功能重要者
进行后续研究 , 其中一个片段与拟南芥中AtMPK4
基因具有高同源性。而AtMPK4是拟南芥中抗性信号
转导重要元件 [8-9], 可正调控茉莉酸(JA)信号通路 ,
负调控水杨酸(SA)信号通路, 所以本实验室对此基
因片段进行了深入研究, 希望能对壳寡糖在油菜中
的抗性信号转导途径增进了解。本文利用RACE技术
克隆得到此基因全长 , 命名为BnMPK4 (GenBank
登录号为 DQ206628), 用相关生物信息学手段进行
了分析, 还考察了BnMPK4 在壳寡糖和 3 种植物激
素处理后不同时间点的表达水平变化, 为进一步研
究其功能奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物 甘蓝型油菜沪油 15(Brassica napus
L.)温室中培养至 4~6片叶期。
1.1.2 药剂 壳寡糖(Oligochitosan、COS), 脱乙
酰度>95%, 聚合度为 2~10, 由中科院大连化物所
1805组研制, 配制成 50 μg mL−1使用(田间及温室试
验证明此浓度有最佳诱抗效果); 茉莉酸(JA)、水杨
酸(SA)和脱落酸(ABA)购自Sigma公司。
1.1.3 分子克隆试剂 RNAiso、rTaq酶、LA Taq
酶、PMD18-T载体、RNA PCR KIT(AMV) Ver.3.0
试剂盒和 5′-Full RACE Kit扩增试剂盒; 均购自宝生
物工程(大连)有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA提取及检测 油菜品种沪油 15 于温
室中培养至幼苗为 4~6片叶时取材, 叶面喷施 50 μg
mL−1壳寡糖溶液, 对照叶面喷施ddH2O。取材叶片在
液氮中研磨, 用RNAiso (TaKaRa)试剂提取RNA。(1)
用分光光度法定量测定 260 nm和 280 nm处的吸光
值 , 计算A260/A280的值以估计总RNA的纯度。通过
A260的值计算总RNA的量。(2)在 1%琼脂糖凝胶上分
离总RNA, 有两条清晰的带 , 且大相对分子质量
(28S rRNA)的亮度近似为小相对分子质量 (18S
rRNA)的亮度的 2倍, 说明总RNA完整。
1.2.2 基因全长获取 依据油菜 cDNA芯片差异
显示得到的一个可被壳寡糖诱导, 与 AtMPK4 同源
性高达 94%的 cDNA片段。设计引物以获得其全长。
首先设计引物 1(表 1)与 RNA PCR KIT(AMV) Ver
3.0 试剂盒自带引物 M13 Primer M4, 利用 TaKaRa
的 LA Taq酶进行 PCR, 得到了此片段的 3端。琼脂
糖凝胶检测后, 进行胶回收, 回收产物连接到 PMD
18-T 载体(TaKaRa)上。将连接产物转化大肠杆菌
Top10, 经蓝白斑筛选, PCR 鉴定后, 测序得到了此
cDNA片段的 3端序列。cDNA 5末端快速扩增按照
TaKaRa公司的 5-Full RACE Kit扩增试剂盒说明书
进行, 依据已知序列设计的 5端磷酸化修饰的 RT引
物 2和特异引物对 3和引物对 4 (表 1), 第二轮扩增
产物电泳检测纯化后连接到 PMD18-T载体上, 转化
大肠杆菌 Top10, 蓝白斑筛选及 PCR 鉴定后, 测序
获得 5端序列。由得到的 5′、3′端序列, 设计引物对
5(表 1)利用 TaKaRa的 LA Taq酶进行 PCR (95℃变
性 5 min; 92℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 2 min为一个
反应循环, 重复 30次; 72℃延伸 10 min), 同上胶回
收、转化质粒、PCR 验证后, 由上海生工生物工程
公司测序, 结合 5′、3′端序列信息得到了此 cDNA
全长。

表 1 引物列表
Table 1 The primers used in the experiments
编号
Code
引物类别
Primer type
引物序列
Sequence (5′–3′)
1 3 RACE上游引物 CGGCTTAGGCTTATCACTG
2 5 RACE RT引物 P-ACAACGCCTCAT

3 5 RACE 特异引物对 1 TATCTGGTCCGTCGGTTGGC ATGGCAAGCCCGAAATCCG

4 5 RACE 特异引物对 2 CAGCCGATTTGCTTGAGA AGGGTTGGTTAGAGCGTATC

5 基因 cDNA全长特异引物对 GTGCGTCTTGGTTTCCGAT ACTCTCCCTTACTGAGGATTGAACT

6 RT-PCR特异引物对 GCGTCTTGGTTTCCGATTC GCGGGTTGGTTAGAGCGTAT

7 油菜 Actin基因引物对 GTGACAATGGAACTGGAATGG ACGGAGGATAGCGTGAGGAA

第 5期 尹 恒等: 受壳寡糖诱导的油菜 MAPK基因的克隆与分析 745


1.2.3 生物信息学分析 将克隆得到的序列登录
到 GenBank (DQ206628), 利用 NCBI Blast进行序列
比对 , 用 Clustal X 程序进行进化树分析 , 利用
Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/
plantcare/html/)进行启动子分析 , 用 ExPASy 的
ProtParam 工具预测其编码蛋白质的等电点及相对
分子质量。
1.2.4 壳寡糖等诱导不同时间基因表达谱 油菜
品种沪油 15于温室中培养至幼苗为 4~6片叶时, 叶
面喷施 50 μg mL−1壳寡糖, 对照植株叶面喷施双蒸
水, 在一周内多个时间点分别取材。同上提取RNA
并定量, 设计引物对 6(表 1), 利用TaKaRa的rTaq酶
进行PCR扩增, 1%琼脂糖电泳检测; 以油菜Actin基
因作为内标。
2 结果与分析
2.1 BnMPK4基因序列与分析
RACE得到的基因全长如图 1所示。



图 1 油菜 BnMPK4基因 cDNA及其编码的氨基酸全长序列
Fig. 1 cDNA and predicted amino acid sequences of
BnMPK4 gene

克隆得到的 BnMPK4基因全长 1 344 bp, 编码
373个氨基酸, 利用 ProtParam预测其等电点 pI 5.63,
相对分子质量为 42 kD, 图 1 中粗体部分为 MAPK
基因保守区域, 斜体部分为 B类MAPK C端保守区,
启动子 TATA-box和 CAAT-box元件用下划线标出。
利用 Blast 比较发现 BnMPK4 全长与植物中多个
MAPK 基因具有高同源性, 其中与 AtMPK4 同源性
最高为 94%, 利用 Clustal X程序将 BnMPK4与已知
的部分植物 MAPK 基因进行进化树分析, 结果如图
2所示。



图 2 BnMPK4基因及其在植物种间同源序列的进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of BnMPK4 and other plant MAPK
genes

2.2 壳寡糖诱导 BnMPK4 mRNA水平变化
检测了 50 μg mL−1壳寡糖处理油菜后一周内
BnMPK4 转录水平变化, 利用Image J软件计算电泳
条带平均灰度, 结合条带面积, 将其转化为总光密
度(OD)后, 根据MPK4 和Actin的总光密度值的比值
对RT结果进行量化, 发现在 15 min时MPK4 基因表
达水平就诱导提高, 30 min时达到最高值(图 3)。



图 3 壳寡糖处理后 BnMPK4 mRNA水平变化
Fig. 3 BnMPK4 mRNA expression with oligochitosan
treatment
Ratio of RT: OD of BnMPK4/OD of BnActin.

2.3 三种植物激素诱导 BnMPK4 mRNA 水平变
化
考察了 JA、SA和 ABA这 3种植物激素处理后
BnMPK4的转录水平变化, 利用 Image J软件计算电
泳条带平均灰度, 结合条带面积, 将其转化为总光
746 作 物 学 报 第 34卷

密度(OD)后, 根据MPK4和 Actin的总光密度值的比
值对 RT结果进行量化, 电泳图和量化图见图 4。



图 4 JA、SA和 ABA处理后 BnMPK4 mRNA水平变化
Fig. 4 BnMPK4 mRNA expression with plant hormones ABA,
SA, and JA treatment
Ratio of RT: OD of BnMPK4/ OD of BnActin.
3 讨论
MAPK级联途径在植物的多种生理发育和抗逆
条件中起着重要作用[10-11], 从 20世纪 90年代起, 对
植物中MAPK途径的研究成为植物学中的一个热
点。Petersen等报道MPK4基因在拟南芥抗性信号传
导中起重要作用, 它可通过抑制EDS1 和PAD4,从而
负调控SA信号通路 ,正调控 JA/ET信号通 路
[8,12]。启动子分析说明在BnMPK4基因 5区含有转录
核心元件TATA-box和上游启动子元件CAAT-box, 3
区含有Poly-A尾, 说明该序列的完整性。进化树分析
显示该基因属于植物MAPK中的B家族 [13], 具有典
型的TEY保守区域, 且在C端也含有一个B家族中保
守的CD区(图 1), 这个CD区可以作为MAPKK、磷酸
酶和底物蛋白的停泊位点。BnMPK4 与ATMPK4、
ATMPK11、ATMPK12 等基因同源性较高 , 除了
ATMPK4 功能已经明了以外, 其他基因也被认为参
与了病原菌侵蚀和环境胁迫后植物响应[14], 所以推
测与AtMPK4 具有高同源性的BnMPK4 也参与了植
物抗病与逆境胁迫响应。
壳寡糖已经被证明是一种高效的植物诱抗剂 ,
本实验室利用差异显示技术 , 在枯斑三生烟草
(Nicotiana tabacum var. samsun NN)中发现了一个被
壳寡糖诱导的MAPK基因(Oipk, GenBank登录号为
AY319760), 并构建了其反义抑制转基因植株 , 且
该转基因植株抗病性和产生诱抗能力均减弱, 说明
壳寡糖可能通过激活MAPK级联途径从而激发植物
自身抗病性 [15], 本试验结果侧面证明了此推断, 且
RT-PCR结果显示BnMPK4的转录水平在壳寡糖诱导
短时间内即大幅上调, 说明油菜中MAPK信号途径
对壳寡糖的响应是很迅速的。文献报道另一种寡糖
素几丁寡糖在拟南芥和水稻中均可诱导MAPK基因
的表达水平升高 [16-17], 揭示MAPK参与寡糖素对植
物的诱抗是一种共性。
JA、SA和ABA等植物激素也参与植物抗病、抗
逆过程[18]。经过这三种植物激素处理后, BnMPK4的
转录水平变化各不相同, SA、ABA对其影响不大; 而
与壳寡糖类似 , JA也可以在较短时间内诱导
BnMPK4 mRNA表达水平升高 , 说明BnMPK4 与
AtMPK4 在拟南芥中的作用有相似处, 可能是油菜
JA/ET途径中的重要元件。我们实验室发现壳寡糖可
以诱导一系列JA/ET途径相关基因的mRNA水平的提
高[7], 也利用高效液相色谱-电化学(库仑电极)阵列检
测技术检测到壳寡糖可以诱导植物中JA含量升高[19],
故推测壳寡糖可能通过激活JA/ET途径诱导油菜抗性,
这也是与前人文献报道相吻合的[20-21]。
4 结论
利用 RACE 技术首次在油菜中克隆得到与
ATMPK4 同源性很高的 BnMPK4 基因, 推测壳寡糖
可能通过激活 JA/ET途径诱导油菜抗性, BnMPK4基
因在此过程中起关键作用。

致谢：本实验部分工作在上海复旦大学医学院基因
中心完成, 感谢该中心顾建新教授、杨延中博士等
在实验准备等方面的大力支持。
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