全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(4): 602−607 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A109)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 喻树迅, E-mail: YU@cricaas.com.cn; Tel: 0372-2562201
第一作者联系方式: E-mail: east_skey319@sina.com; Tel: 0372-2525365 ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2008-09-01; Accepted(接受日期): 2008-12-13.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00602
中棉所 36均一化全长 cDNA文库的构建与鉴定
吴 东 刘俊杰** 喻树迅* 范术丽 宋美珍
中国农业科学院棉花研究所 / 农业部棉花遗传改良重点实验室, 河南安阳 455000
摘 要: 以短季棉中棉所 36 (CCRI36)顶端分生组织和花蕾为材料, 以 DSN (duplex-specific nuclease)均一化技术与
SMART(switching mechanism at 5′ end of RNA transcript)建库技术相结合, 构建 CCRI 36花发育期均一化全长 cDNA
文库。经检测原始文库滴度为 1.7×106 cfu mL−1。随机挑取 100个克隆, 利用 PCR方法测得文库重组率达 100%, 插
入片段平均长度为 1.2 kb。以两个高丰度表达基因 Histon3和 UBQ7为探针, 进行虚拟 Northern blot检测显示, 其丰
度在均一化 cDNA中均明显降低, 说明均一化效果显著, 为节约筛库成本和 EST有效测序奠定了基础; 同时, 利用常
规 PCR 扩增技术从 cDNA 文库中筛选阳性信号, 获得了花发育相关蛋白基因。初步证实 CCRI36花发育期均一化全
长 cDNA文库构建成功, 为深入研究棉花花发育机理及发掘与早熟相关的功能基因奠定了基础。
关键词: 花发育; 均一化; cDNA文库
Establishment and Identification of a Normalized Full-Length cDNA Library of
CCRI 36
WU Dong, LIU Jun-Jie**, YU Shu-Xun*, FAN Shu-Li, and SONG Mei-Zhen
Cotton Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton Genetic Improvement, Ministry of Agriculture,
Anyang 455000, China
Abstract: Short season cotton (SSC) breeding plays an important role in solving the competition for more growing area between
cotton and food crops. To explore the premature mechanism of SSC, to clone genes that have a close relation with premature
flowering, and to speed process of premature cultivar breeding, we established a normalized full-length cDNA library using the
flower and bud of CCRI 36 by DSN (duplex-specific nuclease)-normalization method combined with SMART (switching mecha-
nism at 5 end of RNA transcript) technique. The titer of un-amplified cDNA library was about 1.7×106 cfu mL−1. The average size
of cDNA inserts was 1 200 bp with a recombination rate of 100%. The abundance of transcripts Histon3 and UBQ7 decreased
obviously in normalized cDNA library comparing with that in non-normalized samples detected by Virtual Northern Blot. Mean-
while, protein genes associated with flower development were obtained on the basis of the positive signal of cDNA library by
PCR. These results indicated that the normalized full-length cDNA library has been established successfully, which is convenient
for further study on the molecular mechanism and gene cloning of flower development.
Keywords: Flower development; Normalization; cDNA library
棉花是我国重要的经济作物和纺织工业的重要
原料。由于我国人多地少, 粮棉争地的矛盾非常突
出。短季棉品种由于生育期短、开花结铃集中、简
化管理的优点, 在麦棉两熟或多熟制栽培体系中发
挥着重要作用[1]。在植物的生活周期中, 最明显的变
化是营养生长到生殖生长的转变, 转折点是花芽分
化。从花芽分化开始, 除一般的生理生化代谢外, 核
酸代谢至关重要, 即 RNA 和 DNA 含量的积累是花
器官发育的必要条件, 这已在苍耳[2]、牵牛[3]、苹果[4]、
葡萄[5]等植物中得到证实。李丽等[6]认为, 在花芽诱
导过程中, 不仅需要有较多的 RNA 和较少的 DNA,
而且还需要较高的 RNA/DNA。近年来, 已从几种模
式植物, 如拟南芥[7-8]、金鱼草[9]、烟草[10]等分离克
隆了大量与植物开花有关的调控基因。并建立起在
花器官发育中同源异型基因作用的 ABC模型[11-12]。
全长 cDNA 是功能基因组学和比较基因组学研
第 4期 吴 东等: 中棉所 36均一化全长 cDNA文库的构建与鉴定 603


究的基础[13], 而用适当的方法筛选全长 cDNA文库,
己成为从真核生物细胞中高效获得全长 cDNA 的有
效途径。目前, 棉花在分子生物学水平上的研究还
远远滞后于水稻、玉米等作物, 因此要克隆棉花中
一些重要基因, 最好的途径是构建代表特定时期全
部细胞表达信息的 cDNA 文库, 并从中筛选相关基
因的阳性克隆。Pear 等[14]构建了陆地棉纤维(Acala
SJ-2)的 cDNA 文库, 对棉花的 celA 基因进行了研
究。Li 等[15]构建了陆地棉 Coker312 纤维的 cDNA
文库, 并从中得到全长 GhTUB1 cDNA。近年来, 已
构建的棉花 cDNA 文库也多与棉花纤维发育时期有
关[16-17], 用于筛选与棉花纤维品质相关基因, Ji等[18]
利用 subtractive PCR和 cDNA array分离并且分析了
陆地棉徐州 142 纤维发育早期表达的基因。而棉花
其他组织器官的 cDNA文库构建相对较少。
Clontech(美国)公司推出的 SMART技术[19]是目
前应用最广泛的构建全长文库的方法之一。而高丰
度的基因给 cDNA 文库的筛选造成了大量的重复性
工作和资源浪费, 尤其不适应 EST(序列表达标签)
测序。为了解决这个问题, 开发了 cDNA 文库的均
一化技术, 它降低了高丰度基因的拷贝数, 使不同
丰度的基因的拷贝数趋于一致[20], 大大有利于目的基
因的筛选和高通量的 EST测序。DSN (duplex-specific
enzyme)是近年来发现的一种热稳定核酸酶[21]。该酶
能够选择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的
DNA, 对单链核酸分子几乎没有作用。DSN 特异降
解双链 DNA, 不需要以往复性式均一化过程中靠物
理方法分离单双链 DNA的步骤。Zhulidov等[22]首次
利用 DSN原理成功构建了美国加州海兔(Aplysiaca-
lifornica)神经组织的均一化全长 cDNA 文库。但至
今国内外未见使用此方法构建高等植物全长均一化
cDNA 文库的报道。本研究构建的高质量的花发育
期均一化 cDNA 文库将为棉花花发育相关基因的分
离筛选、EST 测序和后续的基因组研究提供一个优
越的技术平台。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2006年 4月 25日于中国农业科学院棉花研究所
试验场地播种优良短季棉品种CCRI 36, 从 2片真叶
完全展开开始取顶端分生组织, 每隔 5 d取一次, 共
取 4 次; 从现蕾到开花当天, 挂牌, 取整个蕾, 每隔
5 d取一次, 共 6次。迅速投入液氮, 存于–80℃超低
温冰箱备用。
Creator SMART cDNA Library Construction Kit购
自 Clontech 公司(美国); TRIMMER-DIRECT cDNA
Normalization Kit 购自 EVROGEN(美国 ); Oligotex
mRNA Mini Kits, QIAquick PCR Purification Kit,
QIAquick Gel Extraction Kit均购自 QIAGEN(德国)。
1.2 总 RNA提取和 mRNA的分离纯化
取保存的样品 , 采用改良的 CTAB 法提取总
RNA, 并用紫外分光光度法测定总 RNA 的浓度和
纯度, 琼脂糖凝胶(1%)电泳观察。之后按照 Oligotex
mRNA Mini Kits (QIAGEN, cat. No. 70022)试剂盒说
明, 对提取的总 RNA进行 mRNA的分离纯化。以电
泳检测 mRNA的质量。
1.3 全长 cDNA的合成
取 1 μL mRNA作为模板, 参照 Creator SMART
cDNA Library Construction Kit说明书, 首先反转录
得到一链 cDNA, 然后用 LD-PCR (long-distance PCR)
对其扩增, 95℃ 7 s, 66℃ 20 s, 72℃ 4 min, 18个循
环。反应结束后, 取 5 μL的 PCR产物, 以 1.0%琼脂
糖凝胶电泳检测。
1.4 全长 cDNA的均一化
采 用 QIAquick PCR Purification Kit 纯 化
SMART扩增得到的 cDNA。经 NaAc (pH 4.8)和乙醇
沉淀后, 加水溶解, 将得到的 cDNA稀释成 100~150
ng μL−1。参照 TRIMMER-DIRECT cDNA Normali-
zation Kit说明, 先对 DSN进行梯度稀释处理, 取 3
μL cDNA, 加入 1 μL杂交缓冲液及 2滴矿物油, 在
98℃变性 2 min, 68℃杂交 5 h 后, 加 68℃预热的
DSN master buffer 5 μL, 再分别加经梯度稀释的
DSN处理液, 68℃保温 25 min, 以终止液(stop solu-
tion) 10 μL终止反应。
1.5 均一化后 cDNA的 2次扩增
取 1 μL上述反应的混合物作模板, 加 5 μL 10×
Advantage 2 PCR buffer, 50×dNTP mix 1 μL, Evro-
gen PCR primer M1 1.5 μL, 50×Advantage 2 Poly-
merase Mix 1 μL, 加水至 50 μL。95℃ 7 s, 66℃ 20 s,
72℃ 4 min, 7个循环, 同时用对照依次增加循环数
来确定其最佳循环数。完成第 1次 PCR扩增后, 取 5
μL PCR 产物, 以 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。选择最
佳均一化扩增产物 2 μL 加入上述组分(将 Evrogen
PCR primer M1换成 Evrogen PCR primer M2)进行 12
个循环的 2次扩增。取 5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 均一化全长 cDNA文库构建
取均一化cDNA, 经过蛋白酶K消化, Sfi I酶切,
通过Chroma SPIN-400分级分离, 除去小于400 bp的
604 作 物 学 报 第 35卷

片段 ; 处理后的 dscDNA在 16℃条件下与载体
pDNR-LIB过夜连接; 取2 μL连接产物, 电转化至50
μL高效感受态细胞DH10B, 在37℃、200 r min−1培养
1 h, 加入预冷LB培养基(含25%甘油), 即为全长均
一化cDNA原始文库, 以液氮速冻后, −80℃保存。
1.7 均一化效果检测
以2个代表高丰度表达的基因Histone3和UBQ7为
探针, 利用虚拟Northern blot (Virtual Northern blot)技
术分析cDNA均一化效果, 操作步骤同Northern blot,
只是转移到膜上的样品不是RNA, 而是dscDNA。
1.8 文库滴度和插入片段大小分析
从文库中取10 μL菌液用LB培养基分别稀释到
100、1 000和10 000倍。从中各取100 μL涂于含氯霉
素的LB平板, 培养12~16 h, 计算其克隆数。根据公
式T = N × D / V (T为滴度, N为平板上克隆数, D为稀
释倍数, V为涂板体积)计算文库滴度, 从而得出文库
的总容量。随机挑取100个克隆, 以PCR扩增插入片
段, 计算文库重组率及平均插入片段大小。同时, 随
即挑取cDNA克隆40 000个, 使用384孔板进行培养
和菌种保存。
1.9 棉花 MADS-box基因的筛选
根据已报道的棉花GhMADS3基因的核甘酸序
列 , 设计合成特异性引物 (由北京奥科合成 ) ,
GhMADS3上游 P1: 5′-AGGCATATGCTGGGAGAG
TC-3′; GhMADS3下游 P2: 5′-CTCTGCTGCTTCCTC
TCGTT-3′。
利用复制器将保存在384孔板里的初级文库克
隆进行复制、混合, 构建成96孔板的筛选库池, 分别
取1 μL混合液用作模板进行分级筛选。PCR程序为
94℃变性5 min; 94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min;
72℃延伸10 min。用1%TAE琼脂糖凝胶电泳检测,将
筛选信号定位到384原始文库的单克隆孔上 , 然后
直接从中吸取2 μL, 加到含有氯霉素的LB培养基中
进行培养扩增并送出测序, 即得其全长cDNA。将测
序所得的cDNA 序列在NCBI上进行同源序列比对
并加以分析。
2 结果与分析
2.1 总 RNA及 mRNA质量
提取的总 RNA经凝胶电泳检测, 观察到 18S和
28S 特征条带整齐清晰, 亮度比接近 1∶2, 说明基
本无 RNA 降解(图 1); 同时经紫外分光光度计测定,
OD260 / OD280≈2, OD260 /OD230≈1.82, 说明总 RNA的
质量较好。使用 Oligotex mRNA Mini Kit对 10份材
料的混合总RNA进行mRNA的分离和纯化, 经电泳
检测其大小为 500~3 000 bp, 表明 mRNA的质量和
纯度满足建库的要求。

图 1 总 RNA电泳检测结果
Fig. 1 Gel analysis of total RNA
M: 100 bp marker; 1~2: 顶端分生组织; 3~4: 蕾; 5: 花。
M: 100 bp marker; 1–2: apical meristem; 3–4: bud; 5: flower.

2.2 全长 cDNA的合成
反转录得到 cDNA 经 LD-PCR 扩增后, 电泳检
测显示 dscDNA为 500~3 000 bp, 与 mRNA的范围
相当,并且中间有若干较亮带代表高丰度基因(图 2)。
表明不同大小和丰度的 mRNA都得到了有效的反转
录及扩增。
2.3 均一化效果检测
经 DSN 处理和两次扩增后, dscDNA 中代表高
丰度基因的亮带消失 , 呈现一条均匀的弥散条带 ,
且其大小范围没有明显的变化, 表明高丰度基因的
丰度明显下降(图 2)。

图 2 均一化前后 cDNA琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of non-normalized and
normalized amplified SMART-prepared cDNA
1: 未均一化 cDNA; 2: 均一化后 cDNA; M: 100 bp DNA ladder。
1: normalized amplified cDNA; 2: non-normalized cDNA; M: 100
bp DNA ladder.
第 4期 吴 东等: 中棉所 36均一化全长 cDNA文库的构建与鉴定 605


以 2个代表高丰度表达的基因 Histone3和 UBQ7
(泛素蛋白)为探针, 将均一化 cDNA 和对照 cDNA 转
到膜上, 进行虚拟 Northern blot。结果显示与对照
cDNA 相比, 均一化 cDNA 中高丰度表达基因明显降
低。这反映均一化效果良好(图 3)。

图 3 虚拟 Northern blot结果
Fig. 3 Results of virtual Northern blot
1: 非均一化 cDNA; 2: 均一化 cDNA。
1: unnormalized cDNA; 2: normalized cDNA.
2.4 文库滴度和插入片段大小分析
经过计算, 原始文库滴度为1.7×106 cfu mL−1。
利用M13正反向引物进行PCR扩增, 得到中间的插
入片段, 进行琼脂糖凝胶电泳检测。部分检测结果
(图4)显示克隆插入片段大小均在500~3 000 bp之间,
去除载体后平均大小分别为1.2 kb, 文库重组率为
100%。

图 4 cDNA文库插入片段大小检测
Fig. 4 Average size of inserts of full-length cDNA library
M: 100 bp DNA ladder

2.5 棉花MADS-box的获得及序列分析
使用合成保守引物PCR扩增分级文库池的方法,

图5 GhMADS10编码区核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig. 5 GhMADS10 coding sequence and its deduced amino acid sequence

获得信号单克隆。这一方法快速简便, 避免了常规
PCR克隆技术的繁琐过程 , 最终得到该基因全长
cDNA, 命 名 为 GhMADS10 (GenBank 登 录 号 为
EU881510)包含完整编码区(图5), 再一次证实所建
文库的质量较高, 同时可以表明均一化之后使获得
目的基因的可能性大大增加。
由序列分析可知GhMADS10cDNA编码区为741
bp, 共编码246个氨基酸残基。将得到的序列与已发
表序列进行氨基酸序列的比对, 可以发现它与棉花
GhMADS3基因编码氨基酸序列的相似性达98%, 和
606 作 物 学 报 第 35卷

棉花GhMADS4基因编码氨基酸序列的相似性为95%,
并具有典型的MADS-box蛋白结构。
3 讨论
3.1 技术的优化
SMART 方法的优点就是可以使用非常少的
mRNA或总 RNA起始反转录得到大量的双链 cDNA,
但与此同时也带来另一问题, 即 PCR 对不同片段的
扩增效率不同, 因此, 如果 PCR 循环数过多可能会
导致某些基因的“丢失”, 本研究使用了0.5 μg的mRNA,
只用了19个循环就合成了足够量的双链 cDNA, 使文
库包含了细胞表达的绝大部分基因。另外还采用了
长距离高精度的 PCR系统, 极大地减少了重复 PCR
带来的片段缩短的问题, 保证片断大小的范围主要
在 0.5~3.0 kb之间。
3.2 文库的评价
cDNA 文库的构建是分子生物学研究的重要技
术 , 对新基因发现起着非常重要的作用。与经典
cDNA 文库相比, 全长 cDNA 文库则能提供完整的
mRNA 信息, 从而保证全长 cDNA 的克隆, 并直接
用于该基因的表达。
评价一个均一化全长 cDNA 文库的质量主要从
三方面进行: (1) 库容量。该文库的滴度为 1.7×106
cfu mL−1, 保证了文库的完整性与覆盖度[23]。(2) 文
库插入片段的大小。该文库插入片段的平均长度达
1 200 bp, 表明序列的完整性很高。(3) 均一化效果。
本研究引入管家基因, 通过虚拟 Northern blot 技术
比较均一化前后其丰度的变化来对均一化效果进行
检测, 更直观地表明文库均一化效果良好, 满足节
约筛选的要求。
本研究采用优良的均一化技术, 构建均一化全
长 cDNA文库, 具有以下几个方面的优点: (1) 克服
了基因转录水平上的差异给文库筛选和分析带来的
障碍。(2) 大大增加了克隆低丰度 mRNA 的机会。
(3) 可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位
杂交。(4) 作为优化的文库系统还可以用于大规模的
测序或芯片制作等研究, 节约实验成本。
4 结论
本研究构建了高质量的均一化cDNA文库 , 为
花发育相关基因的克隆和表达谱分析等后续研究提
供了一个良好的技术平台。
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