全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(10): 1759−1763 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由北京市重大项目“转基因育种平台”(D08070503010000)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 张晓东, E-mail: zhangxiaodong@baafs.net.cn; Tel: 010-51503800
Received(收稿日期): 2009-03-31; Accepted(接受日期): 2009-06-25.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01759
外源脱水应答转录因子 CBF4基因转化玉米的获得
杨东歌 1,2 杨凤萍 1 陈绪清 1 张立全 1 张晓东 1,*
1 北京市农林科学院农业生物技术研究中心, 北京 100097; 2 首都师范大学生命科学学院, 北京 100037
摘 要: 用 PCR 方法克隆了拟南芥脱水应答转录因子 CBF4 基因, 以逆境诱导表达基因 rd29A 的启动子为驱动, 构
建了逆境诱导表达载体 pBAC146。用基因枪转化法转化玉米优良自交系的幼胚和胚性愈伤组织, 轰击后的愈伤组织
经过筛选、分化和植株再生过程, 共获得 36棵转基因植株。经 PCR、PCR-Southern和 Southern检测表明, 外源目的
基因已成功整合到部分转基因玉米株系的基因组中。人工干旱处理下, 抗旱生理指标测定显示, 一个转基因株系的脯
氨酸含量和叶绿素含量比野生型对照提高一倍, 间接表明转基因株系的抗旱能力在某种程度上有所提高。
关键词: 玉米; 转基因; CBF4基因; 抗旱
Obtainment of Transformed Maize with Dehydration-Responsive Transcription
Factor CBF4 Gene
YANG Dong-Ge1,2, YANG Feng-Ping1, CHEN Xu-Qing1, ZHANG Li-Quan1, and ZHANG Xiao-Dong1,*
1 Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097, China; 2 College of Life
Sciences, Capital Normal University, Beijing 100037, China
Abstract: The expression vector of CBF4 gene cloned from Arabidopsis thaliana by PCR and driven with promoter of rd29A
gene, a preceding stress responsive gene, was constructed. Immature embryo and embryogenic callus of several excellent maize
inbred lines were transformed with biolistic bombardment. After in vitro culture steps of callus induction, resistance selection,
differentiation and plant regeneration, thirty six transgenic plants were obtained. PCR, PCR-Southern, and Southern blot analysis
indicated that successful integration of alien target gene into genome of transgenic maize lines was happened. Measurement of
drought physiological indexes under artificial drought treatment showed that either proline content or chlorophyll content of a
transgenic line increased over one time than that of its wild type, suggesting that the drought resistance ability of transgenic maize
might be improved to a certain extent.
Keywords: Maize; Transgenic; CBF4 gene; Drought resistance
玉米是世界上三大粮食作物之一, 也是重要的
饲料作物, 在世界农业生产中占有重要的地位。干
旱与水资源短缺已成为制约世界农业和社会发展的
重要因素 , 干旱是影响玉米产量的重要因素之一 ,
同时受温室效应的影响, 水资源短缺的问题将愈来
愈突出。我国是世界上第二大玉米生产国, 也是最
大的玉米消费国, 干旱也是限制我国玉米生产发展
和产量提高的第一要素[1]。因此, 国内外对玉米抗旱
育种的研究越来越重视, 然而由于玉米抗旱性状属
于数量性状, 采用传统育种方法获得优良抗旱品种
十分困难, 目前, 植物抗旱的分子机制研究越来越
深入, 大大促进了通过转基因手段改良植物干旱胁
迫耐受性的进程。
植物在非生物胁迫下主要表达两类基因, 编码
产物为直接保护植物免受环境胁迫的功能蛋白类基
因及调控基因表达和胁迫信号转导的调控基因, 第
一类基因包括 LEA蛋白基因、抗冻蛋白基因、脯氨
酸合成酶基因等; 另一类包括各种激酶和转录因子
等[2]。转录因子因为调控下游一系列抗逆基因的表
达而逐渐受到重视, 转录因子抗逆基因工程的研究
也大量展开[3-6]。
CBF (CRT/DRE binding factor, 即 CRT/DRE结
合因子)转录因子是一类受低温或干旱胁迫诱导的
转录因子, 它们特异地与 CRT/DRE (C-repeat dehydra-
1760 作 物 学 报 第 35卷

tion-responsive element) DNA调控元件结合, 激活下
游冷诱导或脱水诱导基因的表达, 从而提高植物的
抗逆能力。CBF4转录因子是拟南芥中的干旱应答转
录因子, 其在拟南芥中超表达可提高拟南芥的抗旱
和抗冻能力[7], rd29A (responsive to desiccation stress
29A)基因是拟南芥中受干旱、高盐、低温胁迫等诱
导表达的基因[8]。为了提高玉米的抗旱能力, 本研究
克隆了拟南芥CBF4基因和 rd29A基因启动子, 构建
了逆境诱导表达载体 pBAC146, 用基因枪导入到玉
米优良自交系中, 共得到 36 株转基因植株, 并对转
基因植株进行了分子检测和抗旱生理检测。
1 材料与方法
1.1 材料
先早 17、501、昌 7-2、178 等优良玉米自交
系由北京农业生物技术研究中心作物遗传育种实
验室提供, pGEM-T easy Vector、T4 DNA连接酶
等购自 Promega公司; Taq DNA聚合酶、氨苄青霉
素(Amp)、IPTG、X-gal等试剂均购自大连宝生物
工程有限公司; DNA 回收试剂盒购自天根生化科
技公司 ; 限制性内切酶购自 Promega 和 New
England Biolabs; 地高辛(DIG)标记与检测试剂盒
和化学发光检测试剂盒购自 Roche Diagnostics
GmbH 公司; 普通生化试剂购自 Sigma 公司、
Promega公司或国产。基因枪型号为 PDS-1000/He
(BioRad)。
1.2 方法
1.2.1 逆境诱导 CBF4 基因表达载体的构建 利
用 PCR 方法, 从拟南芥基因组中克隆出 CBF4 基因
和 rd29A 基因启动子 , 经酶切和测序检验正确后 ,
构建成植物诱导表达载体 pBAC146, 如图 1 所示,
该诱导表达载体以 CaMV 35S启动子和玉米 Adh1基
因的 Intron1 驱动的 EPSP 基因作为选择标记基因,
其目的基因 CBF4 以拟南芥亲水蛋白 rd29A 基因的
启动子驱动, 该启动子在受到干旱、冷害、盐渍等
胁迫时表达 , 在正常条件下不表达或表达量很低 ,
对转基因植株的正常生长没有影响。
1.2.2 玉米基因枪转化 取授粉后 12 d左右的玉
米优良自交系 501、先早 17、178等的果穗, 经 75%
乙醇表面消毒后挑取其幼胚接种到诱导培养基(N6
基本培养基 + 10 mg L−1 AgNO3 + 100 mg L−1肌醇 +
2 mg L−1 2,4-D + 30 g L−1蔗糖 + 7 g L−1琼脂)上, 暗
培养 3~5 d 后诱导出胚性愈伤组织。纯化好的
pBAC146载体调整浓度为 1 μg μL−1, 按张晓东等[9]
方法制备基因枪微弹, 轰击胚性愈伤组织, 5 d后将
愈伤组织转移到含有草甘膦的筛选培养基(诱导培
养基中加入 1 mg L−1草甘膦)上培养 20 d左右。然后
选取生长正常的愈伤组织转移到分化培养基(N6 基
本培养基 + 0.5 mg L−1 AgNO3 + 100 mg L−1肌醇 +
1.5 mg L−1 KT + 30 g L−1蔗糖 + 7 g L−1琼脂 + 0.5 mg
L−1草甘膦)上, 分化的幼苗进行壮苗后移栽到温室。



图 1 pBAC146载体图谱
Fig. 1 Plasmid of pBAC146

1.2.3 转基因玉米植株的 PCR检测和 PCR-Southern
检测 用 CTAB 法对转基因玉米叶片进行基因组
DNA 的提取, 根据 rd29A 启动子和 CBF4 基因片段
设计上游引物为 rd29A5: 5′-AGGGTTTGATTACTT
CTATTGG-3′, 下游引物为 rdcbf3: 5′-TATGATTCCA
GCCAACTTCC-3′。以非转基因植株为阴性对照 ,
pBAC146 为阳性对照, 水为空白对照, 反应体系为
ddH2O 17.3 μL, DNA 1 μL (1 μg μL−1), 10×PCR Re-
action buffer 2.5 μL, dNTPs (2.5 mmol L−1) 2 μL, 上
游引物 1 μL, 下游引物 1 μL, Taq DNA聚合酶(5 U
μL−1) 0.2 μL。反应程序为 95℃变性 5 min; 94℃变性
50 s, 45℃复性 50 s, 72℃延伸 50 s, 共 35个循环; 最
后 72℃延伸 10 min。反应产物用 0.8%琼脂糖凝胶电
泳检测。
以 pBAC146为模板, rd29A5和 rdcbf3为上下游
引物, 按照 Roche公司 PCR DIG Probe Synthesis Kit
使用手册进行探针标记, PCR 所得产物经琼脂糖凝
胶电泳、凝胶回收试剂盒回收后作为杂交探针。对
转基因植株基因组DNA进行 PCR, 反应体系和反应
程序同上, PCR 产物电泳、按照 785 型真空转膜仪
第 10期 杨东歌等: 外源脱水应答转录因子 CBF4基因转化玉米的获得 1761


(Bio-Rad)使用手册进行转膜 , 按照 Roche 公司的
DIG DNA Labeling and Detection Kit使用手册提供
的方法进行信号检测。
1.2.4 转基因玉米植株的 Southern杂交检测 为
了使用适宜大小的 Southern检测探针(500 bp左右最
佳), 根据 CBF4 基因序列设计上下游引物 5′-CTGG
GAGGAAGAAGTTTCGTGAG-3′, 5′-CGTTATGATT
CCAGCCAACTTCC-3′, 用该引物按照 Roche 公司
PCR DIG Probe Synthesis Kit使用手册进行探针标
记, 参照 Sambrook 等[10]方法进行 Southern 杂交,
对植物基因组 DNA 利用 Hind III 进行完全酶切,
pBAC146 为阳性对照, 非转基因植株为阴性对照。
酶切产物真空干燥浓缩后以 0.8%琼脂糖凝胶、25 V
电泳过夜, 转膜、杂交等方法与 PCR-Southern相同。
1.2.5 转基因玉米植株的脯氨酸含量测定 转基
因玉米的 T2代经人工抗旱处理 6 d 后, 用磺基水杨
酸法[11]测定其叶片中的游离脯氨酸含量。
1.2.6 转基因玉米植株的叶绿素含量测定 转基
因玉米的 T2代经人工抗旱处理 6 d 后, 参照彭运生
等[12]的方法进行叶绿素含量测定, 取玉米叶片的中
部, 准确称取鲜重(W), 剪碎, 置于 15 mL 试管中,
采用丙酮、无水乙醇(2∶1)混合液浸提, 每个样品加
10 mL混合液, 绝对黑暗的环境中浸提 24 h。取提取
液于 721型分光光度计分别在波长 663 nm和 645 nm
下读取 OD值, 按以下公式计算叶绿素 a和叶绿素 b
的含量(Ca、Cb)。
( )663 645
a
645 663
b
12.7 2.69
1000
22.69 4.68
1000
OD OD
C
W
OD OD
C
W
−=
−=

2 结果与分析
2.1 转基因玉米的获得
用基因枪系统对优良玉米自交系的幼胚进行转
化后, 经筛选、分化后共获得 36株转基因再生植株,
将再生植株移至温室(图 2)。
2.2 转基因玉米植株的 PCR 检测及 PCR-
Southern检测结果
2.2.1 转基因玉米植株 T0代 PCR结果 以 rd29A5
和 rdcbf3为上下游特异引物, 对 36株再生的转基因
植株进行外源 CBF4 基因片段的 PCR 检测, 部分植
株 PCR 检测结果见图 3, 阳性质粒和大部分转基因
植株扩增出了 669 bp的目标片段, 而非转基因对照
和空白水没有扩增出带, 初步说明外源 CBF4 基因
片段整合到部分转化玉米株系的基因组中。
2.2.2 转基因玉米植株 T1代 PCR 和 PCR-Southern
结果 将获得的 T0 代转基因植株移栽到温室后,
部分植株成功结实获得 T1代, 对转基因植株的 T1代
PCR 检测结果如图 4 所示, 有 4 个转基因株系扩增
出 669 bp目标片段, 表明这 4个转基因株系均整合



图 2 愈伤组织的诱导、分化与转基因玉米幼苗的田间移栽
Fig. 2 Callus induction, differentiation and regenerated plants transplanting
A: 玉米幼胚在诱导培养基上诱导愈伤组织; B: 在筛选培养基上筛选愈伤组织; C: 分化出苗; D: 壮苗; E: 移栽。
A: callus induction from immature embryo on inductive medium; B: callus selected on selective medium;
C: differentiation and regeneration of plants; D: strengthening seedling; E: regenerated plants transplanting.



图 3 转基因 T0代植株外源 CBF4基因片段的 PCR检测
Fig. 3 PCR analysis of CBF4 in transgenic plants
+: 阳性质粒 pBAC146; 0: H2O; –: 阴性对照(CK): 1~12: 转基因玉米 T0代植株。
M: DL2000 plus ladder; +: plasmid pBAC146; 0: H2O; –: negative control (CK); 1–12: transgenic maize plants of T0 generation.
1762 作 物 学 报 第 35卷

进外源目的基因片段, 为防止 PCR 出现假阳性, 又
对 T1代转基因植株进行了 PCR-Southern检测, 如图
5所示, PCR阳性的植株 PCR-Southern结果也为阳性,
进一步验证了 PCR结果。



图 4 转基因 T1代植株外源 CBF4基因片段的 PCR检测
Fig. 4 PCR analysis of CBF4 in transgenic plants
+: 阳性质粒 pBAC146; 0: H2O; –: 阴性对照(CK); 1~4: 转基因
玉米 T1代植株。
M: DL2000 plus ladder; +: plasmid pBAC146; 0: H2O; –: negative
control (CK); 1–4: transgenic maize plants of T1 generation.



图 5 转基因 T1代植株外源 CBF4基因片段的 PCR-Southern
分析
Fig. 5 PCR-Southern analysis of CBF4 in transgenic plants
+: 阳性质粒 pBAC146; 0: H2O; –: 阴性对照(CK); 1~4: 转基因
玉米 T1代植株。
+: plasmid pBAC146; 0: H2O; –: negative control (CK); 1–4:
transgenic maize plants of T1 generation.

2.3 转基因玉米植株 T1代的 Southern 杂交检测
结果
为避免 PCR及 PCR-Southern检测结果中假阳性
的出现, 又对 PCR-Southern 检测呈阳性的 4 个株系
进行了 Southern杂交检测, 如图 6所示, 阳性质粒和
3 个转基因株系出现特异性杂交信号, 非转基因植
株没有出现杂交信号, 由于质粒 pBAC146上含有两
个 Hind III酶切位点, 因此, 从 Southern杂交结果不
能看出外源基因导入的拷贝数。Southern 杂交结果
进一步证实外源基因 CBF4 成功导入到转基因玉米
基因组中。
2.4 转基因玉米植株 T2代脯氨酸含量测定结果
脯氨酸作为一种重要的细胞内渗透调节物质 ,
其在植物受到水分胁迫时可大量积累。一般来说 ,
同一品种, 脯氨酸含量越高, 抗旱性越强。为了验证
我们所获得的转基因株系的抗旱能力, 将 T1代长势
较好的并且经分子检测阳性的 1 个转基因株系所获
得的种子(T2代)种植到温室花盆中, 并通过 PCR 的
方法筛选到 8 个阳性植株。干旱处理下测定这 8 个
阳性植株的脯氨酸含量。从图 7可以看出, 除 2号和
5 号转基因植株的脯氨酸含量比对照稍低外, 其余转
基因植株均比对照高, 其中 7 号最高, 达到了 199.53
mg g−1, 约为对照的 2.5倍, 而其余也比对照高出 20%
以上, 脯氨酸含量测定结果间接表明转基因植株的
抗旱能力高于非转因植株。
2.5 转基因玉米植株 T2代叶绿素含量测定结果
除脯氨酸含量外, 我们还对筛选的 8 个阳性转基
因植株进行了叶绿素含量测定, 叶绿素是植物叶片
的主要光合色素, 为植物生理研究中的重要指标。
从图 8 可以看出, 干旱处理下的部分转基因植株的
叶绿素含量远远高于对照水平, 其中 5 号叶绿素含



图 6 转基因 T1代玉米植株的 Southern杂交检测
Fig. 6 Southern-blotting analysis of transgenic plants
+: 阳性质粒 pBAC146; –: 阴性对照(CK); 1~4: 转基因玉米
T1代植株。
+: plasmid pBAC146; –: negative control (CK); 1–4: transgenic
plants of T1 generation.



图 7 转基因玉米脯氨酸含量测定结果
Fig. 7 The proline content of transgenic maize
CK: 非转基因植株对照; 1~8: 转基因植株。
CK: non transgenic plants control; 1–8: transgenic plants.



图 8 转基因玉米叶绿素含量测定结果
Fig. 8 The chlorophyll content of transgenic maize
CK: 非转基因植株对照; 1~8: 转基因植株。
CK: non transgenic plants control; 1–8: transgenic plants.
第 10期 杨东歌等: 外源脱水应答转录因子 CBF4基因转化玉米的获得 1763


量(2.25 mg g−1)是对照的 2倍, 此项结果也表明部分
转基因植株的抗旱能力高于非转基因植株。
3 讨论
非生物胁迫如干旱、高盐和低温等严重限制了
作物的品质和产量, 由于传统育种具有周期长、困
难大等特点, 已经不能满足我们日益增长的对粮食
的需求, 利用转基因技术将具有优良性状的外源基
因导入作物中, 培育出具有优良性状的作物新品种,
为作物的抗逆育种开辟了一条新的途径。
植物的转基因抗逆育种, 主要有 3个方面的问题,
一是目的基因的选择, 主要包括功能抗逆基因和调
控抗逆基因, 转录因子由于能调控下游一系列抗逆
基因的表达而逐渐受到人们的重视; 二是启动子的
选择, 由于抗逆基因的组成型表达会给正常生长条
件下的植物带来负面影响, 而用胁迫诱导的启动子
驱动时对转基因植株生长的影响很小[13], 因此抗逆
基因工程需要选择逆境诱导表达的启动子; 第三是
对获得的转基因植株进行抗逆性的评估, 需要从分
子水平、生理代谢水平上对获得的转基因植物进行
检测, 对于转转录因子抗逆基因工程育种来说, 逆
境下其下游调控的抗逆基因表达水平的检测也很重
要。为了进行玉米抗旱基因工程育种, 本研究克隆
了拟南芥 CBF4基因, 在逆境应答的 rd29A启动子驱
动下导入到优良玉米自交系中, 并对获得的转基因
玉米株系进行了 PCR、Southern blot 等分子检测和
脯氨酸含量和叶绿素含量等抗旱生理指标检测, 从
分子水平和生理水平对转基因植株进行了分析, 初
步表明转基因玉米植株抗旱能力比非转基因对照增
强。生理指标测定表明也有小部分转基因植株与对
照相当 , 可能是由于转基因植株后代分离所引起
的。然而, 虽然外源目的基因 CBF4已经成功整合到
转基因玉米基因组中, 但其是否能在转基因后代中
稳定表达还需要进一步检测, 由于本研究转入的是
转录因子基因, 有必要对目的基因下游调控的抗逆
基因的表达水平, 以及转基因植株的田间抗旱能力
进行检测, 这将是我们下一步的研究目标。
4 结论
构建了拟南芥 CBF4 基因的诱导表达载体
pBAC146, 并用基因枪转化法转化玉米优良自交系,
共获得 36株转基因植株, 分子水平检测和抗旱生理
检测均表明外源基因成功导入到部分转基因植株的
基因组中, 并且使其抗旱能力显著提高, 初步说明利
用 CBF4基因的诱导表达可以提高玉米的抗旱能力。
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