全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(5): 918923 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由东北农业大学创新团队项目(CXZ003), 黑龙江省教育厅科学研究重点项目, 东北农业大学科学研究基金和东北农业大学冬
小麦创新工程项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 苍晶, E-mail: cangjing2003@163.com
第一作者联系方式: E-mail: myclove173@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2010-10-28; Accepted(接受日期): 2011-03-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00918
低温胁迫下东农冬麦 1号分蘖节 SSH文库的构建及文库中 3个基因的
表达模式
牟永潮 崔 红 于 晶 苍 晶* 曾 俨 孟健男
东北农业大学生命科学学院, 黑龙江哈尔滨 150030
摘 要: 为揭示高抗寒冬小麦品种东农冬麦 1号的抗寒分子机制, 在北方寒地自然条件下, 于越冬前(5℃)和越冬期
(25℃) 分别对分蘖节取样, 利用抑制消减杂交技术构建该品种低温胁迫相关基因的 cDNA 文库。在 cDNA 文库中
随机挑选 300个阳性克隆测序, 获得 230条高质量的表达序列标签(EST)。对该序列进行 BLAST比对及功能注释, 发
现文库中基因组成类型复杂多样, 其中应对胁迫的基因(如热激蛋白、CS66、Wcor8 等)以及参与编码 60S 和 40S 核
糖体亚基的基因出现的频率较高, 这些基因可能与东农冬麦 1号的安全越冬有密切关系。对文库中筛选到的 2种未知
基因和 Clp 基因进行荧光定量 PCR 分析, 发现其表达水平随着温度降低而不同程度升高; 在弱抗寒性小麦品种济麦
22中, 这些基因则有不同的表达模式。推测这些基因在抗低温胁迫过程中发挥重要作用。
关键词: 东农冬麦 1号; 抗寒基因; 抑制消减杂交(SSH); 表达序列标签(EST); 荧光定量 PCR
Expression Analysis of Three Genes from SSH Library Constructed Using
Tillering Nodes of Dongnongdongmai 1 under Low Temperature
MOU Yong-Chao, CUI Hong, YU Jing, CANG Jing*, ZENG Yan, and MENG Jian-Nan
College of Life Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: To reveal the molecular mechanism of cold resistance of winter wheat variety Dongnongdongmai 1, under natural con-
ditions in the north region of China, we collected tillering nodes before (5C) and in winter season (25C) respectively, then
constructed cDNA library of Dongnongdongmai 1 containing low temperature stress related genes by suppression subtractive
hybridization. A total of 300 positive clones selected from cDNA library randomly were sequenced to obtain 230 high quality
expressed sequence tags (EST). After BLAST and functional annotation, we found complex and diverse types of genes in the li-
brary, including stress response genes (such as heat shock protein, CS66, Wcor8, and other related genes) and genes encoding 40S
and 60S ribosomal subunit. These genes with high frequency may play an important role in protecting Dongnongdongmai 1 from
injuring under low temperature. Two unknown genes and Clp selected from the cDNA library were analyzed through quantitative
PCR. The expression levels of these genes in Dongnongdongmai 1 were increased in various degrees with the decrease of tem-
perature; however, their expression patterns were different in Jimai 22 (a winter wheat cultivar with low resistance to low tem-
perature). This result suggests that these genes may play an important role in resistance to low temperature stress.
Keywords: Dongnongdongmai 1; Gene for cold resistance; Suppression subtractive hybridization; Expressed sequence tag;
Real-time PCR
低温是植物生长过程中重要的胁迫因子之一。对小
麦应答低温胁迫分子机制的研究是改良小麦低温逆境适
应性和抗寒育种的基础。东农冬麦 1号是东北农业大学选
育的能在黑龙江省高寒地区安全越冬的冬小麦品种 , 具
有高耐寒特性 , 是发掘抗寒基因和小麦抗寒机制研究的
理想材料之一。对于东农冬麦 1号的研究仍处于起步阶段,
通过对比相对弱抗寒品种济麦 22, 发现东农冬麦 1号安全
越冬的最主要器官是分蘖节, 其中含有丰富的可溶性糖、可
溶性蛋白、脯氨酸等物质, 与其高抗寒性有重要关系[1]。
抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,
SSH)是一种简单、有效的获得低丰度稀有基因的方法, 具
有速度快、效率高、灵敏度高、假阳性率低等优点, 目前
第 5期 牟永潮等: 低温胁迫下东农冬麦 1号分蘖节 SSH文库的构建及文库中 3个基因的表达模式 919


已广泛用于作物抗逆基因筛选以及发育相关基因研究中,
例如, 李红霞等[2]利用 SSH 技术构建了黏类小麦的育性
相关基因消减杂交文库, 得到与发育相关的基因; Yao 等
[3]成功构建了小麦杂交子代与其亲本在叶和根中差异表
达的 cDNA文库。
已有学者开展了冬小麦抗寒基因及其表达的研究 ,
如 Antonio等[4]对冬麦的根茎及叶在冷适应过程涉及的基
因进行表达分析, 发现蛋白激酶、钙结合蛋白、转录因子
及部分核酸结合蛋白、泛素蛋白酶体等基因、表达量出现
不同程度的上调。Houde等[5]成功构建多个与非生物胁迫
相关的 cDNA文库, 其中包括与冷胁迫相关的基因, 获得
大量不同程度上调表达的基因。但是这些研究多选用小麦
的叶或根为试验对象 , 未见有分蘖节中抗寒相关基因及
其表达的相关报道。本研究从东农冬麦 1号分蘖节中分离
提取基因组 RNA, 采取抑制消减杂交的方法构建了低温
胁迫诱导的 SSH-cDNA 文库。从该文库中筛选了 3 个抗
寒相关基因进行荧光定量 PCR 的表达模式分析, 为揭示
东农冬麦 1号的抗寒分子机制提供证据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及其总 RNA的提取
2008年 9月 10日大田种植冬小麦 (Triticum aestivum
L.)强抗寒品种东农冬麦 1 号和弱抗寒对照品种济麦 22。
当自然降温至 5、10和25℃并持续 5 d后, 取分蘖节, 以
去离子水冲洗, 液氮冷冻后于−80℃冰箱中保存待用。
取 50~100 mg分蘖节于液氮中研磨, 加入 Trizol溶液
1 mL, 按试剂盒说明书的方法提取总 RNA。将总 RNA溶
于DEPC水中, 用DNase I (TaKaRa, 大连) 37℃处理 30 min
抽提纯化 RNA。用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 完
整性, 用紫外分光光度计检测总 RNA 的浓度和纯度。利
用 PolyA-Tract mRNA Isolation System III (Promega, 美
国), 从总 RNA中分离 mRNA。用 3 mol L−1 NaAc和无水
乙醇浓缩纯化的 mRNA, 以此作为构建 SSH 文库的起始
材料。
1.2 SSH与 SSH-cDNA文库的构建
按 PCR-Select cDNA Subtraction Kit (Clontech, 美国)
说明书进行 SSH操作。以−25℃胁迫后的分蘖节为检测子
(tester)、5℃下取样的分蘖节为驱动子(driver), 构建低温
胁迫下 SSH-cDNA 文库。SSH 产物经纯化和浓缩后与
PMD18-T Vector (TaKaRa, 大连)载体连接, 形成质粒文
库。连接产物转化感受态细胞 JM109, 涂于含有 Amp/
X-gal/IPTG的 LB培养基上, 挑取白色克隆, 利用 M13引
物检测目的片段的插入情况, 构成相应的 SSH文库。
1.3 序列测定和 BLAST分析
挑选阳性克隆送博仕生物公司(哈尔滨)测序。所获序
列去除载体和接头序列后获得 EST。采用 NCBI
(http://www.ncbi.nih.gov/)在线序列比对工具 BLASTx 对
非冗余蛋白质数据库进行同源性检索分析; 对功能未知
的 EST进一步做 tBLASTx序列比对, 在 GenBank非冗余
核酸数据库和 EST 数据库进行同源性检索。利用 Amigo
网站 (http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/go.cgi)进
行功能注释分析。
1.4 SSH文库中目标基因的定量分析
从完成测序的文库基因中挑选 3 个基因, 其中两个为
未知基因, 一个为 Clp分子伴侣基因。对这 3个基因进行
定量 PCR分析, 检测 3种温度条件下其在济麦 22和东农
冬麦 1 号分蘖节中的表达水平和变化。参照 PrimeScript
RT Reagent Kit (TaKaRa, 大连)说明书方法合成 cDNA,
RT-PCR体系采用 SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa, 大连)
进行配置。3个目标基因的合成引物分别为: F1A8F: 5′-CT
GTGCCCTGGTTCCTTAGT-3′, F1A8R:5′-CAGAGTTAAC
GGTCAAGCCA-3′; F3A7F: 5′-TGAAGCCAGAAAGGATT
GAA-3′, F3A7R: 5′-ATTTCATCCGGAAACTCGTC-3′; ClpF:
5′-TTAGCCTTGACCTCCTCGTT-3′, ClpR: 5′-TGTAACC
GCCAATCTGTCAC-3′。内参基因为 actin, 其合成引物为
F1: 5′-CGTATCTAGGCTCGTCTCGTCTA-3′; R: 5′-CTGG
TGCTGGGTATCAAAGGAA-3′。利用 ABI PRISM 7500
Real-time PCR System进行 PCR扩增, 反应程序为: 95 , ℃
30 s; 95 , 4℃ s; 60 , 34℃ s, 40个循环。各温度条件下目标
基因和内参基因表达检测均重复 3次。
2 结果与分析
2.1 SSH-cDNA文库的构建
提取总 RNA的 28S rRNA与 18S rRNA亮度比例约
为 2∶1; 紫外分光光度检测的 A260/A280值介于 1.8~2.0 之
间, A260/A230值大于 2.0, 表明提取的总 RNA质量良好, 达
到建库要求。mRNA经反转录及 Rsa I酶切后, 琼脂糖凝
胶电泳显示 cDNA酶切效果良好, 符合进一步实验要求。
酶切后的 cDNA经 2次消减杂交后琼脂糖凝胶电泳检测结
果显示, 经抑制消减杂交扩增出的 cDNA 片段较未经抑制
消减扩增出的 cDNA片段整体下移。消减杂交样品中含有
隐约可见的条带, 与未消减的 PCR 扩增条带产物有明显
差异, 表明消减杂交成功。
通过蓝白斑筛选阳性克隆, 随机挑选白色菌落于 96 孔
板中培养, 并通过 PCR将插入片段扩增出来, PCR产物经
琼脂糖凝胶电泳发现, 插入片段大小集中分布于 250~750 bp
之间(图 1)。
2.2 阳性克隆序列测定及生物信息学分析
从培养基上挑取白色菌斑 , 一部分加甘油 , 液氮速
冻后−80℃永久保存, 另一部分进行序列测定。挑取 300
个阳性克隆进行序列测定, 成功回收 230个 EST, 序列长
度介于 103~844 bp 之间, 平均 355 bp。经 BLASTx 和
tBLASTx同源性检索, 其中 211条为已知序列, 占 91.2%。
BLASTx比较结果中, 109条 43种 EST功能已知, 占全部
EST 的 18.8%。对 GenBank 的非冗余核酸数据库功能未
定的 EST 序列进行 tBLASTx 分析, 有 102 条可以找到同
源序列, 且多数为小麦和大麦的同源 cDNA 克隆。部分
EST与 GenBank功能已知基因同源性比较结果如表 1。
920 作 物 学 报 第 37卷



图 1 插入片段的 PCR扩增产物
Fig. 1 Electrophoresis patterns of PCR products amplified from inserted fragments
M: DL2000; 1–14: 单克隆 PCR产物。
M: DL2000; 1–14: PCR products of single clones.

表 1 低温胁迫下部分 EST与 GenBank功能已知基因同源性比较(BLASTx)
Table 1 Similarity analysis (BLASTx) of cold stress library ESTs with the function identified genes in GenBank
克隆编号
Clone No.
长度
Sequence length (bp)
可能基因
Possible gene
种属
Species
一致性
Identity (%)
E值
E-value
F1A2 548 RuBisCO large subunit-binding protein subunit beta Oryza sativa 98 5E−86
F1B1 434 cystatin Triticum aestivum 98 6E−24
F1B6 103 60S ribosomal protein L17 (RPL17B) Arabidopsis thaliana 100 0.002
F3B3 226 guanine nucleotide-binding protein beta subunit Oryza sativa 88 3.00E−14
F1E12 364 MADS-box transcription factor TaAGL36 Triticum aestivum 97 6E−51
F1D6 844 putative Zn transporter Hordeum vulgare 97 2E−91
F1E3 329 J-domain protein Triticum aestivum 100 2.00E−07
F1E7 675 OSJNBb0017I01.25 Oryza sativa 27 0.76
F1E8 577 hypothetical protein OsJ_00434 Oryza sativa 77 2E−34
F2G11 326 hypothetical protein OsI_12226 Oryza sativa 92 8E−29
F3F7 315 Cold shock protein CS66 Triticum aestivum 100 2E−34
F3H9 809 hypothetical protein SORBIDRAFT_02g003990 Sorghum bicolor 91 3E−37
F3F3 345 hypothetical protein OsI_30065 Oryza sativa 79 1E−20
F2G9 460 ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit Zea mays 84 4E−38
F2C1 143 hypothetical protein OsI_17552 Oryza sativa 82 1.00E−08
F2F8 209 14-3-3 protein Triticum aestivum 100 2.00E−14
F2F10 364 MIKC-type MADS-box transcription factor WM24B Triticum aestivum 98 2E−43
F6B5 231 peptide transporter-like Oryza sativa 97 1E−34
F3G1 329 60S ribosomal protein L21 Triticum aestivum 98 8E−57
F3B10 316 Voltage dependent anion channel (VDAC) Triticum aestivum 100 0.15
F1E6 215 Wcor18 Triticum aestivum 96 9E−24
F2D3 470 cation transport protein chaC Zea mays 64 3.00E−06

2.3 低温胁迫文库中 EST序列的功能分析
在 EST序列 BLASTx比对结果基础上, 利用 AmiGO
对 109条 EST进行功能注释, 与细胞组分相关的, 内膜系
统占 32%, 细胞核占 20%, 未知基因占 19%, 叶绿体占
12%, 液泡占 9%, 细胞骨架占 5%, 细胞质占 2%, 细胞壁
占 1%。可见在响应低温胁迫的过程中, 以生物膜对胁迫
反应作出的应答所占比重最大。
对序列比对所得基因参与细胞代谢过程的分析发现,
26%的基因未知功能, 应对胁迫的基因及参与翻译过程的
基因(主要为不同沉降系数的核糖体基因, 编码 60S、40S
核糖体亚基)均占 13%, 参与开花发育负调节过程和蛋白质
代谢过程的基因均占11%, 与细胞分裂过程有关的基因占
8%, 参与硫代谢的基因占 6%, 参与离子转运、rRNA加工
的各占 3%, 参与脂类代谢、转录调节和染色体组装的基因
各占 2%。可见, 东农冬麦 1号在越冬过程中, 为了适应低
温环境, 其发育、转录、翻译、表达及加工过程、物质运
输及细胞的分裂调控等过程中均发生了较大的变化 , 参
与这些过程的基因表达量有所增加。值得注意的是, 参与
第 5期 牟永潮等: 低温胁迫下东农冬麦 1号分蘖节 SSH文库的构建及文库中 3个基因的表达模式 921


胁迫反应过程的基因占所得有效 EST 的 13%, 所占比例
较大, 包括热激蛋白、CS66和 Wcor8等基因。
GO 分类中分子功能显示, 26%的基因未知功能, 参
与构成细胞组件的基因占 15%, 与寡肽运输功能有关的
基因占 11%, 调控转录因子及翻译产物具有催化活性的
基因各占 10%, 与蛋白质结合功能有关的基因占 7%, 与
蛋白质加工有关的基因占 4%, 与离子运输载体有关的基
因占 3%, 与氨基酸结合功能、糖结合功能、锌离子结合
功能和延伸因子有关的基因各占 1%。在转录因子中, 有
与控制花发育有关的 MADS转录调节因子等。
2.4 SSH文库中 3个基因的 RT-PCR分析
从文库中选择 F1A8和 F3A7两个未知基因及一个已
知基因 Clp, 设计引物, 分别对 5、−10 和−25℃持续 5 d
处理的东农冬麦 1 号和济麦 22 分蘖节中的表达模式进行
鉴定。随温度降低, 东农冬麦 1号分蘖节中 F1A8和 F3A7
基因的表达量不断升高, −25℃处理的表达量最高; 相比
之下, 济麦 22 中这两个基因的表达量随温度降低而呈下
降趋势(图 2-A和 B)。可见, F1A8和 F3A7基因与东农冬
麦 1号较强的冷冻耐受能力有一定的相关性。Clp基因在
东农冬麦 1号分蘖节中呈不同的表达模式, 5℃和−10℃处
理下的表达量相对较低且基本恒定, 而在−25℃条件下表
达量明显增加; 在济麦 22 分蘖节中, Clp 基因在 5℃时的
表达量较高, 但随温度降低而明显下降, −10℃时表达量
最低, −25℃时表达量虽然有所升高, 但增加的幅度明显
比东农冬麦 1号低(图 2-C)。
3 讨论
植物抗低温胁迫是一个系统的复杂过程, 涉及生理
生化途径的多个方面, 在整体上体现了生命活动的协调
性。因此, 抗低温过程不仅仅是抗性基因的启动和识别,
更重要的是在此过程中抗性基因与其他相关基因之间的
互作, 包括基因表达产物之间的调节作用、信号传导通路
的畅通等。通常认为植物遭受寒害的原始部位是质膜, 越
来越多的研究也证实生物膜在植物逆境胁迫中的重要性
[6-7]。干旱、低温、冻害等胁迫, 无论直接还是间接危害, 都
首先引起膜透性的改变, 并随着胁迫的加剧, 膜上酶蛋白
种类及数量和脂类的组成发生改变[8-9]。低温诱导东农冬
麦 1号后, 其分蘖节 SSH-cDNA文库中存在很大比例(32%)
的编码位于膜上的蛋白基因。对这些基因功能的进一步研
究, 可为揭示东农冬麦 1号高抗寒机制提供依据。
本研究构建的 SSH-cDNA文库中发现存在 14-3-3蛋
白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白 β亚基(G-蛋白 β亚基)。目前,
已知这两种蛋白在细胞信号通路中有重要作用。14-3-3蛋
白的主要功能包括：参与细胞信号转导途径、细胞周期调
控、调控线粒体和叶绿体的蛋白运输、调控细胞凋亡等,
并且能在低温、低氧、高盐、病原菌侵染等条件下诱导蛋
白表达[10]。G-蛋白是一种调控信号结合蛋白, 参与许多激
素信息的传导过程。低温冷冻状态下, 植物为适应环境胁
迫, 在激素调控下调整细胞状态。ABA信号通路中, ABA
受体(GTG1 和 GTG2)与 G-蛋白偶联, 启动级联反应, 调
节基因表达[11]。我们发现 ABA对东农冬麦 1号低温适应
过程具有调节作用[12-13], 并推测在东农冬麦 1号的越冬过
程中, 14-3-3蛋白以及 G-蛋白在抗寒信号通路的畅通及准
确传递方面发挥重要作用 , 从而保证增加相关抗寒基因
的表达及抗寒物质的积累。
Cor 基因是一组编码极端疏水 COR 蛋白的基因, 属
于诱导型基因 , 多个此类基因共同发挥作用可增强植物
的抗冷性。该基因通常被一个相同的调控元件 CRT/DRE
(C-repeat/drought-responsive element)所调节, 将 CRT/DRE
调控因子转化植株, 获得 CBF1 超表达拟南芥, 即使在正
常条件下, 也能产生 COR 蛋白, 产生抗冻性[14]。小麦中
脱水素(WCOR410)的积累与其冷冻抗性能力相一致 , 在
冷驯化过程中 , 冷冻抗性强的品种比抗性弱的品种的
表达量高[15]。东农冬麦 1号在低温胁迫后, 产生至少两种
COR 蛋白(CS66 和 Wcor8), 推测与其较强的抗寒性有重
要关系。
另外 , 需要值得注意的一类蛋白是分子伴侣 , 它们
参与蛋白质的折叠、组装、蛋白质加工、转运及降解等过
程, 在功能异常或者非功能性蛋白的去除、以及维持细胞
内环境平衡等方面具有非常重要的作用。J-蛋白是一种重
要的分子伴侣, 它与热激蛋白 70 (HSP70)组成分子复合
体在细胞中起分子伴侣机器的作用, 参与蛋白质的折叠、
组装和转运等多种重要生命活动[16-17]。李国良等[18]利用
Nothern 杂交方法检测了拟南芥 AtJ2 和 AtJ3 对不同环境



图 2 东农冬麦 1号和济麦 22分蘖节中 F1A8 (A)、F3A7 (B)和 Clp (C)基因在不同低温处理下的表达模式
Fig. 2 Expression patterns of F1A8 (A), F3A7 (B), and Clp (C) in tillering nodes of Dongnongdongmai 1 and Jimai 22 under low temperature
treatments
持家基因 actin为内参基因。The house-keeping gene actin served as the internal reference gene.
922 作 物 学 报 第 37卷

胁迫的响应, 发现在冷胁迫 12 h 后两种基因的表达量上
调明显, 说明这两种基因参与冷胁迫反应过程。Clp 是另
一类分子伴侣, 属于 Hsp100 家族, 在蛋白质的分解过程
中起着重要的作用。与其他分子伴侣类似, Hsp100/Clp蛋
白在植物中通常组成型表达 , 但却受到不同环境胁迫的
诱导, 如热、冷、干旱、高盐或暗处理等[19-22]。水稻 Hsp100
蛋白在胁迫后的细胞修复中也有重要作用[23]。在冷冻条
件下, 尤其是在黑龙江25℃条件下, 冬小麦细胞内形成
冰晶, 容易对细胞造成伤害。冷冻条件下, Hsp100/Clp蛋
白对冬小麦损伤细胞的修复发挥着怎样的作用 , 有待进
一步研究。荧光定量 PCR的结果显示, Clp基因在东农冬
麦 1 号中, 随着温度的降低其表达量上升, 而在相对弱抗
寒品种济麦 22中, 其表达水平呈现下降的趋势, 在10℃
和25℃时, 表达水平基本不变。
文库中存在一种与蛋白质活性有关的基因, 即胰蛋
白酶抑制剂基因。胰蛋白酶抑制剂通过与蛋白的活性位点
直接作用, 抑制蛋白酶的催化活性, 参与多种功能, 如环
境的刺激、贮藏物质的动员、细胞程序性死亡、蛋白的加
工和降解或者代谢途径的调控等[24-25]。Pernas 等[26]发现板
栗在冷、盐和热等非生物胁迫中, 蛋白酶抑制剂在翻译水
平被诱导而发生变化, 来应对非生物胁迫过程。Petya等[27]
对冬小麦的冷激胰蛋白酶抑制剂做了详细的研究 , 发现
具有抗雪霉病的作用。本研究结果中存在胰蛋白酶抑制剂,
推测其在抗低温过程中有重要作用 , 其表达产物可能是
影响东农冬麦 1号返青的重要因素之一。
在本文库中除功能已知基因外, 还存在大量功能未
知的基因, 虽然参与的生物过程和发挥作用未知, 但推测
其在东农冬麦 1号的抗寒越冬过程中起重要作用。这一推
测有待进一步研究。本研究从文库中筛选出两种未知基因,
并检测了其表达模式。结果表明, 随着温度的下降, 这两
种未知基因在东农冬麦 1 号中均表现出不同程度的上升,
而在济麦 22 中表达水平呈微弱的下降或基本不变的趋势。
最明显的是在10℃和25℃的条件下, 3种基因在济麦 22
中表达水平相当, 而在东农冬麦 1号中却呈上升趋势。推
测这 2种未知基因可能与东农冬麦 1号的较强抗寒特性具
有较大的相关性。
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