全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(5): 764−769 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(30600397); 中国博士后科学基金(2005038643); 浙江省自然科学基金项目(Y305140); 2006年度浙江省博士
后科研项目择优资助项目(2006-BSH-40)
作者简介: 柯丽萍(1976–), 女, 博士, 研究方向为油菜分子生物学。E-mail：kelip@163.com
*
通讯作者(Corresponding author): 陈锦清, 男, 研究员, 主要从事油料作物基因工程与品质改良研究。Tel (Fax): 0571-86404249;
E-mail: j.q.chen@zaas.org
Received(收稿日期): 2007-12-05; Accepted(接受日期): 2007-12-22.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00764
甘蓝型油菜 SLG基因片段的克隆及序列分析
柯丽萍 郑 滔 吴学龙 何海燕 陈锦清*
(浙江省农业科学院病毒学与生物技术所, 浙江杭州 310021)
摘 要: 通过不同甘蓝型油菜中 SLG 基因的克隆及序列分析, 探索了甘蓝型油菜中是否存在与芸薹属二倍体中相同
或相似的 S-locus基因。对 10个甘蓝型油菜品种和品系中 SLG基因的 PCR扩增和序列比较分析发现, 这些甘蓝型油
菜中都存在第 2 类的 SLG 基因, 而且, 同二倍体芸薹属物种一样, 第 2 类 SLG 基因之间具有较高的同源性; 只有 5
个甘蓝型油菜品种和品系中存在第一类 SLG 基因, 而且这些基因序列之间表现出高度的保守性, 即同源性在 96%以
上, 明显高于不同等位基因之间的同源性。这些甘蓝型油菜中的 class I SLG基因可能源于同一个自交不亲和单体。
关键词: 甘蓝型油菜; 自交不亲和; SLG基因; 同源性分析
Analysis of Self-Incompatibility Locus Gene in Brassica napus
KE Li-Ping, ZHENG Tao, WU Xue-Long, HE Hai-Yan, and CHEN Jin-Qing*
(Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, Zhejiang, China)
Abstract: Self-incompatibility (SI) is one of the most important mechanisms in flowering plants to prevent inbreeding and pro-
moter outcrossing. In Brassica, the diploid varieties of Brassica oleracea (CC) and B. campestris (AA) were self-incompatibility,
while the amphidiploid B. napus varieties (AACC) were usually self-compatible. In the SI response, SLG gene was one of the
S-locus genes that supposed to contribute to receptor—ligand interactions and signal transduction. SLG gene shares a similarity of
85–98% with eSRK (SRK ectodomain) in the same S haplotype, while in different S haplotypes, the SLGs and SRKs behave dif-
ferently. In order to make out whether the S-locus exist in B. napus, the SLG gene in the S-locus in several varieties of B. napus
were cloned. By PCR analysis and sequences comparison, the class II SLG gene was found in all tested varieties of B. napus,
while class I SLG genes were only found in 5 of the 10 tested varieties. Further studies indicated that the five varieties that had the
class I SLG genes were probably derived from the same S haploid years ago. The results would provide scientific reference for
further study and exploitation on the mechanistic studies of self-compatibility in Brassica napus L.
Keywords: Brassica napus; Self-incompatibility; SLG gene; Homologous analysis
芸薹属中二倍体物种甘蓝 (Brassica oleracea,
CC)、白菜和白菜型油菜(B. campestris, AA)存在广泛
的自交不亲和性, 而其相应的异源四倍体种甘蓝型
油菜(B. napus, AACC)通常表现为自交亲和[1]。目前,
国内外对芸薹属二倍体物种中自交不亲和性及其分
子机理展开了深入的研究 , 并已经取得很大的进
展。这些研究成果为基因工程在甘蓝型油菜自交不
亲和性的应用奠定了基础。
芸薹属二倍体物种中 , SLG基因是自交不亲和
位点(S-locus)中与识别反应相关的一个基因 , 在所
有自交不亲和等位基因中, SLG与SRK基因的胞外结
构域在核苷酸序列上相似性达 85%~98%, 然而在不
同的等位基因中, SLG之间、SRK之间却表现出很大
的不同[2]。在同一S等位基因中, SLG和SRK的高度同
源性能够得以保持, 可能是在自交不亲和性的进化
中基因转换的原因 [3], 这种SLG和SRK的共进化现
象说明SLG与S单元型专一性相关[4]。因此, 通常情
况下, 只需要分析SLG基因就可以对S位点的不同复
第 5期 柯丽萍等: 甘蓝型油菜 SLG基因片段的克隆及序列分析 765


等位基因进行鉴定和分类。根据S-位点上SLG基因的
结构, 芸薹属自交不亲和复等位基因可分为两大类,
class I自交不亲和复等位基因中, SLG没有内含子;
class II S等位基因中, SLG基因的 3′末端附近有一个
内含子[5-6]。在芸薹属自交不亲和基因的进化过程中,
class I和class II S基因的分化很早, 所以, 这两类S
基因之间差别较大[7]。就序列相似性程度来说, class
II SLG基因之间同源性在 86%以上, 而class I和class
II SLG基因之间同源性只有 60%~70%。到目前为止,
所有class II S复等位基因都属于花粉隐性表现型 ,
包括B. rapa中的S29-、S40-、S44- 和S60-单元型[8-9]
和B. oleracea中的S2-、S5- 和S15-单元型[10-12], 而大
多数class I S复等位基因属于花粉显性表现型[13]。
Nishio等 [14]根据这两类SLG基因序列特点 , 设计特
异引物 , 通过PCR扩增就能将两类SLG基因区分开
来。
本研究利用Nishio等[14]的两类SLG基因特异引物
对自交亲和的甘蓝型油菜进行PCR扩增, 通过对扩增
产物的有无和扩增片段的序列分析来研究甘蓝型油菜
中的S位点基因的存在与否及其存在方式, 为进一步
深入甘蓝型油菜自交亲和发生机理的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本实验室保存的来自国内外不同地区推广的甘
蓝型油菜品种和品系 84004 (P1)、浙双 72 (P2)、加
拿大春油菜 westar (P3)、浙油 758 (P4)、8701 (P5)、
浙优油 1号 (P6)、中双 10号(P7)、长荚油菜(P8)、
工农 1 号(P9) 和 58 系(P10), 以及一些来自国内外
的不同甘蓝型油菜栽培种秦优 7 号、浙双 6 号、高
油 605、沪油 16、浙双 72、宁 RS-1、H5200、宁油
7 号、Tapidor、Darmor、Darmor MX、Mardrigal、
Courage 和 Cambrra, 都表现自交亲和。测序载体
pMD18-T购自大连 TaKaRa公司。
1.2 总 DNA的提取
参考Doyle和 Doyle的CTAB小量法进行油菜总
DNA的提取[15-16]。
1.3 SLG基因的分离
根据Nishio等[14]的研究, 合成了 3对SLG基因扩
增的特异引物, 其中 2对分别记为PS5 + PS15和PS5
+ PS18, 是第 1类SLG基因扩增的特异引物, 而另一
对PS3 + PS21则是第 2类SLG基因扩增的特异引物。
这些引物编号及其序列如下。
PS5: 5′-ATGAAAGGCGTAAGAAAAACCTA-3′
PS15: 5′-CCGTGTTTTATTTTAAGAGAAAGAG
T-3′
PS18: 5′-ATGAAAGGTGTACGAAACATCTA-3′
PS3: 5′-ATGAAAGGGGTACAGAACAT-3′
PS21: 5′-CTCAAGTCCCACTGCTGCGG-3′
在 15 μL反应体系中, 取 1 μL总 DNA作模板
用 3 对引物分别进行 PCR 扩增, 扩增程序为 94℃
30 s, 55℃ 45 s, 72℃ 60 s, 共 30个循环。取 10 μL
PCR产物在 1.0%琼脂糖凝胶上检测, 将目标带型从
琼脂糖凝胶中挖出, 用UNIQ-10柱式DNA胶回收试
剂盒 (上海生工 , #SK1131)进行回收 , 并采用
pMD18-T Vector(TaKaRa)进行目标片段的克隆。取
阳性克隆送上海英骏公司测序。
1.4 序列比较分析
首先, 将 3对引物扩增所得序列用 DNAStar(5.0)
软件的 MegAlign(5.0)进行分析; 然后将这些序列与
NCBI 上已知的甘蓝(B. oleracea), 白菜型油菜(B.
campestris)和甘蓝型油菜(B. napus)的 SLG基因序列
比较, 进行 MegAlign 分析, 同时根据序列相似性进
行聚类。共分析了 34 个已知的 SLG 序列(表 1), 同
时包括第一类和第二类的 SLG 序列, 它们的编码序
列区段大小分别为 1 350 bp和 1 100 bp, 本实验中进
行比较的主要是编码序列部分。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
用以上 3 个引物组合分别对甘蓝型油菜材料
P1~P10 进行 PCR 扩增 , 结果显示 , 引物组合
PS3+PS21能够同时在所有材料中扩 帯出其特异 , 大
小分别为 1.0 kb左右; 引物组合 PS5+PS15只在 P1、
P2、P3、P5和 P7中扩出了约 1.3 kb的特异片段, 而
引物组合 PS5+PS18没有扩出任何产物(图 1)。
用引物组合 PS3+PS21和 PS5+PS15对国内外不
同油菜栽培种进行 PCR 扩增, 包括秦优 7 号、浙双
6号、高油 605、沪油 16、浙双 72、宁 RS-1、H5200、
宁油 7号、Tapidor、Darmor、Darmor MX、Mardrigal、
Courage 和 Cambrra。结果与前面一致, 即所有材料
中都可以扩出引物组合 PS3+PS21 的约 1.0 kb 的特
帯异 , 而只有 9个材料中扩出了引物组合 PS5+PS15

766 作 物 学 报 第 34卷


表 1 文中用到的 SLG基因的来源、类型及其 NCBI登录号
Table 1 Origins, types, and GenBank accession No. of the SLG genes used
SLG 基因
SLG genes
来源
Species
类型
Type
参考文献
Reference
登录号
GenBank accession No.
SLG8 B. campestris I Dwyer K G et al. (1991)[17] X55274
SLG9 B. campestris I Watanabe M et al. (1994)[18] D30050
SLG29 B. campestris II Hatakeyama K et al. (1998)[8] AB008190
SLG40 B. campestris II Hatakeyama K et al. (1998)[8] AB054058
SLG41 B. campestris I Kusaba M et al. (1997)[6] D85222
SLG44 B. campestris II Hatakeyama K et al. (1998)[8] AB054059
SLG45 B. campestris I Kusaba M et al. (1997)[6] D85223
SLG46 B. campestris I Kusaba M et al. (1997)[6] D85224
SLG48 B. campestris I Kusaba M et al. (1997)[6] D85225
SLG49 B. campestris I Kusaba M et al. (1997)[6] D85226
SLG60 B. campestris II Fukai E et al. (2003)[19] AB097116
SLG99 B. campestris I Kusaba M et al. (1997)[6] D85227
青海大黄 SLG Qinghuang SLG B. campestris I He Y T et al. (2004)[20] AY448026
黄籽沙逊 SLG Yellow sarson SLG B. campestris I He Y T et al. (2004)[20] AY448028
关中油白菜 SLG Guanyou SLG B. campestris I He Y T et al. (2004)[20] AY448030
SLG3 B. oleracea I Delorme V et al. (1995)[21] X79431
SLG5 B. oleracea II Kusaba M et al. (1997)[6] D88766
SLG8 B. oleracea I Sato K et al. (2002)[22] AB054727
SLG12 B. oleracea I Kusaba M et al. (1997)[6] D85201
SLG13 B. oleracea I Dwyer K G et al. (1991)[17] X55275
SLG14 B. oleracea I Kusaba M et al. (1997)[6] D85228
SLG22 B. oleracea I Kusaba M et al. (1997)[6] D85229
SLG29 B. oleracea I Trick M & Flavell R B (1989)[23] X16123
SLG32 B. oleracea I Kusaba M et al. (1997)[6] D88765
SLG52 B. oleracea I Kusaba M et al. (1997)[6] D85210
SLG60 B. oleracea I Suzuki T et al. (2000)[24] AB032472
SLG63 B. oleracea I Kusaba M et al. (1997)[6] D85211
SLG64 B. oleracea I Kusaba M et al. (1997)[6] D85212
SC1300 B．napus I He Y T et al. (2004)[20] AY448036
SI1300 B．napus I He Y T et al. (2004)[20] AY448032
SI271 B．napus I He Y T et al. (2004)[20] AY448034
SLG-Ws-1 B．napus I Robert L S et al. (1994)[25] Z21608
SLG-AtPP-A14 B．napus I Cui Y et al. (1999)[26] AJ245480
SLG type II B．napus II Robert L S et al. (1994)[25] Z19548

的约 1.3 kb 帯的特异 (图 2)。其中, 国内收集的 8个
材料中, 只有沪油 16、浙双 72和 H5200 3个材料中
能扩出 class I SLG基因, 而国外收集的 6个材料(来
自欧洲)中都扩出了 class I SLG基 帯因的特异 。
2.2 序列比较分析
对甘蓝型油菜中扩出的部分特异片段进行回
收、测序, 并根据所用 DNA模板材料及所用引物组
合对所得序列编号, 将用引物 PS5+PS15从 P1、P2、
第 5期 柯丽萍等: 甘蓝型油菜 SLG基因片段的克隆及序列分析 767


P3、P5 和 P7 中扩出片段的序列依次记为 PSI-1、
PSI-2、PSI-3、PSI-5和 PSI-7; 依次类推, 将引物组
合 PS3+PS21扩出片段的序列记为 PSII-2、PSII-3、
PSII-4、PSII-6、PSII-7、PSII-8和 PSII-10。用 DNAStar
软件的MegAlign分析, 并根据序列同源性进行聚类
(图 3)。PSI-1、PSI-2、PSI-3、PSI-5和 PSI-7之间同
源性在 98.7%~99.9%之间, 聚在同一类中; PSII-2、



图 1 引物组合 PS3+PS21和 PS5+PS15分别对甘蓝型油菜
P1~P10的 PCR扩增
Fig. 1 PCR analysis of Brassica napus P1–P10 with primer
combinations of PS3+PS21 and PS5+PS15
a：引物 PS3+PS21对 P1~P10扩增结果, 目标片段为 1.0 kb左右;
b：引物 PS5+PS15对 P1~P10扩增结果, 目标片段为 1.3 kb左右。
M：DNA ladder; 1~10：分别对应甘蓝型油菜 P1到 P10。
a: PCR analysis of P1–P10 with primers of PS3 + PS21, the targets
were about 1.0 kb; b: PCR analysis of P1–P10 with primers of PS5
+ PS15, the targets were about 1.3 kb. M: 1 kb DNA ladder; 1–10:
Brassica napus P1 to P10, respectively.



图 2 引物组合 PS5+PS15和 PS3+PS21分别对 14个国内外油
菜栽培种的 PCR扩增
Fig. 2 PCR analysis of 14 Brassica napus varieties from all
over the world with primer combinations of PS5 + PS15 and
PS3 + PS21
M：1 kb DNA ladder; 1：秦优 7号; 2：浙双 6号; 3：高油 605; 4：
沪油 16; 5：浙双 72; 6：宁 RS-1; 7：H5200; 8：宁油 7号; 9：Tapidor;
10：Darmor; 11：Darmor MX; 12：Mardrigal; 13：Courage; 14：
Cambrra。上排为引物 PS5+PS15扩增结果, 目标片段为 1.3 kb
左右; 下排为引物 PS3+PS21扩增结果, 目标片段为 1.0 kb左右。
M: 1 kb DNA ladder; 1: Qinyou 7; 2: Zheshuang 6; 3: Gaoyou 605;
4: Huyou 16; 5: Zheshuang 72; 6: Ning RS-1; 7: H5200; 8: Ningyou
7; 9: Tapidor; 10: Darmor; 11: Darmor MX; 12: Mardrigal; 13:
Courage; 14: Cambrra. Above half of the panel is for PCR analysis
with primers of PS5 + PS15, the targets were about 1.3 kb; the
lower half is that with primers of PS3 + PS21, the targets were
about 1.0 kb.



图 3 PCR扩增产物之间的序列同源性比较聚类图
Fig. 3 Clustering schemes of the sequences from the PCR
products

PSII-3、PSII-4、PSII-6、PSII-7、PSII-8 和 PSII-10
之间同源性在 91.5%~99.8%之间, 聚在同一类中。这
两类序列之间的同源性在 62%~63%之间。PSI-1、
PSI-2、PSI-3、PSI-5和 PSI-7的序列长度均为 1 340
bp 左右, 而第二类扩增产物中, PSII-6、PSII-7 和
PSII-8这 3个片段大小为 1 013 bp, PSII-2、PSII-3、
PSII-4和 PSII-10为 1 025 bp。
将这些序列提交到 NCBI进行 BLAST检索, 发
现与其同源性很高的片段都是与自交不亲和位点相
关的基因, 包括 SRK 和 SLG 基因, 进一步说明我们
分离到的片段是 S位点 SLG基因的片段。将这些序
列与部分已经克隆并分类的 SLG 序列一起输入
DNAStar 的 MegAlign 中进行聚类分析。结果显示,
所有序列聚为两类, 其中, 用特异引物 PS5＋PS15
扩出的片段都与 class I SLG基因聚为一类, 而用特
异引物 PS3＋PS21扩出的片段都与 class II SLG基因
聚为一类(图 4)。进一步用 NCBI 的 BLAST 分析表
明, 与扩出的 class I SLG基因同源性最高的片段为
来自自交亲和的甘蓝型油菜 Westar 的 SLG-Ws-1 基
因, 相似性为 98.3%~99.7%。
2.3 氨基酸序列比较分析
将这些序列的蛋白质一级结构进行氨基酸比较,
第二类 SLG 序列与 SLG60 的氨基酸序列保守性在
87.3%~92.1%之间, 虽然没有分离到完整的 class II
SLG 基因, 但在已有序列中都存在前面的 5 个半光
氨酸残基, 而且氨基酸序列保守性很强。对它们的
二级结构分析发现, 同在自交不亲和材料中分离到
的 SLG 基因序列一样, 这些序列也具有 3 个保守的
结构域, 即均具有B-凝集素结构域(B-lectin Domain,
Bulb-type mannose-specific lectin)、SLG结构域(SLG
Domain)和 PAN-AP 结构域 (PAN-AP domain, Ap-
ple-like domain)。由此推测, 在能扩增出目标片段的
材料中都存在完整的有功能的 SLG基因。
768 作 物 学 报 第 34卷



图 4 甘蓝型油菜中扩增所得 SLG序列与部分 NCBI中已知 SLG序列同源性比较聚类图
Fig. 4 Clustering scheme of the sequences from the PCR products and the part of the SLGs known in NCBI

3 讨论
本研究初步说明 10个材料中都含有第二类 S基
因, 其中 5 个同时还存在第一类 S 基因。14 个来自
国内外不同地方的甘蓝型油菜栽培种也得到类似结
果。进一步的比较分析证明甘蓝型油菜中分离到的
序列是芸薹属中 S位点 SLG基因。值得关注的是, 所
有甘蓝型油菜中得到的 I类 SLG基因(class I SLG)之
间的同源性极高, 其相互之间的同源性明显高于不
同自交不亲和 S 位点复等位基因之间的同源性。由
此推测, 具有 I类 SLG基因(class I SLG)的甘蓝型油
菜的 S 位点可能来源于同一个自交不亲和的二倍体
供体。那么, 对甘蓝型油菜中 class II SLG基因的起
源也可以做此推测, 只是由于 class II SLG基因不同
复等位基因之间本身同源性较高, 很难仅从序列同
源性程度上下结论。
所有甘蓝型油菜中都存在第二类 S 位点基因,
部分材料中同时存在两类 S 位点基因的结果表明在
甘蓝型油菜中, 两类 S 基因同时存在, 即在异源四
倍体的甘蓝型油菜的两个同源性位点上同时存在 S
位点。可以推测, 甘蓝型油菜的自交不亲和位点有
两种起源, 其一是两个具有 class II S位点的二倍体
杂交后自然加倍; 其二是一个具有 class I S 位点的
二倍体和一个具有 class II S位点的二倍体杂交后自
然加倍。经过这一自然演变过程, 形成了自交亲和
的异源四倍体甘蓝型油菜。因此, 在自然演变过程
中, 由于同源重组等因素干扰, 自交亲和识别过程
中功能基因发生突变、沉默, 最终导致基因失活, 致
使由两个自交不亲和种复合而成的甘蓝型油菜出现
自交亲和的特性。
4 结论
甘蓝型油菜中普遍存在芸薹属自交不亲和物种中
的 S位点基因, 有的同时具有两类 S位点基因, 有的只
第 5期 柯丽萍等: 甘蓝型油菜 SLG基因片段的克隆及序列分析 769


具有第二类 S 位点基因。虽然目前还不清楚甘蓝型油
菜的自交亲和特性是如何形成的, 但本研究为进一步
分析其自交亲和性发生机理的研究奠定了基础。
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