全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(8): 14061414 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31071361)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 马凤鸣, E-mail: Fengming_ma@sohu.com, Tel: 0451-55191947
第一作者联系方式: E-mail: shixiaoyan1@163.com
Received(收稿日期): 2010-12-06; Accepted(接受日期): 2011-03-26; Published online(网络出版日期): 2011-05-12.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110512.1818.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01406
甜菜亚硝酸还原酶(NiR)基因的克隆与表达分析
石晓艳 曾彦达 李世龙 王玉波 马凤鸣* 刁志伟
东北农业大学农学院, 黑龙江哈尔滨 150030
摘 要: 以甜菜品种甜研 7号叶片的 cDNA为模板, 采用 RT-PCR和 3′/5′RACE技术, 获得了编码亚硝酸还原酶基因
(NiR)的 cDNA全序列 2 014 bp, 包含有 1 830 bp的开放阅读框, 编码 599个氨基酸。所推导的氨基酸序列与菠菜及
拟南芥 NiR编码的氨基酸序列均具 93%的同源性。生物信息学分析表明, 甜菜 NiR具有完整的 NiR蛋白结构, 含血
红素蛋白 β-化合物区域和 4Fe-4S区域, 并利用分析软件预测其三维结构。实时荧光定量结果显示, 在以 0、10、20、
30、40、50、80和 160 mmol L–1 NO3–-N处理 72 h的试验中, 50 mmol L–1处理可使甜菜 NiR的表达量达到最大; 以 0、
2、4、8、16、32、64和 128 mmol L–1 NH4+-N处理 48 h的试验表明, 8 mmol L–1和 64 mmol L–1处理条件下甜菜 NiR
表达量相对较高。硝态氮和铵态氮不同配比处理 48 h的试验中, NO3–-N和 NH4+-N比例为 80∶20可使甜菜 NiR的表
达量达到最大; 在氮素诱导的基础上, 蛋白抑制剂放线菌酮处理 9 h, 随着处理浓度的增大, NiR 的表达量逐渐下降;
不同浓度 NO2–处理的试验中, 40 mmol L–1处理下 NiR的表达量最大。
关键词: 甜菜; 亚硝酸还原酶; cDNA; 克隆; 基因表达
Molecular Cloning and Characterization of Nitrite Reductase Gene from
Sugarbeet
SHI Xiao-Yan, ZENG Yan-Da, LI Shi-Long,WANG Yu-Bo, MA Feng-Ming*, and DIAO Zhi-Wei
College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: The nitrite reductase (NiR) gene was cloned using RT-PCR and 3′/5′RACE techniques. The cDNA of NiR gene isolated
from sugarbeet was 2 014 bp containing a 1 830 bp opening-reading frame (ORF), encoding 599 amino acids. Further comparison
showed that NiR gene had high homology to both of Spinacia oleracea NiR gene and Arabidopsis thaliana NiR gene, which was
93%. The predicted NiR protein found to have a hemoprotein beta-component (ferrodoxin-like), and 4Fe-4S region, its 3D struc-
ture was predicted by analysis software. Real time PCR analysis showed that when using 0, 10, 20, 30, 40, 50, 80, and 160 mmol
L–1 NO3–-N treated for 72 hours, the expression of NiR gene was the highest at 50 mmol L–1; when using 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, and
128 mmol L–1 NH4+-N treated for 48 hours, the expression of NiR gene showed two peaks at 8 mmol L–1 and 64 mmol L–1, re-
spectively. Furthermore, in experiments treated with different ratios of NO3–-N to NH4+-N for 48 h, the expression of NiR gene
was the highest when the ratio was 80:20. Cycloheximide 9 h treatment experiments showed that NiR gene expression decreased
with increasing the treating concentration. NO2– treatments indicated that the maximum expression of NiR gene was induced by
40 mmol L–1 NO2–.
Keywords: Sugarbeet; Nitrite reductase; cDNA; Cloning; Gene expression
作物初级氮素同化包括 NO3–的无机同化和
NH4+的有机同化 2个步骤: (1) NO3–被硝酸还原酶还
原为 NO2–、NO2–被亚硝酸还原酶还原为 NH4+[1]; (2)
NH4+再被谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶(GS/GOGAT)
同化为谷氨酰胺(Gln)和谷氨酸(Glu)。硝态氮(NO3–)
是旱田作物可利用氮素的主要形式, NR是NO3–无机
同化的限速酶, 亚硝酸还原酶(nitrite reductase, NiR)
是氮素同化途径的关键控制酶, 两者偶联完成 NO3–
的无机同化[2]。与 NR相比较, 有关 NiR研究尚少[3]。
前人研究表明, 细胞色素 C 亚硝酸还原酶(ccNiR)在
氮素循环中起着关键的作用[4]。Kato 等[5]研究表明,
烟草具有 4个 NiR基因, nii1、nii2、nii3和 nii4。关
第 8期 石晓艳等: 甜菜亚硝酸还原酶基因(NiR)的克隆与表达分析 1407


于拟南芥根中硝酸盐诱导的试验表明, 在氮饥饿的
状态下 , 随着硝酸盐量的增加 , 亚硝酸还原酶
mRNA有较高的表达水平[6]。
陈卫平等[7]利用 NaNO2和 FeSO4去离子水培养
稻苗, 以研究NO2–和 Fe2+对亚硝酸还原酶(NiR)活性
的影响。王玉琴等[8]认为小麦黄化幼苗叶片的亚硝
酸还原酶是诱导酶, 其活力受光照、诱导物浓度、
pH、苗龄、激素等内、外因素的影响。1962 年
Hayeman 和 Cressvell[3]从南瓜叶中分离出 NiR 酶,
1988年在玉米中 NiR基因被克隆和鉴定[9]。虽然在
玉米、菠菜、烟草、水稻、豌豆、拟南芥等高等植
物中已克隆了 NiR基因, 但是做全序列分析的很少,
关于甜菜亚硝酸还原酶的研究亦较少, 且关于甜菜
亚硝酸还原酶结构和特性研究鲜有报道。
本研究从甜菜(Beta vulgaris L.)中克隆了甜菜亚
硝酸还原酶基因 NiR 的全长 cDNA, 对其核苷酸和
氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析。并通过
RT-PCR 法, 在转录水平上研究该基因在 NO3–-N 和
NH4+-N 两种不同形态氮素条件下以及 NO3–-N 和
NH4+-N分别处理不同浓度下的表达变化; 另外在氮素
诱导的基础上, 设置不同浓度蛋白抑制剂放线菌酮处
理, 以及 NO2–处理, 研究甜菜 NiR 基因的表达, 在分
子水平上揭示氮素条件和甜菜 NiR基因表达的关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甜菜品种为黑龙江省主栽二倍体纯系品种甜研
7号(Ty 7), 种子由哈尔滨工业大学甜菜糖业研究所
提供。将甜菜种子在室温下浸种过夜, 于培养皿中
25℃恒温催芽 24~48 h, 接着移至装土的营养钵中室
内培养 , 将长到 2~4 对真叶时的幼苗作为提取总
RNA的试验材料。
1.1.1 不同形态硝态氮和铵态氮以及氮素配比下甜
菜 NiR的基因表达分析 将甜菜种子播于直径 15
cm 的营养钵中, 每钵 5 粒, 室温土培, 待二叶一心时
移至营养液中培养。营养液配方以 Hoagland营养液配
方为基础, 略加改进, 即: 4.02 mmol L–1 Ca(NO3)2·
4H2O、1.99 mmol L–1 Mg2SO4·7H2O、6.03 mmol L–1
KNO3、1.75 mmol L–1 (NH4)2SO4、1.03 mmol L–1
KH2PO4、0.15 mmol L–1 EDTA-Fe、1.0×10–3 mmol L–1
H3BO3、1.0×10–3 mmol L–1 MnCl2·4H2O、1.0×10–3
mmol L–1 ZnSO4·7H2O、1.0×10–4 mmol L–1 CuSO4·
5H2O、5.0×10–6 mmol L–1 (NH4)6MoO7O24·4H2O。全
营养液培养 7 h 后, 将幼苗放转到含不同氮素的营
养液中培养, 其中NO3–以 Ca(NO3)2和KNO3为氮源,
NH4+以(NH4+)2SO4 为氮源。为保持营养液总氮量相
同 , 均为 7 mmol L–1, 铵态氮营养液配方中去掉
Ca(NO3)2·4H2O 和 KNO3, 以 (NH4)2SO4 作为氮源 ,
并以 CaCl2 和 KCl 补足营养液中 Ca2+和 K+的量,
NH4+-N分别为 0、2、4、8、16、32、64和 128 mmol
L–1, 取处理后 72 h的甜菜幼叶作为试验材料; 硝态
氮营养液中, NO3–-N分别为 0、10、20、30、40、50、
80和 160 mmol L–1, 取处理后 48 h的甜菜幼叶作为
试验材料 ; 不同氮素配比的营养液中 , NO3–-N∶
NH4+-N 为 0∶0、120∶0、100∶10、80∶20、50∶
50、20∶80、10∶100和 0∶120, 处理后 48 h的甜
菜幼叶作为试验材料, 在条件一致的光照培养箱(光
照约 36 μmol m–2 s–1, 温度 25℃)中取样。为了维持
营养液中浓度及离子平衡, 用 4%的硝酸-磷酸混合
液(1∶20)调节 pH值至 7.0左右。在上述氮素处理中
均设置不同的时间梯度, 以测定 NiR 酶活力, 选择
NiR 活力表现最佳的时间, 取样进行基因表达的分
析, 不同处理对照样品均在不加相应氮源的营养液
中培养, 样品采集后立即置液氮中速冻, 并于–80℃
冰箱中保存用于总 RNA的提取。
1.1.2 在选择的最佳氮素条件诱导后, 不同浓度的
核酸合成抑制剂放线菌酮以及NO2–对甜菜NiR基因
表达的影响分析 将甜菜种子播于直径 15 cm的
营养钵中, 每钵 5粒, 室温土培, 待到二叶一心时开
始营养液处理。营养液配方以 Hoagland营养液为基
础, 并加以改进使营养液 NO3–-N∶NH4+-N 的比例
约为 4∶1, 分别设放线菌酮的浓度为 0 μmol L–1(对
照浓度), 1、4、8、12和 16 μmol L–1, 取处理 9 h的
甜菜幼叶作为试验材料; NO2–浓度分别为 0 mmol
L–1 (对照浓度)、5、10、20、40、80、160和 320 mmol
L–1, 取处理 24 h 的甜菜幼苗作为试验材料。用
NO3–-N∶NH4+-N ≈ 4∶1的 Hoagland营养液培养甜
菜幼苗 7 d 后, 再把幼苗放到含不同浓度的处理营
养液中培养, 在条件一致的光照培养箱(光照约 36
μmol m–2 s–1, 温度 25℃)中取样。每种处理设置不同
的时间梯度, 进行 NiR 酶活力的测定, 选择 NiR 活
力表现最佳的时间, 取样进行基因表达的分析。样
品采集后立即置液氮中速冻 , 并于–80℃冰箱中保
存用于总 RNA的提取。
1.2 主要试验试剂
使用 Invitrogen公司的 Trizol, E. coli感受态细
1408 作 物 学 报 第 37卷

胞 JM109、pMDl8-T载体、反转录酶、Taq DNA聚
合酶、LA Taq DNA聚合酶、3′-RACE试剂盒、5′-
RACE 试剂盒、PrimeScript RT reagent Kit Perfect
Real Time、SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real- time)、
RNaseA, DNaseI、dNTPmix, RNase 抑制剂、DNA
Marker (DL 2000, DL 5000, DL15000)、胶回收纯化
试剂盒、质粒提取试剂盒均购自大连宝生物有限公
司, DEPC为 Sigma公司, 引物经 Primer 5.0软件设
计, 其他试剂均为分析纯。
1.3 甜菜总 RNA 的提取和鉴定以及 cDNA 第 1
链的合成
按 Trizol Reagent (Invitrogen)公 司 提 供 的
TRIZOL (Invitrogen, Rockville MD)试剂盒说明书提
取总 RNA,参照 DNaseI 说明书对所提取的总 RNA
进行纯化, 采用紫外分光光度计(Beckman, DU640)
测定样品 OD260、OD280和 OD310下的紫外吸收值, 分
析 RNA的纯度(纯度: OD260/OD280)。
RNA 浓度(μg mL–1)=(OD260–OD310)×稀释倍数
×40 μg mL–1;
OD260/OD280 的比值若为 2.0, 这是一个理想值,
表明无杂质的污染, 我们在实验中要求比值必须达
到 1.85~2.00 之间为最佳。利用 1.0%琼脂糖凝胶电
泳检测总 RNA的完整性[10]。参照反转录酶的使用说
明书反转录合成 cDNA的第一链。
1.4 RACE 方法对已知序列的两端未知区域进
行扩增
根据已知甜菜 NiR基因组 DNA片段(AF173663),
与已知同属藜科的菠菜 NiR mRNA(X07568)进行比
对后在保守区设计上游及下游引物, 上游 outer: 5′-
TTCCGATTTCCAGTCCCATAGA-3′, 上游 inner: 5′-
CTTACAATGATGTTTGCGACGG-3′, 下游 outer: 5-
TCTATGGGACTGGAAATCGGAAT-3′, 下游 inner: 5′-
AGATGGGAGATTTATGATGAGGC-3′, 参照 TaKaRa
的 3′-RACE 及 5′-RACE 说明书, 采用巢式 PCR, 反
应体系均为 50 μL。上游区域的扩增, 首先将甜菜总
RNA 进行去磷酸化及去帽子反应, 然后用 5′-RACE
Adaptor 进行连接反应, 反转录后, 进行 outer PCR
及 inner PCR 反应, 退火温度分别为 53℃和 58℃,
循环数分别为 20 和 25; 下游区域的扩增, 先将总
RNA反转录合成加尾的 cDNA, 然后进行 outer PCR
及 inner PCR反应, 退火温度分别为 53℃和 58℃, 30
个循环。PCR产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测, 回
收产物, 进行载体的连接与转化, 挑取阳性重组克
隆, 由北京六合华大基因股份有限公司测序。
1.5 中间序列的克隆
根据 RACE方法得到的 5′端及 3′端的 NiR片段
设计引物 , 克隆 5′端及 3′端的中间片段。SP: 5′-
AGTGAACTTGCTTCTTTATCTATGG-3′, AP: 5′-TG
CGAAATAAGGTTGGTAAAAGGGC-3′进行 PCR 扩
增,退火温度为 59℃, 30个循环。反应产物用 1.0%琼
脂糖凝胶电泳检测。用胶回收纯化试剂盒回收 PCR
产物, 纯化产物与 pMDl8-T 载体进行连接反应, 转
化 JM109 感受态细胞, 蓝白斑筛选后, 挑取阳性重
组克隆, 由北京六合华大基因股份有限公司测序。
1.6 NiR基因 cDNA全长序列的克隆
设计编码区两端的引物, 上游为 5′-TAGAACT
GTAGGAGAAACAATGGCT-3′, 下游为 5′-GAAGC
AAAAGAACACAAAGCAAATA-3′, 进行 cDNA 全
长的克隆。PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,
回收产物, 进行载体的连接与转化, 挑取阳性重组
克隆, 由北京六合华大基因股份有限公司测序。
1.7 蛋白质的结构特征分析
利用在线分析软件进行蛋白质的序列特征分
析。将甜菜 NiR 的氨基酸序列提交 http://geno3d-
pbil.ibcp.fr/ cgi-bin/geno3d_automat.pl.page=/GENO3D/
geno3d_home.html预测其三级结构, 用 Rasmol2. 7.2
查看 NiR三级结构。
1.8 实时荧光定量 PCR反应
采用实时定量 PCR法对甜菜NiR基因的表达进
行分析。内标基因选用甜菜 GAPDH基因, 引物为正
向 5′-GTTGGAACACGGAAAGCC-3′和反向 5′-AC
TGGAGAGGTGGAAGG-3′, PCR 产物长度为 126
bp。目的基因 NiR的引物为正向 5′-TGATGTTTGCGA
CGGTGA-3′和反向 5′-AGTGAACTTGCTTCTTTAT
CTATGG-3′, PCR 产物长度为 92 bp。引物均委托
Invitrogen公司设计并合成。
试验在东北农业大学农学院 LightCycler 2.0
PCR仪(Roche公司)上进行。采用 ΔΔCt法进行基因
相对表达分析[11], 检测甜菜 NiR 基因的表达, 以对
照中基因的表达作为标准, 数值设为 1, 其余样本为
相对于标准 1 的相对表达值, 每个样品设置 2 次重
复。使用 TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex Taq试剂
盒, 按照操作说明进行。反应体系为 20 μL反应混合
物, 每个引物最终浓度为 10 μmol L–1。热启动程序
为 95℃变性 30 s; 扩增条件为 95℃ 5 s, 60℃ 20 s,
共 40个循环。每个样品设 2次重复, 用 LightCycler
Software 4.1 (Roche公司)和 Microsoft Excel软件分
析试验数据。
第 8期 石晓艳等: 甜菜亚硝酸还原酶基因(NiR)的克隆与表达分析 1409


2 结果与分析
2.1 甜菜总 RNA的提取及目的片段的获得
采用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性。电
泳槽经 H2O2处理, 电泳所用缓冲液为 1×TAE (DEPC-
H2O 配制), 从琼脂糖凝胶的图谱(图 1-A)可见 28S 和
18S RNA两者的亮度比约为 2∶1, 还可见 5S RNA
条带, 表明 RNA基本无降解, 无蛋白质污染。
2.2 片段两端未知区域的扩增
由于首轮 PCR 扩增产物的量较少, 没有显现明
显的条带, 取 1 μL outer PCR 反应液, 经 5′-RACE
inner primer 和 inner AP 巢式扩增 , 电泳检测到
cDNA 5′端的扩增条带(图 1-B)。参照 3′-RACE试剂
盒, 经引物对 3′-RACE outer primer和 outer AP扩增
得到 cDNA-3′端, 首轮 PCR扩增的产物显现出条带,
但特异性不强, 以 1 μL outer PCR产物作为 inner PCR
反应的模板, 经 3′-RACE inner primer和 inner AP巢式
扩增, 电泳检测到 cDNA 3′端的扩增条带(图 1-C)。
2.3 中间片段的获得
将已得到的甜菜 NiR cDNA的序列(cDNA 5′端,
cDNA 3′端), 运用 DNAMAN6.0进行序列拼接分析,
发现中间序列缺失。然后运用 Primer Premier 5.0引
物设计软件, 重新设计缺失片段的引物, 扩增得到
甜菜 NiR cDNA的中间片段(图 1-D)。
2.4 NiR基因全长的克隆
将得到的 RACE 产物及克隆的中间片段进行序
列拼接分析, 将拼接结果在 NCBI 网站进行相似性
比较及开放阅读框(ORF)分析 , 发现该序列具有完
整的读码框, 将编码的蛋白进行同源分析后, 发现
推测的蛋白含有 NiR 所有的功能域。因此可推测已
得到 NiR的 cDNA全长序列。扩增得到甜菜 NiR的
全长 cDNA (图 1-E)。将所得的 PCR 产物回收纯化
后克隆至 pMDl8-T Vector (TaKaRa), 转化大肠杆菌
JM109, 挑取阳性克隆, 提取质粒, 经酶切鉴定后送
北京六合华大基因股份有限公司测序(图 2), GenBank
登录号为 HQ224499。
2.5 序列特征分析
2.5.1 蛋白质的理化特性分析 利用在线分析软
件 http://bioweb.pasteur.fr/intro-uk.html, 根据新基因
所编码的蛋白质的一级序列进行了疏水性作图(图
3)。横坐标为蛋白质中氨基酸残基的序号, 纵坐标为
残基的亲水一疏水的特性, 正值为疏水, 负值为亲
水 , 疏水性较高的肽段处于蛋白质内部 , 反之 , 亲



图 1 甜菜总 RNA电泳图及 NiR基因的扩增结果
Fig. 1 Total RNA isolated from sugarbeet and electrophoresis results of NiR gene
A: 甜菜总 RNA电泳图; B: cDNA 5′端的 inner PCR电泳图(M: DL2000 marker; 1~3: cDNA 5′端的 inner PCR结果); C: cDNA 3′端的 inner
PCR电泳图(M: DL5000 marker; 1~4: cDNA 3′端的 inner PCR结果); D: 中间片段的 PCR电泳图(M: DL2000 marker; 1: 中间片段 PCR
结果); E: cDNA全长的 PCR电泳图(M: DL5000 marker; 1~3: cDNA全长的 PCR结果)。
A: Total RNA isolated from sugarbeet; B: Electrophoresis result of cDNA 5′ end by inner PCR (M: DL2000 marker; 1–3: inner PCR of cDNA
5′ end); C: Electrophoresis result of cDNA 3′ end by inner PCR (M: DL5000 marker; 1–4: inner PCR of cDNA 3′ end); D: Electrophoresis
result of intermediate part (M: DL2000 marker; 1: PCR of intermediate part); E: Electrophoresis result of complete cDNA by PCR (M:
DL5000 marker; 1–3: PCR of complete cDNA).
1410 作 物 学 报 第 37卷



图 2 甜菜 NiR基因的核苷酸序列和推测的编码氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide sequences and putative amino acid sequences of cDNA of B. vulgaris NiR



图 3 用 TopPred分析 NiR的疏水曲线
Fig. 3 Hydrophobicity profile of NiR by TopPred

水性较高的肽段处于蛋白质分子的表面。从图 3 可
明显看出, 甜菜 NiR 是易溶、亲水性强的蛋白。另
外, 由图 3 可推测蛋白质含有跨膜的肽段。这是因
为, 跨膜的肽段几乎都是疏水肽段, 因此在 C 端可
能存在跨膜区域。
2.5.2 ORF 和结构域分析 将克隆得到的 NiR
cDNA基因序列(长度为 2 014 bp), 进行 ORF分析, 发
现编码区全长为 1 830 bp, 共编码 599个氨基酸残基。
利用 SWISS MODEL (http://swissmodel.expasy.
org/)分析甜菜 NiR的蛋白结构域[12-13](图 4)。结果表
明, 所推导的氨基酸序列具有完整 NiR 结构, 含血
红素蛋白 β-化合物区域(hemoprotein beta-component,
ferrodoxin-like, Domain: 氨基酸 133~203, 氨基酸
392~461), 4Fe-4S区域(4Fe-4S region, Domain: 氨基
酸 211~371, 氨基酸 517~580)。
2.5.3 信号肽分析 利用在线分析软件 http://
www.cbs.dtu.dk/services/SignalP, 对其进行信号肽分
析 , 有助于蛋白质功能域的区分及蛋白质细胞定
位。SignalP 根据信号肽序列特征, 对于一个典型的
信号肽, C值和 Y值趋向于+1, S值在剪切位点之前
高而在剪切后变低。通过图 5 可更直观分析氨基酸



图 4 NiR的蛋白结构域
Fig. 4 Protein domain in NiR protein
第 8期 石晓艳等: 甜菜亚硝酸还原酶基因(NiR)的克隆与表达分析 1411


的 Score, 可知甜菜 NiR 的分值曲线非常不典型, N
端氨基酸的得分都比较低, 由此可认为甜菜 NiR 没
有信号肽, 是非分泌型蛋白。
2.5.4 活性位点分析 运用在线分析软件 http://
au.expasy.org/prosite/, 得出甜菜 NiR 氨基酸序列的
517~533 区域的 TGCpnsCgqvqvaDIGF 为 NiR 的活
性位点(图 6)。
2.5.5 同源性比较分析和二级结构的分析 运用
BLASTp分析, 由甜菜 NiR基因 cDNA序列推测的
NiR氨基酸序列与其他植物 NiR氨基酸序列进行同
源性比较。甜菜 NiR的氨基酸序列与菠菜和拟南芥
的 NiR 氨基酸序列同源性较高, 均达到 93%, 利用
SWISS MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)对甜
菜 NiR 进行二级结构的预测表明, 甜菜 NiR 由 211
个螺旋、88个延伸链和 300个自由卷曲连接。
2.5.6 三级结构的分析 将所推测的甜菜NiR蛋白
序列提交后, 采用首选模式, 经过序列相似性和对已
有的三维结构数据库搜索, 选择程序搜索到的第一个
模板, 以这一蛋白结构作为模板进行 Geno3D模建(图
7)。全长 cDNA 基因编码产物的 3D 结构包括 352 个
H-bonds; 21个 Helices; 30处 Strands; 66个 Turns。这
样的结构与酶功能区域的关系还有待进一步研究。



图 5 NiR的信号肽分析
Fig. 5 Signal peptide prediction in NiR




图 6 甜菜 NiR蛋白的活性位点分析
Fig. 6 Active site analysis of NiR



图 7 甜菜 NiR的三维结构分析
Fig. 7 3D structure search of NiR
2.6 不同处理对 NiR基因表达的影响
从图 8 中可以看出, 随着 NH4+-N 浓度的增加,
NiR基因的表达整体出现一个下降的趋势, 但是在 8
mmol L–1和 64 mmol L–1的处理条件下, 出现两个高
峰, 分别比对照高出 55%和 41%, 其余处理均低于
对照。植物的主要氮源是 NH4+和 NO3–, NO3–进入体内
后必须还原为 NH4+才能参与氨基酸、蛋白质的合成。
在下式中 ,     亚硝酸还原酶硝酸还原酶 23 NONO
谷氨酸谷氨酰胺 谷氨酸合成酶谷氨酰胺合成酶   4NH , 高
NH4+-N抑制NR的表达, 但是促进GS的表达, 当硝
态氮的浓度过高时 , 为了维持植物体代谢的平衡 ,
1412 作 物 学 报 第 37卷

NiR的表达会增强, 以减少 NO2–对细胞的毒害作用,
从而体现 NiR 是氮素代谢的控制酶作用。之后在一
个相对平衡的条件下, 随铵态氮浓度的增加, NiR的
表达会逐渐降低, 当铵态氮浓度继续增大时, NiR的
表达增强, 从而使整个代谢达到平衡。
由图 9可见, 随着NO3–-N处理浓度的增大, NiR
的表达量逐渐增大, 在 50 mmol L–1处理的条件下,
NiR 的表达出现一个高峰, 是对照的 7.11 倍。之后
呈现下降的趋势。表明硝态氮可以促进 NiR的表达,
但是硝态氮的浓度超过一定的水平, 将会抑制 NiR
的表达。



图 8 不同 NH4-N浓度对甜菜 NiR基因表达的影响
Fig. 8 Effect of NH4+-N concentration on NiR expression in the
sugarbeet



图 9 不同 NO3–-N浓度对甜菜 NiR基因表达的影响
Fig. 9 Effect of NO3-N concentration on NiR expression in the
sugarbeet

如图 10, 在 NO3–-N∶NH4+-N为 80∶20的处理
下 , NiR 的表达量最大 , 为对照的 2.85 倍 , 在
NO3–-N∶NH4+-N 为 50∶50 的处理下 , 为对照的
1.21倍, 在 120∶0和 100∶10的处理下分别为对照
的 1.10 倍和 1.08 倍。整个趋势为 80∶20>50∶
50>120∶0>100∶10>0∶120>20∶80>10∶100, 表
明硝态氮比例较高的混合态氮较铵态氮比例较高的
混合态氮及单态氮更能促进 NiR 的表达, 而单硝态
氮较单铵态氮更能促进 NiR基因的表达。


图 10 不同氮素配比处理下对甜菜 NiR基因表达的影响
Fig. 10 Effect of different nitrogen forms and ratios on NiR
expression in the sugarbeet

由图 11可见, 在 NO2–为 40 mmol L–1时, NiR的
表达达到一个高峰, 为对照的 2.35 倍。在此之前,
NiR 的表达量变化无明显的规律 , 但均低于对照 ,
在 20 mmol L–1处理的条件下, 比对照下降了 89%,
在高峰之后呈现逐渐下降的趋势, 320 mmol L–1处理
时, 是对照的 0.26倍。
由图 12 可见, 随着放线菌酮浓度的增大, NiR
的表达逐渐下降, 说明蛋白质抑制剂放线菌酮可以
抑制 NiR 的表达。不同浓度的放线菌酮处理后, 分
别比对照下降了 15%、20%、43%、59%和 68%。



图 11 不同 NO2浓度对甜菜 NiR基因表达的影响
Fig. 11 Effect of NO2– concentration on NiR expression in the
sugarbeet



图 12 不同放线菌酮浓度对甜菜 NiR基因表达的影响
Fig. 12 Effect of cycloheximide concentration on NiR expres-
sion in the sugarbeet
第 8期 石晓艳等: 甜菜亚硝酸还原酶基因(NiR)的克隆与表达分析 1413


3 讨论
亚硝酸还原酶是植物硝态氮同化过程中一个十
分重要的酶 , 该酶催化 NO2–还原为 NH4+, 以
NADPH 为电子供体, 在白色体中完成, 在硝酸盐降
解生成铵这一过程中起着承前启后的作用[14]。硝酸
盐经生物转化生成亚硝酸盐等产物, 降低血液的载
氧能力, 导致高铁血红蛋白血症 [15]; 亚硝酸盐还可
与人体中次级胺(仲胺、叔胺、氨基酸)反应, 在胃腔
中(pH 3.0)形成强力致癌物——亚硝胺, 从而诱发消
化系统癌变[16]。甜菜具有极高的 NO3–还原潜力, 外
源基质对甜菜硝酸还原酶的刺激强度随施氮量增加
而下降[17], 甜菜 NiR活性受体内生理因素和 NO3–可
利用强度的限制[18]。
大多栽培糖甜菜是高度杂合的多倍体, 我们选
择二倍体纯系甜研 7 号为试验材料, 可以适合甜菜
基因克隆的需要。目前已有不少植物 RNA的提取方
法, 包括异氰硫酸胍法[19]、热酚法[20]、SDS-酸酚提
取法[21], 这些方法用苯酚或者异氰硫酸肌来变性、
去除蛋白质和抑制 RNase 活性, 已成功地用于拟南
芥[22]和小麦[19]等的 RNA 提取。不过随着分子生物
学技术的进步, Benzol和 Trizol等方法正在被广泛应
用, 其中在甜菜中的应用主要是 Trizol法[23-24]。
本试验条件下, 50 mmol L–1 NO3–-N诱导可使甜
菜 NiR 基因的表达达到高峰(图 9), 这可能是 NO3–-
N 刺激甜菜 NR 基因的表达而增加酶蛋白的合成,
使硝酸盐的同化效率增加, 进而产生了较多的氮代
谢产物, 如 NH4+、谷氨酰胺、天冬酰胺等, 这些代
谢产物的积累对甜菜 NiR 基因的表达产生了反馈抑
制作用。Andrea 等[25]也认为谷氨酰胺和(或)天冬酰
胺在体内积累对 NR 基因表达有负调控作用。因此,
过高浓度的 NH4+-N 处理降低了 NiR 基因的表达。
适当比例的 NO3–-N: NH4+-N能能促进甜菜 NiR基因
的表达。其中 NO3–-N比例较高时, 能大大促进 NiR
基因的表达。本试验显示, 在适当的处理时间和处
理浓度下, 放线菌酮抑制了 NiR 的表达, 而它是一
种核酸转录水平抑制剂和蛋白质翻译水平抑制剂 ,
表明氮素对甜菜幼苗叶片 NiR 的诱导在转录和翻译
水平均受到调节, 但是在这两个水平上受哪些因子
的调节以及调节的机理还需进一步研究, RNA 的重
新合成和细胞质中蛋白质的合成对甜菜幼苗 NiR 基
因表达是必需的。在不同浓度 NO2的处理条件下,
随着 NO2–浓度增大至 40 mmol L–1, NiR表达达到一
个高峰, NO2–浓度继续增大时, NiR 的表达逐渐下
降。Polcyn等[26]认为亚硝酸盐能诱导至少 70%的膜
结合硝酸还原酶、硝酸还原酶(NR)和亚硝酸还原酶
(NiR)把 NO3–还原为 NH4+, 印丽萍等指出 , 由于
NO3–积累的毒害作用, NO3–还原速率不应超过 NO2–
还原速率[27]。
由于 NiR 活力一般要比 NR 活力高得多, 所以
NiR 作为硝酸盐还原的限制步骤的可能性就被排除
了 , 致使国内外以往的初级氮素同化研究忽略了
NiR 的控制酶作用, 造成氮的无机同化代谢研究偏
重于 NR 的不平衡局面。NO3–的还原速率必须受到
严格的调控 , 既要保证亚硝酸盐和铵盐不会过量 ,
以免引起植物中毒, 又要在 NiR催化下(连同作物直
接吸收的 NH4+)保证氨的供应, 交由 GS/GOGAT 协
同进行氨的有机同化, 形成谷氨酰胺、谷氨酸。由
于氮源和氮素代谢在作物产量中发挥着中心作用 ,
研究甜菜亚硝酸还原酶基因结构、表达特性, 可整
体认识甜菜的氮素初级同化, 全面分析 NR 和 NiR
的偶联、GS/GOGAT 的协同作用, 为形成我国在这
一领域的一定优势奠定基础, 这也是当前国内外甜
菜氮素同化领域栽培营养生理的研究动态和发展趋
势; 将对农业发展有着广泛的影响, 同时对防止与
改善农业施肥中硝酸盐及其转化过程中给地下水带
来的严重污染具有重要科学意义。对获得甜菜丰产
高糖、提高糖厂制糖效率, 具有重要社会公益。
4 结论
获得了亚硝酸还原酶基因 cDNA全序列。NO3–-N、
NH4+-N 及其比值过低、过高的条件下 , 均不利于
NiR基因的表达, 各处理均存在一定最适值。NiR酶
的抑制物放线菌酮处理 9 h, 随着处理浓度的增大,
NiR 基因的表达量呈逐渐下降的趋势。亚硝酸还原
酶对甜菜氮素营养方面的调控特性, 还需田间试验
进一步探讨。
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