全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(4): 578−588 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2011C012, XDJK2012B18, XDJK2009C110), 高等学校学科创新引智计划(B12006),
国家自然科学基金项目(30971849, 3090986)和重庆市自然科学基金项目(2012jjB014, 2009bb1298)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn, Tel: 02368250794; 杨昆, E-mail: ykun0827@163.com
** 同等贡献(Contributed equally to the work)
Received(收稿日期): 2011-08-16; Accepted(接受日期): 2011-12-19; Published online(网络出版日期): 2012-02-13.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120213.1107.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00578
甘蓝、大白菜和甘蓝型油菜 EXO70A1基因的克隆与表达特性
杨 昆 1,2,*,** 周永祥 3,** 张贺翠 1 赵永斌 4 杨永军 1 陆俊杏 1
朱利泉 1,2,* 薛丽琰 1 吕 俊 1,2 高启国 5
1 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716; 2 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716; 3 西南大学资源环境学院, 重庆
400716; 4 吉林师范大学生命科学学院, 吉林四平 136000; 5 西南大学重庆市蔬菜重点实验室, 重庆 400716
摘 要: 从甘蓝、大白菜与甘蓝型油菜中分离出 EXO70A1 基因, 对该基因的序列进行生物信息学分析, 然后转化酵
母 Y187, 应用半定量 RT-PCR 检测 BoEXO70A1 基因的表达特性。结果表明, 3 种芸薹属植物 EXO70A1 编码序列长
度均为 1 917 bp, 相似性 97.1%, 它们的 gDNA序列均为单一序列, 长度分别为 3 797、3 752和 3 770 bp, 一致度达
91.0%, 均由 12个外显子及 11个内含子组成, 除了第 4、第 5、第 6、第 8个内含子外, 其余内含子的保守性低于外
显子; 推导的 3 种蛋白质序列(BnEXO70A1、BrEXO70A1 和 BoEXO70A1)的相似度与一致性分别达 99.8%与 98.1%,
其二级结构、三维结构及理化特性高度相似。EXO70A1基因的 11个内含子的剪切位点均符合“GU-AG”法则, 剪切受
体(AG)的前 20~50个碱基存在一段保守的序列“CU(A/G)A(C/U)”; 3种芸薹属植物与拟南芥 EXO70A1基因的 12个外
显子的对应序列长度完全相同, 所构成的编码区的序列一致性达 90.1%, 相应的蛋白质序列的相似度与一致性分别
达 99.8%与 93.7%; 分子进化分析表明, EXO70A1 在整个 EXO70 蛋白家族中及不同的植物间表现出较高的保守性;
BoEXO70A1在酵母细胞 Y187呈现弱表达; EXO70A1在甘蓝的雄蕊、幼茎、幼嫩花瓣、雌蕊、幼根及叶片中均能表
达, 可能属于组成型表达基因, 但是其表达量在不同发育时期的不同器官中存在差异, 授粉前雌蕊中最高, 雄蕊中
最低。由此可知, EXO70A1 在芸薹属植物中整体高度保守, 但在酵母转化株和甘蓝各器官中的组成型表达有所差异,
推测 EXO70A1在植物细胞中具有多种重要的功能。
关键词: EXO70A1; 克隆; 序列分析; 表达特性
Cloning and Expression Characteristics of EXO70A1 from Brassica oleracea,
Brassica campestris, and Brassica napus
YANG Kun1,2,*,**, ZHOU Yong-Xiang3,**, ZHANG He-Cui1, ZHAO Yong-Bin4, YANG Yong-Jun1, LU
Jun-Xing1, ZHU Li-Quan1,2,*, XUE Li-Yan1, LÜ Jun1,2, and GAO Qi-Guo5
1 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2 Engineering Research Center of South Upland Agri-
culture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China; 3 College of Resources and Environments, Chongqing 400716, China; 4 College of Life
Science, Jilin Normal University, Siping 136000, China; 5 Key Laboratory in Olericulture of Chongqing, Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract: EXO70A1 is an important signal element of self-incompatibility in Brassica. In this study, coding sequences (CDS) of
EXO70A1 and the corresponding gDNA were cloned by PCR. Sequence analysis was carried out by means of bioinformatics.
RT-PCR was used to analyze expression characteristics of EXO70A1 in Brassica oleracea. And BoEXO70A1 was transformed
into yeast Y187 to explore its expression. The results showed: That the gene lengths of BnEXO70A1, BrEXO70A1 and Bo-
EXO70A1 were 3 797, 3 752, and 3 770 bp, respectively, and all consisted of 12 exons and 11 introns; their identity positions
reached 91%. Sequence conservation was higher in exons than in introns excluding 4th, 5th, 6th, and 8th intron. CDS of three
EXO70A1 genes consisted of 1 917 base pairs and sequence similarity was 97.1%. Three proteins of EXO70A1 conduced all con-
sisted of 638 amino acids; the similarity and identity of EXO70A1 in the three species were 99.8% and 98.1%, respectively.
第 4期 杨 昆等: 甘蓝、大白菜和甘蓝型油菜 EXO70A1基因的克隆与表达特性 579


BnEXO70A1, BrEXO70A1, and BoEXO70A1 shared similar secondary structures and three-dimensional structures. All introns
started from the sequence GU and ended with the sequence AG (in the 5′ to 3′ direction). They are referred to as the splice donor
and splice acceptor site, respectively. Another important sequence “CU(A/G)A(C/U)” in all introns of EXO70A1 genes was lo-
cated at 20–50 bases upstream of the acceptor site. The corresponding sequence lengths of all 12 exons of EXO70A1 were identi-
cal among three Brassica species and Arabidopsis thaliana; and similarity of four coding sequences was 90.1%. The similarity
and identity of EXO70A1 proteins in the four species reached 99.8% and 93.7%, respectively. EXO70A1 was a subunit of EXO70
family which showed high conservative in Magnoliophyta. The results showed that BoEXO70A1 presented weak expression in
Y187, while expressed in stamens, young stems, petals, pistils, young roots and leaves. However, its expression quantity was
different in different tissues, with strong expression in pistils and weak in stamens. Thus conclusions can be drawn that: EXO70A1,
in Brassica, is high conservative; EXO70A1 perhaps plays very important roles in plant cells because of its different expression
characteristics in different plant tissues.
Keywords: EXO70A1; Cloning; Sequence analysis; Expression characteristics
Exocyst 复合体是一种在进化上较为保守的复
合体, 最先发现于酿酒酵母[1-3], 在酵母和哺乳动物
细胞中由 SEC3、SEC5、SEC6、SEC8、SEC10、SEC15、
EXO70和 EXO84等 8个亚单位构成, 其相对分子质
量介于 70~144 kD之间[4-7]。在酵母中胞泌复合体位
于发生胞吐作用时极化的大量囊泡位点[8-9], 在极化
的动物细胞中, Exocyst复合体负责将蛋白质定位于
外侧细胞膜[10-11], 主要通过与多数属于类 Ras GTP酶
超家族[12]的蛋白质互作而调节它们的定位及功能[13]。
在酵母细胞中, EXO70与Rho3 GTP酶发生互作并协
同 Sec3完成它在质膜的定位[14-16]。和在酵母细胞中类
似, EXO70 在动物细胞中也常被作为胞泌复合体的空
间路标[7]。目前在拟南芥、水稻、白杨中也已鉴别出
构成Exocyst复合体的 8种亚单位的同源蛋白[17-18], 不
过它们与动物及酵母细胞中的 Exocyst 复合体的亚基
存在一定的差异, 在酵母与哺乳动物中每个 Exocyst
亚基均由单基因编码, 然而在拟南芥中除了 SEC6
和 SEC8由单基因编码外, SEC3、SEC5、SEC10和
SEC15 都是由 2 个基因编码, EXO84 由 3 个基因编
码, EXO70则是由 23个基因编码的大家族[19]。其中,
不同的 EXO70基因在植物的发育过程中可能会呈现
出时空表达的特异性, 即在不同的组织、不同的发
育时期呈现特异性表达, 不同的 EXO70蛋白在不同
类型的植物特异性胞泌过程中发挥着不同的功能。
若真如此, 这是否是 EXO70蛋白群体在植物体中膨
胀的原因尚不明确。
基于 EXO70 蛋白家族在植物细胞中功能的不
明确性, 人们对该家族中各种成员进行了研究。其
中 EXO70A1 最先发现于拟南芥和水稻, Elias 等[17]
推测可能在植物细胞的形态发生中发挥重要的作
用。S a mu e l 等 [ 2 0 ]首次在油菜的花柱中分离出
EXO70A1的 cDNA, 并发现敲除掉 EXO70A1基因的
油菜柱头表面的花粉粒萌发与花粉管的伸长进程受
到抑制, 而 EXO70A1 蛋白在柱头中超量表达时油
菜由自交不亲和变为亲和。因此, 近年来 EXO70A1
被认为是一种在芸薹属植物自交不亲和反应时发挥
重要作用的信号元件。为了探索 EXO70A1 在芸薹
属植物中进化保守性及表达特性, 我们采用西南大
学甘蓝和油菜研究中心的试验材料, 同源克隆和分
析了甘蓝(Brassica oleracea)、白菜(Brassica campes-
tris L. ssp. chinensis)与甘蓝型油菜(Brassica napus
L.)的 EXO70A1 基因, 并通过转化酵母和运用半定
量 RT-PCR 对甘蓝多个器官进行表达分析, 以期初
步确定 EXO70A1 在芸薹属植物中进化保守性及表
达特性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝型油菜(中油 821)与 2种自交不亲和材料羽
衣甘蓝(Brassica oleracea L.) 2008a1和大白菜(黑籽
型)由西南大学油菜研究中心和重庆市蔬菜重点实
验室提供。大肠杆菌感受态 DH5α、质粒抽提试剂盒、
胶回收试剂盒和 TranScript First-strand cDNA Syn-
thesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司;
T4 DNA连接酶、pMDTM19-T Vector、Sac I与 Sma
I 购自 TaKaRa (大连)公司; pGADT7 和酵母菌株
Y187购自于 Clontech公司。其他常规试剂均为国产
分析纯。引物合成与序列测定由北京华大基因公司
完成。
1.2 引物设计
运用 Primer primier 6.0软件, 依照拟南芥 EXO-
70A1和 18S rDNA的序列设计引物(表 1)。
1.3 总 RNA提取和 cDNA合成
选择羽衣甘蓝、甘蓝型油菜和白菜的花蕾为材
料, 采用常规 Trizol 法提取总 RNA, 分别选用北京
全式金生物技术有限公司反转录试剂盒 TranScript
580 作 物 学 报 第 38卷

表 1 EXO70A1及 18S rRNA片段克隆与分析所用引物
Table 1 Sequences of primers needed in isolation and analyses of this study
序号
No.
引物名
Primer name
引物序列
Sequence
熔解温度
Tm (℃)
TaOpt
(℃)
限制酶切位点
Restriction enzyme
sites
FEXO70A1 TCCCCC∨GGGGGATATGGCCGTCGATAGCCGAAT 74.4 Sma I 1
REXO70A1 AGCTCGAGCT∨CGTTACCGTCGTGGTTCATTCATAGACT 71.2
60.0
Sac I
gEXOF1 ATGGCCGTCGATAGCCGAAT 57.4 2
gEXOR1 CTGCATCCTCTGAACATCCTCTTTGCT 61.9
57.1

gEXOF2 GGAAGAGAGCTTAAGGAAATTGGGAGT 59.6 3
gEXOR2 CATAGCTTGTTAGTGGGTGGACAGTC 60.1
55.4

gEXOF3 CTACGGGGTTGACAAAGCGGCT 61.4 4
gEXOR3 CATGTTGCTGAACGACACGCCTAT 60.5
56.5

gEXOF4 AGGATTTGTTAGGCGATGATTGGGTTC 60.6 5
gEXOR4 TTACCGTCGTGGTTCATTCATAGACT 58.9
54.7

F18SrRNA TGCGGCTTAATTTGACTCA 50.5 6
R18SrRNA ACTAAGGGCAGGGACGTA 51.7
55.6


First-strand cDNA Synthesis SuperMix合成 EXO70-
A1编码框 cDNA第一链。
1.4 基因组 DNA的提取
选择甘蓝、甘蓝型油菜和白菜的幼嫩叶片为材
料, 采用 CTAB法提取总的 gDNA, 并用胶回收试剂
盒纯化所得 DNA。
1.5 EXO70A1基因及其编码区(coding sequence,
CDS)的扩增
选用引物对 FEXO70A1:REXO70A1 (表 1), 分
别以 cDNA 和 gDNA 为模板扩增 EXO70A1 的 CDS
及其全长的 gDNA。选用 TransTaq HiFi DNA poly-
merase进行 PCR和 RT-PCR扩增; EXO70A1基因的
分段扩增, 分别选择引物对 2、3、4、5 (表 1)。取
10 μL PCR产物进行 1% (W/V)琼脂糖凝胶电泳。以
胶回收试剂盒纯化 EXO70A1 编码区及其分段的
gDNA产物后, 分别与载体 pMD19T进行 TA克隆重
组, 将重组载体导入大肠杆菌感受态 DH5α 中, 挑
取阳性克隆测序, 对测序的结果进行拼接与分析。
1.6 EXO70A1基因的生物信息学分析
选用 Vector NTI Advance 11软件进行序列比对
和蛋白质理化特性分析; 选用 SignalP进行信号肽预
测; 选用 Blast 对 EXO70A1 进行相似性搜索; 选用
ScanProsite 工具及 http//smart.embl-heidelberg.de/网
站进行功能域预测及分析; 选用 PredictProtein 工具
(http://www.predictprotein.org/)和 SOPMA 工具(http://
npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/
npsa_sopma.html)进行二级结构预测 , 并采用 SW-
ISS-MODEL工具(http//www.expasy.org/swissmod/SW-
ISS-MODEL.html)进行三维结构模拟。
1.7 EXO70A1在酵母中的表达分析
分别选用 Sac I 和 Sma I 对质粒 pGADT7 与
BoEXO70A1 的 cDNA 序列进行双酶切, 利用 T4 连
接酶构建重组质粒 pGADT7-BoEXO70A1, 然后转
化至感受态 DH5α, 涂布于 LB 抗 Amp+的平板上,
37℃培养过夜。进行菌落 PCR 后, 运用试剂盒抽提
质粒并用双酶切鉴定, 取阳性克隆进行测序鉴定。
利用 LiAc 法制备感受态酵母 Y187, 将正确的克隆
子转化至感受态Y187细胞, 于 SD/–Leu培养基检测
筛选。以温和碱裂解法[21]提取酵母总的蛋白质, 12%
的 SDS-PAGE电泳, 考马斯亮蓝 R-250染色。
1.8 EXO70A1在甘蓝中的表达分析
运用上海华舜生物工程有限公司柱离心式小量
植物总 RNA (RNA-free)抽提试剂盒, 从甘蓝的根、
幼茎、幼叶、花瓣、花柱及花粉囊组织分离并纯化
总 RNA, 运用 Biorad SmartSpec Plus Spectropho-
tometer 测定浓度后将提取 RNA 调至 200 µg mL–1;
运用反转录试剂盒 TranScript First-strand cDNA
Synthesis SuperMix合成第一链 cDNA, 选择引物对
FEXO70A1: REXO70A1进行 RT-PCR扩增; 选择内
参 18S rRNA及引物对 F18S rRNA:R18S rRNA (引物
对 6, 见表 1)。
2 结果与分析
2.1 3种芸薹属植物 EXO70A1基因序列分析
经测序后发现甘蓝、白菜与甘蓝型油菜 EXO-
70A1基因的蛋白编码序列均由 1 917 bp构成, 对应
的 gDNA 均为单一序列, 在 3 种植物中的长度分别
为 3 797、3 752 和 3 770 bp, 与电泳结果相吻合
第 4期 杨 昆等: 甘蓝、大白菜和甘蓝型油菜 EXO70A1基因的克隆与表达特性 581


(图 1); 经序列分析发现 3 种 EXO70A1 基因都包含
12 个外显子与 11 内含子(图 2 和表 2), 所有内含子
的 5′边界序列均为GU, 3′边界序列均为AG, 即均符
合经典的 Chambon 法则; 除了剪切供体位点(GU)和
剪切受体位点(AG)外, 所有的内含子都包含一个被
称为分支位点(branch site)的序列, 分支位点均位于
剪切受体位点上游 20~50 个碱基的位置, 其保守序
列为 CU(A/G)A(C/U)。



图 1 EXO70A1基因的 gDNA与 cDNA的电泳分析
Fig. 1 Electrophoresis analyses of EXO70A1 gene by PCR and
RT-PCR
M: Trans2K plus DNA分子量标准; 1: 甘蓝型油菜 EXO70A1的
gDNA; 2: 白菜 EXO70A1的 gDNA; 3: 甘蓝 EXO70A1的 gDNA;
4: 油菜 EXO70A1的 cDNA; 5: 白菜 EXO70A1的 cDNA;
6: 甘蓝 EXO70A1的 cDNA。
M: Trans2K plus DNA marker; 1: gDNA of Brassica napus’s
EXO70A1; 2: gDNA of Brassica rapa’s EXO70A1; 3: gDNAs of
Brassica oleracea’s EXO70A1; 4: cDNA of Brassica napus’s
EXO70A1; 5: cDNA of Brassica rapa’s EXO70A1; 6: gDNA of
Brassica oleracea’s EXO70A1.

经核酸序列比对(图 1)发现, EXO70A1基因在 3
个芸薹属物种中的序列一致性(identity positions)达
到 91%, 对应的编码序列(coding sequence, CDS)在 3
种植物中的一致性达到 97.1%; 经推导, EXO70A1基
因在甘蓝、白菜以及甘蓝型油菜中均编码 638 个氨
基酸, 蛋白质序列比对得出 99.8%的相似度(consen-
sus positions)与 98.1%的序列一致性。在 3种芸薹属
植物中 EXO70A1 基因的 12 个外显子对应的序列长
度完全相同, 第 4、第 5、第 6、第 8 个内含子对应
的序列长度相同(表 2), 对 4个内含子分别比对后发
现第 5、6、8个内含子对应的碱基序列完全一致, 第
4个内含子在 3个物种中仅有 3个碱基的差异; 将 3
个物种的 12个外显子与 11个内含子分别比对后, 发
现除第 4、第 5、第 6、第 8 个内含子外, 所有的外
显子序列的一致性均高于内含子(表 3)。这表明在
EXO70A1 基因的分子进化中, 内含子累积的突变率
高于外显子, 同时也可以看出内含子在抵御碱基突
变的过程中发挥重要的作用。同时也表明甘蓝、白
菜和甘蓝型油菜属于亲缘关系较近的物种。
2.2 3 种芸薹属植物与拟南芥 EXO70A1 基因序
列的对比分析
对 3种芸薹属植物的 EXO70A1基因结合拟南芥
(Arabidopsis thaliana, At) EXO70A1基因的编码序列
(gb|NM_120434|)和 gDNA 序列进一步分析发现 ,
AtEXO70A1 的编码区与芸薹属植物的 EXO70A1 的
编码区长度相同, 即由 1 917 bp构成, 编码 638氨基
酸; 对应的 gDNA长度为 4 311 bp, AtEXO70A1包含
12 个外显子与 11 个内含子(表 2); 序列分析发现 ,
AtEXO70A1 的每个外显子与 3 种芸薹属植物 EXO-
70A1基因对应的序列长度完全相同。将羽衣甘蓝、
甘蓝型油菜、白菜与拟南芥的 EXO70A1 蛋白序列
比对(图 3), 发现它们的相似度与一致性分别高达
99.8%与 93.7%。这表明 EXO70A1 基因在十字花科
拟南芥属与芸薹属植物之间在进化上存在着较高的
序列保守性。但当我们搜索水稻基因组时 , 发现
OsEXO70A1 基因(Os04g58880)同样包含 12 个外显
子及 11 个内含子, 但其仅仅编码 634 个氨基酸, 少
于前述 4种植物的 EXO70A1。
2.3 EXO70A1的结构域分析
SignalP 分析表明 EXO70A1 不包含信号肽, 说
明它不是一种膜蛋白或分泌蛋白。运用 ScanProsite
工具对 EXO70A1进行 motif分析发现, 该蛋白含有
40个基序, 其中有 15个酪蛋白激酶 II识别位点(cas-
einkinase II phosphorylation site), 13个蛋白激酶 C识
别位点(protein kinase C phosphorylation site), 9个豆



图 2 3种芸薹属植物 EXO70A1基因的结构
Fig. 2 Genomic organization of EXO70A1 from three Brassica species
黑色线代表内含子, 实心框代表外显子, 框内数字代表外显子序号, 框上数字代表外显子碱基数目。
Grey boxes stand for exons encoding amino acids; Black lines mean introns. Numbers in the boxes represent order of each exon; Numbers
above the boxes represent lengths of each exon in base pairs.





表2 4种植物EXO70A1基因结构的统计表
Table 2 Statistic data of gene structures of EXO70A1 from four plants
外显子序列结构
Sequence structure of exons
BnEXO70A1内含子
Introns of B. napus
BrEXO70A1内含子
Introns of B. rapa
BoEXO70A1内含子
Introns of B. oleracea
AtEXO70A1内含子
Introns of A. thalianaNo. 甘蓝型油菜
B. napus
大白菜
B. rapa
甘蓝
B. oleracea
拟南芥
A. thaliana
碱基组成
BP
No. 序列结构
SS
碱基组成
BP
序列结构
SS
碱基数
BP
序列结构
SS
碱基数
BP
序列结构
SS
碱基数
BP
1 1−159 1−159 1−159 1−159 159 1 160−269 110 160−268 109 160−273 114 160−282 123
2 270−365 269−364 274−369 283−378 96 2 366−695 330 365−694 330 370−723 354 379−498 120
3 696−901 695−900 724−929 499−704 206 3 902−1354 453 901−1344 444 930−1379 450 705−1084 380
4 1355−1585 1345−1575 1380−1610 1085−1315 231 4 1586−1694 109 1576−1684 109 1611−1719 109 1316−1900 585
5 1695−1833 1685−1823 1720−1858 1901−2039 139 5 1834−1907 74 1824−1897 74 1859−1932 74 2040−2116 77
6 1908−2120 1898−2110 1933−2145 2117−2329 213 6 2121−2396 276 2111−2386 276 2146−2421 276 2330−2940 611
7 2397−2602 2387−2592 2422−2627 2941−3146 206 7 2603−2711 109 2593−2682 90 2628−2736 109 3147−3264 118
8 2712−2912 2683−2883 2737−2937 3265−3465 201 8 2913−2999 87 2884−2970 87 2938−3024 87 3466−3566 101
9 3000−3099 2971−3070 3025−3124 3567−3666 100 9 3100−3214 115 3071−3181 111 3125−3226 102 3667−3755 89
10 3215−3315 3182−3282 3227−3327 3756−3856 101 10 3316−3419 104 3283−3388 106 3328−3449 122 3857−3948 92
11 3420−3566 3389−3535 3450−3596 3949−4095 147 11 3567−3652 86 3536−3634 99 3597−3679 83 4096−4193 98
12 3653−3770 3635−3752 3680−3797 4194−4311 118 Sum 1853 1835 1880 2394
Sum 1917
SS: sequence structure; BP: base pairs.


第 4期 杨 昆等: 甘蓝、大白菜和甘蓝型油菜 EXO70A1基因的克隆与表达特性 583


表 3 4种植物 EXO70A1基因对应的内含子及外显子序列比对统计数据
Table 3 Statistical data on sequence alignment of four EXO70A1s’ exons and introns
外显子 Exons 内含子 Introns
序号
No.
碱基数
Base pairs
一致性
Identity (excluding
A. thaliana) (%)
一致性
Identity (including
A. thaliana) (%)
序号
No.
一致性
Identity (excluding
A. thaliana) (%)
一致性
Identity (including
A. thaliana) (%)
1 159 95.0 86.2 1 87.0 56.2
2 96 95.8 83.3 2 86.9 17.2
3 206 98.1 88.8 3 87.2 43.6
4 231 99.1 88.3 4 97.2 12.0
5 139 100.0 94.2 5 100.0 70.1
6 213 99.5 96.2 6 100.0 35.2
7 206 98.1 91.7 7 76.1 51.7
8 201 98.5 89.6 8 100.0 57.1
9 100 96.0 88.0 9 59.3 41.3
10 101 95.0 88.1 10 54.7 37.5
11 147 95.9 94.6 11 57.4 48.6
12 118 90.7 88.1 Mean 84.7 41.1
Sum or mean 1917 97.1 90.1



图 3 推导的 4种植物 EXO70A1的蛋白质序列比对
Fig. 3 Protein alignment of EXO70A1 from four plants
Bn: 甘蓝型油菜; Bo: 甘蓝; Br: 白菜; At: 拟南芥。
Bn: Brassica napus; Bo: Brassica oleracea; Br: Brassica rapa; At: Arabidopsis thaliana.

584 作 物 学 报 第 38卷

蔻酰化位点 (N-myristoylation site); 肽段 (128~149)
存在 1 个亮氨酸拉链(leucine zipper pattern); 肽段
(539~542)存有 1 个糖基化位点(N-glycosylation site);
肽段(625~632)包含 1 个 ATP/GTP 结合位点(ATP/GTP-
binding site motif A)。在 http//smart.embl-heidelbe-
rg.de/分析发现 267~627氨基酸包含 1个 Pfam EX70
结构域(图 4)。这同时也证明 EXO70A1 是一种在结
构上极为保守的蛋白质。



图 4 EXO70A1的结构域分析
Fig. 4 Analysis on domains of BoEXO70A1

为研究 EXO70A1 在植物中的序列保守性, 运
用 Vector NTI Advance 11对从 GenBank中下载的拟
南芥(Arabidopsis lyrata subsp. Lyrata)、葡萄(Vitis
vinifera)、籼稻(Oryza sativa indica Group)、玉米(Zea
mays)、毛果杨(Populus trichocarpa)、高粱(Sorghum
bicolor)、蓖麻(Ricinus communis)植物的 17 条预测
的 EXO70蛋白质序列与从 TAIR数据库中获取的 23
种预测及已知的拟南芥(Arabidopsis thaliana)EXO70
蛋白序列和根据新克隆的 3 种芸薹属植物即甘蓝、
甘蓝型油菜及白菜的 EXO70A1 基因预测的蛋白序
列比对分析发现, 以 EXO70A1 为代表的 EXO70 不
仅在芸薹属植物的种间及属间高度保守, 甚至在种
子植物亚门内不同纲的植物之间都存在较高的序列
保守性; 参与比对的 43 条 EXO70 蛋白序列中有 9
处的氨基酸残基保持恒定不变(附图 2), 在 BoEXO-
70A1中分别为 TrP270、Glu285、Phe318、Gly399、Phe470、
Asn473、Asn474、Phe555和 Phe559; EXO70存在 3个高
变区, 在 EXO70A1 中它们分别位于 2~6、175~191
和 532~540氨基酸(均为 N端→C端)处。
2.4 EXO70A1结构分析
运用 PredictProtein、SOPMA对 BnEXO70A1、
BoEXO70A1和 BrEXO70A1进行二级结构预测与模
拟, 得出极为相似的二级结构(表 4 和图 5), 其中 α-
螺旋的比例最高, 随机卷曲约占 24%, 并含有少量
的延伸链(约 2%)和 β转角(约 1.8%)。从图 5可以看
出在 3种 EXO70A1的二级结构中, 随机卷曲斑驳分
布在 α-螺旋之间, 在 49~60 及 90~96 氨基酸处的 3
种芸薹属植物 EXO70A1 在一级结构上完全相同 ,
但由于其他位点存在的氨基酸差异造成它们三者的
二级结构在这两处存在差异: BrEXO70A1 的 49~54
和 92~95氨基酸形成随机卷曲, 90~91氨基酸形成延
伸链; BnEXO70A1的 49~56及 92~95氨基酸形成随
机卷曲, 90~93 氨基酸形成延伸链; 而 BoEXO70A1
未出现的 50~51、54~55、60-61 和 93~95 氨基酸为
随机卷曲。运用 SWISS-MODEL工具预测的 3种芸薹属
植物的 EXO70A1 (74~631 氨基酸)的三维结构趋近
一致(图 6), 即均为 18个 α-螺旋和随机卷曲通过间
隔的延伸链和 β转角连接而成的近似棒状结构。这
表明尽管 3种蛋白质在一级结构上存在 11处氨基酸
残基的差异, 但这些差异对蛋白质三维结构的影响
几乎为零。

表 4 蛋白质二级结构预测的统计表(运用 PredictProtein软件)
Table 4 Statistical data of protein secondary structure
(Software of PredictProtein was used)
蛋白
Protein
α螺旋
Alpha-helix (%)
β折叠
Beta-sheet
环(卷曲)
Loop (coil) (%)
BnEXO70A1 73.82 0 26.18
BrEXO70A1 73.98 0 26.02
BoEXO70A1 74.29 0 25.71




图 5 BnEXO70A1、BoEXO70A1和 BrEXO70A1的二级结构(运用 SOPMA程序)
Fig. 5 Secondary structure of BnEXO70A1, BoEXO70A1, and BrEXO70A1 (SOPMA was used)
蓝色代表 α螺旋, 紫色代表随机卷曲, 红色代表延伸链, 绿色代表 β转角。
Blue represents alpha helix; purple represents random coil; red represents extended strand; green represents beta turn.
第 4期 杨 昆等: 甘蓝、大白菜和甘蓝型油菜 EXO70A1基因的克隆与表达特性 585




图 6 BnEXO70A1、BoEXO70A1与 BrEXO70A1的三维结构
Fig. 6 Protein structure modelling of EXO70A1 from three Brassica species
运用 SWISS-MODEL工具, 模拟肽段均选择 EXO70A1的 74~631氨基酸。
The 558-amino-acid peptide fragments of EXO70A1 were used to protein modeling by method of SWISS-MODEL. Fragment of EXO70A1
was from 74 to 631aa.

2.6 EXO70A1的理化特性分析
运用 Vector NTI 软件对推导的 4 种植物 EXO-
70A1 理化参数分析(表 5)后发现, 分子量大小顺序
是 BrEXO70A1>BnEXO70A1>AtEXO70A1>BoEXO
70A1; 在检测甘蓝 EXO70A1 在酵母中的表达时 ,
SDS-PAGE的结果与 Vector NTI预测的结果(分子量
为 72.287 kD)一致; 4种植物 EXO70A1对应的摩尔
消光系数、等电点及 A280对应的分子质量完全相同;
3种芸薹属植物 EXO70A1在 pH 7.0的溶液中带电量
相同, 而 AtEXO70A1则呈现微弱的差异(表 5)。
2.7 EXO70A1的表达分析
2.7.1 BoEXO70A1 在酵母细胞中表达 菌落
PCR 与双酶切电泳检测的结果与预测的一致(图 7),
说明 EXO70A1 基因的编码序列完全重组至表达载
体 pGADT7; 测序发现整合至 pGADT7 的序列和插
入方向与预设的一致 , 且没有出现移码突变。
从转化 pGADT7-EXO70A1的酵母Y187中提取
总蛋白, 电泳检测发现在略低于 97.2 kD 的位置处
检测到一条模糊的带(图 8), 即 BoEXO70A1 在酵母
Y187 中能够表达, 但表达量较低。由于在 BoEXO-
70A1的 N端融合有 HA标签和 GAL-AD的序列(图
9), 其分子量之和接近 19 kD, 经过计算可以发现
BoEXO70A1 的分子量与前述运用 Vector NTI 预测
的结果(72 416.38 Da)基本吻合。
2.7.2 EXO70A1 在甘蓝不同组织中的表达分析
经过半定量 RT-PCR, 运用 Biorad SmartSpec
Plus 核酸定量测定仪结合 Quantity One 对电泳结果
分析发现, EXO70A1 是一种组成型表达基因, 它在
甘蓝的幼根、幼茎、叶片、花瓣、雄蕊、雌蕊及花
柱中皆表达, 尤其以雌蕊的表达量最高, 而雄蕊的
表达量较低(图10)。另外还发现在相同的组织中幼嫩
与衰老的组织似乎比成年的组织表达量更高, 如幼
叶与衰老叶片中的表达量均高于成年叶片, 这证明
EXO70A1 可能在植物的发育及衰老过程中都起

表 5 推导的 4种植物 EXO70A1几种理化参数分析
Table 5 Analysis on the several physicochemical parameters of EXO70A1 from four plants
蛋白
Protein
蛋白质长
度
Length (aa)
分子量
Molecular
weight
pmol
µg−1
摩尔消光系数
Molar extinction
coefficient
1 A[280]
corr. To
(mg mL−1)
A[280] of
1 mg mL−1
等电点
Isoelectric
point
电荷(pH 7.0)
Charge at pH
7.0
BrEXO70A1 638 72422.29 13.808 48010 1.51 0.66 AU 8.20 3.33
BnEXO70A1 638 72416.38 13.809 48010 1.51 0.66 AU 8.20 3.33
BoEXO70A1 638 72287.17 13.834 48010 1.51 0.66 AU 8.20 3.33
AtEXO70A1 638 72294.30 13.832 48010 1.51 0.66 AU 8.20 3.32

586 作 物 学 报 第 38卷



图 7 菌落PCR及重组质粒 pGADT7-BoEXO70A1的双酶切鉴定
Fig. 7 Identification of vector pGADT7-BoEXO70A1 by PCR
and digestion with Sac I and Sma I
M1: Tans2K DNA分子量标准; 1~2: EXO70A1的菌落 PCR; M2:
Trans2K Plus II DNA分子量标准; 3: pGADT7-EXO70A1的双酶
切电泳检测。
M1: Trans2K DNA marker; 1–2: PCR of vector
pGADT7-BoEXO70A1; M2: Trans2K Plus II DNA marker;
3: digestion of pGADT7-EXO70A1 with Sac I and Sma I.



图 8 重组质粒 pGADT7-BoEXO70A1在酵母中表达的的
SDS-PAGE分析
Fig. 8 Analysis of expression of EXO70A1 using SDS-PAGE
考马斯亮蓝 R250染色, 箭头代表 EXO70A1-HA-AD融合蛋白;
M: 蛋白分子量标记; 1: 对照, 即转化空载 pGADT7酵母表达;
2~4: 融合蛋白 AD-HA-EXO70A1的酵母表达情况。
Stained with coomassie brilliant blue R250; Arrowheads indicated
fused protein of AD-HA-EXO70A1; M, protein marker; 1, CK; 2–4:
expression of fused protein of AD-HA-BoEXO70A1 in yeast.

重要的作用。
3 讨论
甘蓝(B. oleracea, 2n=CC=18)与白菜(B. rapa,



图 9 融合蛋白 AD-HA-EXO70A1基因的转录
Fig. 9 Gene transcription diagram of fused protein of
AD-HA-EXO70A1

2n=AA=20)的共同祖先于 1 300~1 700万年前通过基
因组倍增方式使得自身基因组复杂化[22-23], A染色体
组与 C染色体组于 400万年前完成分化[24]。之后, 甘
蓝和白菜经历天然杂交和自然加倍, 形成甘蓝型油
菜(B. napus, 2n=AACC=38)[25], 随着生物不断进化,
芸薹属植物的基因组变得愈加复杂。因此, 甘蓝型
油菜与甘蓝和白菜之间有着较近的亲缘关系; 甘蓝
型油菜的基因组应该同时包含甘蓝与白菜所有的基
因序列。本研究从甘蓝与白菜基因组中都分离出
EXO70A1基因, 其全长 gDNA存在 45 bp的差异, 甘
蓝型油菜的 EXO70A1 的 gDNA 长度介于甘蓝 EXO
70A1 与白菜 EXO70A1 之间。而且从甘蓝型油菜中
分离的 EXO70A1基因也是单一的序列, 其可能原因
是, 甘蓝与白菜自 A、C基因组分化之后, 经历漫长
的进化过程, 在个体内部发生了不同程度的基因突
变, 导致两者 EXO70A1的 gDNA长度出现差异; 甘
蓝型油菜自形成之后细胞内部 A基因组与 C基因组
通过交换重组等过程使 EXO70A1 同源基因的序列
趋于一致, 同时也因程度不同的突变造就了 BnEXO
70A1与 BrEXO70A1及 BoEXO70A1基因序列长度的
不同。
3种芸薹属植物、拟南芥和水稻的 EXO70A1基
因均由 12 个外显子和 11 个内含子构成, 除 OsEX-
O70A1有少编码 4个氨基酸的差异外, 3种芸薹属植
物和拟南芥 EXO70A1 基因的 12 个外显子对应的基
因组核苷酸序列长度完全相同, 而且由编码框推导
出的氨基酸序列仅存在少许差异, 其相似度与一致
性分别高达 99.8%与 93.7%, 这都表明 EXO70A1 基



图 10 甘蓝 EXO70A1表达分析
Fig. 10 Expression analyses of BoEXO70A1 genes by RT-PCR in B. oleracea
Sta: 雄蕊; Ste: 茎; Pe: 花瓣; Pi: 雌蕊; R: 根; L: 叶; 18S: 18S rRNA片段。EXO70A1在甘蓝中呈现出一定的组成型表达。在甘蓝的雄
蕊中表达量较低, 在雌蕊(花柱)中表达量较高。
Sta: stamen; ste: stem; Pe: petal; Pi: pistil; R: root; L: leaf; 18S: 18S rRNA partial sequence; and leaves of 7-day-old seedlings; R: roots of
7-day-old seedlings. Note that relative constitutive expression was observed in EXO70A1. EXO70A1 showed a high level of expression in
stigmas and lowest levels in the stamens.
第 4期 杨 昆等: 甘蓝、大白菜和甘蓝型油菜 EXO70A1基因的克隆与表达特性 587


因在进化上保持着较高的保守性。进一步分析发现
4 种植物(B. napus、B. olerea、B. rapa 和 A. tha-
liana)EXO70A1 的外显子的序列一致性远高于内含
子序列的一致性, 即外显子在序列上的进化保守性
高于内含子, 表明在生物的演化中 EXO70A1基因的
内含子累积的突变率高于外显子。有研究认为“内含
子与外显子存在相似的突变率 [26-30], 那么造成
EXO70A1基因的外显子保守性高于内含子的原因或
许是 , 内含子的突变因其不影响蛋白质的结构与功
能而被保留; 但是外显子曾经的某些突变导致蛋白
质的结构和功能严重改变, 造成其对突变体(或细胞)
的致死效应, 变异的 EXO70A1基因序列伴随着突变
体 (或细胞 )一起消亡了。然而将 BnEXO70A1、
BoEXO70A1和 BrEXO70A1对应的 11个内含子之间
本身的序列分别比对, 却得出意外的结果: 第 5、第
6和第 8个内含子的序列完全一致, 第 4个内含子的
序列一致性达到 97.2%。说明在 EXO70A1基因内部
的不同的内含子之间累积的突变率存在较大的差
异。有研究表明人类基因组中有超过 50%的基因存
在两种或多种不同的转录后剪切方式, 不同类型的
剪切往往存在于具备较高保守性的非组成型内含子
区域[31], 在芸薹属植物 EXO70A1基因的这 4个内含
子的高度保守性或许意味着它们本身可能转化为对
蛋白质空间构象有贡献的编码区段, 使 EXO70A1在
芸薹属植物中可能出现新的具有功能的表达产物。
尽管 BnEXO70A1、BoEXO70A1和 BrEXO70A1
在一级结构上存在 11个氨基酸残基的差异, 然而运
用生物信息学软件对其蛋白结构预测与模拟, 竟然
得出高度相似的二级结构与几乎一致的三维结构 ,
其理化特性也高度相似, 这意味着芸薹属植物的同
源基因在进化中尽管会发生或多或少的点突变, 然
而这些突变未使同源蛋白的构象及功能明显改变 ,
即突变未对它的生物学功能产生影响。芸薹属植物
EXO70A1 的蛋白结构与理化性质的高度相似暗示
其在生物体中发挥的功能是非常重要的。
EXO70 在在酵母、果蝇、线虫及动物细胞中仅
发现一个成员, 但在拟南芥基因组中它拥有 23个成
员 , 在水稻基因组则由 41 个成员组成 [18], 本文对
EXO70 蛋白质多序列比对分析发现, 其在种子植物
亚门的种间、属间甚至不同纲的植物之间都存在着
较高的保守性, 这意味着 EXO70在植物体发育过程
中可能发挥着极为特别的功能。Elias等[17]首先从水
稻和拟南芥中找到 EXO70 的成员之一——EXO70A1,
本研究发现其在甘蓝的 6个器官与组织中均能表达,
即 EXO70A1在甘蓝中可能为组成型表达基因, 然而
它在不同器官中呈现出不同的表达量, 如在雌蕊中
表达量远高于雄蕊中的表达, 其原因可能与 EXO-
70A1 在不同组织中所参与的生物学功能重要程度
有关 , 亦可能是在表达量较低的组织中 EXO70A1
所发挥的功能能够被同族的其他蛋白替代或补充。
另外, EXO70A1在甘蓝幼苗的嫩叶和老叶中的表达
量均高于成年叶片, 意味着它可能在植物组织的发
育过程中发挥重要功能, 同时也暗示着它可能参与
调控叶片的衰老进程 , 其具体机理尚需进一步研
究。Synek等[32]发现 EXO70A1在柱头乳突细胞的极
性生长中起着重要的作用, 推测 EXO70A1 可能作
为植物胞外分泌复合体的一个组分参与调节植物生
殖器官的生长发育。Hála 等[33]认为 EXO70A1 在植
物细胞的形态发生中可能发挥重要的调节功能。
Samuel 等[20]发现 EXO70A1 蛋白与柱头花粉的萌发
及花粉管的生长关系密切。Li 等[34]发现 EXO70A1
可能在拟南芥木质部的形成中发挥重要的作用。然
而这些都不足以从根本上解释组成型表达的
EXO70A1 基因在甘蓝中呈现差异性表达量, 其根本
原因仍需深入研究。
4 结论
甘蓝型油菜、甘蓝和白菜的 EXO70A1基因编码
区及对应的 gDNA 均为单一序列, 其核苷酸序列及
推测的氨基酸序列具有高度同源性。EXO70A1基因
在酵母及甘蓝的雄蕊、幼茎、幼嫩花瓣、雌蕊、幼
根及幼叶中均能表达, 可能属于组成型表达基因, 但
是其表达量在不同发育时期的不同器官中呈现差异。
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