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Construction of Molecular Genetic Linkage Map of Sugarcane Based on SSR and AFLP Markers

甘蔗SSR和AFLP分子遗传连锁图谱构建


To take advantage of the MAS technique and develop the molecular genetic linkage map in sugarcane breeding program in China, we constructed two molecular genetic maps by single dose markers (SDM) and double dose markers (DDM) from 36 SSR and 12 AFLP primers for two mapping populations (F1 and BC1). F1 population was from cross combination of sugarcane commercial variety (Co419) × S. spontaneum (Y75/1/2) consisting of 269 true individuals, BC1 population from backcross combination of F102/356×sugarcane commercial variety (ROC25) with 266 true individuals. All plants from two populations were detected by PCR.


全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(1): 177−183 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中 -澳合作项目 (CS1/2000/038),云南省应用基础研究计划重点项目 (2006C0013Z)和国家科技基础条件平台工作项目子专题
(2007DKA21002-11)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 范源洪, E-mail: fyhysri@vip.sohu.com
第一作者联系方式: E-mail: lxlgood868@163.com
Received(收稿日期): 2009-06-03; Accepted(接受日期): 2009-08-31.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00177
甘蔗 SSR和 AFLP分子遗传连锁图谱构建
刘新龙 1,2 毛 钧 1,2 陆 鑫 1,2 马 丽 1,2 Karen Sarah AITKEN4
Phillip Andrew JACKSON4 蔡 青 1,3 范源洪 1,2,*
1 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 云南开远 661600; 2 云南省农业科学院甘蔗研究所, 云南开远 661600; 3 云南省农业科学院生物
技术与种质资源研究所, 云南昆明 650223; 4 澳大利亚联邦科学与工业研究组织(CSIRO)植物研究中心, 澳大利亚 Brisbane, QLD 4067
摘 要: 采用甘蔗商业品种 Co419 与野生种割手密 Y75/1/2 杂交, 获得 269 个单株, 组成 F1群体, 用 F1 02/356与商
业品种 ROC25 回交获得 266 个单株, 组成 BC1群体。利用筛选的多态性条带丰富的 36 对 SSR 引物和 12 对 AFLP
引物, 对两个群体进行 PCR扩增和分子遗传连锁分析, 构建甘蔗分子遗传连锁图谱。用 F1群体获得 630个分离标记,
经χ2检测, 298 个标记为单双剂量标记, 占总标记数的 47%; 用 BC1群体获得 571 个分离标记, 有 264个标记为单双
剂量标记, 占总标记数的 46%; 4个亲本获得单双剂量标记的数量依次为 Co419>02/356>Y75/1/2>ROC25。在 LOD≥
5.0, 相邻标记遗传距离≤40 cM的条件下, F1群体有 134个单双剂量标记被纳入 55个连锁群, 其中 39个连锁群归属
8个同源组, 16个未列入, 总遗传距离为 1 458.3 cM, 标记间平均图距为 10.9 cM; BC1群体有 133个单双剂量标记被
纳入 47个连锁群, 其中 34个连锁群归属于 8个同源组, 13个连锁群未列入, 总遗传距离为 1 059.6 cM, 标记间平均
图距为 8.0 cM。从 4个亲本单双剂量标记进入的连锁群数来看, Co419最多, 归入 34个连锁群, 其次为 Y75/1/2, 归
入 20 个连锁群, 第 3 为 02/356 和 ROC25, 归入 19 个连锁群。研究结果表明, 从单双剂量标记比例、形成连锁群数
量、总遗传距离来看, F1群体构图质量要优于 BC1群体。
关键词: 甘蔗; 遗传连锁图谱; SSR; AFLP; 群体
Construction of Molecular Genetic Linkage Map of Sugarcane Based on SSR
and AFLP Markers
LIU Xin-Long1,2, MAO Jun1,2, LU Xin1,2, MA Li1,2, Karen Sarah AITKEN 4, Phillip Andrew JACKSON 4,
CAI Qing1,3, and FAN Yuan-Hong1,2,*
1 Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661600, China; 2 Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricul-
tural Sciences, Kaiyuan 661600, China; 3 Biotechnology & Genetic Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223,
China; 4 CSIRO Division of Plant Industry, Brisbane, QLD 4067, Australia
Abstract: To take advantage of the MAS technique and develop the molecular genetic linkage map in sugarcane breeding
program in China, we constructed two molecular genetic maps by single dose markers (SDM) and double dose markers (DDM)
from 36 SSR and 12 AFLP primers for two mapping populations (F1 and BC1). F1 population was from cross combination of
sugarcane commercial variety (Co419) × S. spontaneum (Y75/1/2) consisting of 269 true individuals, BC1 population from
backcross combination of F1 02/356×sugarcane commercial variety (ROC25) with 266 true individuals. All plants from two
populations were detected by PCR. Two molecular genetic linkage maps were established. 298 SDMs and DDMs were ac-
quired by χ2 test from 630 segregation markers of F1 population, about 47% of total markers; 264 SDMs and DDMs were ob-
tained from 571 segregation markers of BC1 population which were 46% of total markers, Co419>02/356>Y75/1/2>ROC25 in
efficiency of getting SDMs and DDMs. Based on LOD ≥ 5.0, genetic distance ≤ 40 cM between markers, 134 of 298 SDMs
and DDMs from F1 population formed 55 linkage groups (LGs), among which 39 LGs were included in eight homology
groups(HGs), 16 LGs were excluded, the map length reached 1 458.3 cM with an average distance of 10.9 cM between mark-
ers; 133 of 298 SDMs and DDMs from BC1 population made up 47 LGs , among which 34 LGs were composed in eight HGs
except for 13 LGs, the map covered 1 059.6 cM with an average distance of 8.0 cM. At the same time, these SDMs and DDMs
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from Co419 and Y75/1/2 formed 34 LGs and 20 LGs, respectively, and these SDMs from two parents only made up 1 LGs; 19
LGs were obtained from these SDMs and DDMs of 02/356, and ROC25, 9 LGS were formed by SDMs from two parents;
Co419>Y75/1/2>02/356=ROC2 according to forming number of LGs. These results indicated that F1 mapping population was
better than BC1 mapping population in quality of constructing linkage map. The maps will provide the valuable information for
locating gene, further research on genetic linkage map and MAS breeding.
Keywords: Sugarcane; Genetic linkage map; SSR; AFLP; Population
甘蔗是由多倍体原种热带种(Saccharum officinarum
L., 2n=80, x=10)作母本, 多倍体野生种割手密(S. sponta-
neum L., (2n=40~128, x=8))作父本经过一系列杂交形成的
异源多倍体作物, 染色体数在 100~150 条之间, 其中约
75%~85%的染色体来源于热带种, 15%~25%来源于割手
密[1], 在第一次和第二次(热带种作母本, F1 作父本)杂交
过程中, 染色体按照 2n+n 的特有方式传递, 因此杂交后
代的糖分、产量等农艺性状得以快速恢复, 这个过程被称
为“甘蔗高贵化”过程[2], 这是甘蔗遗传育种的重要理论。
近年来, 虽然一些其他原种如印度种(S. barberi Jesw.)、中
国种(S. sinense Roxb.)、大茎野生种(S. robustum Brandes &
Jeswiet ex Grassl)也被应用到甘蔗的品种改良中 , 但
Irvine[3]、D’Hont 等[4]和 Brown 等[5]研究表明, 这些原种
属于热带种和割手密天然杂交的后代 , 因此现代甘蔗的
血缘主要还是由热带种和割手密血缘组成。在分子遗传连
锁图谱研究方面, 甘蔗远落后于其他作物, 甘蔗倍性复杂,
一个基因座上有多个等位基因[6-7], 杂交后代基因型复杂
多样, 难于鉴定[8]; 另外甘蔗杂交过程中染色体的配对行
为依然是不清楚的[8-9]。目前法国、美国、澳大利亚等国
家在甘蔗分子遗传连锁图谱的研究上取得一定进展 ,
Al-Janabi等[10]、Da Sliva等[11]和 Ming等[12-13]使用单剂量
标记构建了割手密 SES208 的 RFLP 分子遗传连锁图谱,
证实了 SES208 为同源八倍体; Mudge 等[14]、Guimaraes
等 [15]和 Ming 等 [12-13]利用单剂量标记构建了热带种 La
Purple的RFLP和RAPD分子遗传连锁图谱。D’Hont等[16]、
Grivet等[8]、Hoarau等[9]和 Karen等[7]使用 RFLP、AFLP、
SSR、RAF标记筛选出的单剂量标记, 双剂量标记构建了
甘蔗品种 SP701006、R570、Q165的分子遗传连锁图谱, 这
些图谱覆盖了甘蔗基因组的 39.5%~70.0%, 但标记间遗传
距离较大, 图谱饱和度低。而国内针对甘蔗的分子遗传连
锁图谱的研究依然处于空白 , 鉴于分子遗传连锁图谱是
质量、数量性状基因定位、分子标记辅助选择育种研究的
重要前期基础 [17], 本研究拟通过商业品种与野生种割手
密杂交回交获得 F1分离群体和 BC1分离群体, 构建分子
遗传连锁图谱, 以期为深入研究遗传图谱、基因定位、分
子标记辅助育种打下坚实基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2001 年 10 月—2002 年 11 月, 通过光周期诱导技术
诱导甘蔗商业品种 Co419 (2n=114)与野生种割手密
Y75/1/2 (2n=64)同时开花, 进行杂交, 获得 375个后代单
株, 种植于大田繁种, 同时使用 SSR标记对所有后代单株
进行杂交真实性鉴定, 获得 269 个真实后代构成的 F1群
体; 2003 年 10月—2004年 11 月从 F1群体里选择生长势
较好材料 02/356 作母本与 ROC25 杂交(光周期诱导)获得
352个 BC1后代单株, 经 SSR真实性鉴定获得由 266个真
实后代组成的 BC1群体。
1.2 SSR和 AFLP标记分析
从 64对 Eco RI/Mse I引物组合中筛选出 12对多态性
较高的 AFLP引物, 从国际微卫星协会提供的 200对 SSR
引物中筛选出 36对多态性高的 SSR引物进行 PCR扩增。
引物使用放射性同位素ATP-γ 33P标记, 扩增产物经 5%变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离[7,18], 将胶片放入感应屏感应,
用美国 BIO-RAD Personal Molecular Imger FX磷胶成像
系统对感应屏扫描显影。选择群体后代呈现分离的 SSR
与 AFLP 标记统计, 按同一位置有带记为“H”, 无带记为
“A”, 缺失记为“–”。使用χ2 检测所有标记的分离比例, 分离
比例 1 1∶ (双亲间多态带)或 3 1∶ (双亲间共有带)为单剂量
标记, 分离比例 11 3∶ (双亲间多态带)为双剂量标记[7,9,19]。
1.3 遗传连锁群的构建
使用澳大利亚CSIRO种植业部 St Lucia实验室Baker
编写的重组率计算程序(未发表), 根据两点测验[7,17]计算
单剂量标记之间、双剂量标记之间、单双剂量标记之间的
重组率, 然后将计算结果导入 JoinMap 3.0[20], 使用 Group
命令进行分组, 为了确保连锁的准确性, 在 LOD≥5.0 条
件下使用 Map 命令构建遗传连锁图谱, 采用 Kosambi 函
数计算图距; 为了确保连锁群(linkage group, LG)的可靠
性, 剔除连锁群内遗传距离大于 40 cM的相邻标记。
1.4 同源组构建
对所有已构建的连锁群进行分析, 将具有相同 SSR
位点的连锁群及分布在不同连锁群的同一双剂量标记或
单剂量标记归入同一个同源组 (homo(eo)logy group,
HG)[7,9]。
2 结果与分析
2.1 分子标记的分离分析
从 36对 SSR引物和 12对 AFLP引物中共获得 1 201
个分离标记, 其中用 F1群体获得 630个分离标记, 用 BC1
群体获得 571个分离标记(表 1)。使用χ2检测, F1群体共有
216 个单剂量标记, 82 个双剂量标记, 合计占总标记数的
47%, 偏分离标记 332个。用 BC1群体共获得 211个单剂
量标记, 53个双剂量标记, 占总标记数的 46%, 偏分离标
记 307 个。4 个亲本的单双剂量标记数量依次为 Co419>
第 1期 刘新龙等: 甘蔗 SSR和 AFLP分子遗传连锁图谱构建 179


表 1 F1群体和 BC1群体标记统计结果
Table 1 Statistical result of markers in F1 population and BC1 population
亲本
Parent
标记数
Marker number
单剂量标记
SDM
(1:1 & 3:1)
双剂量标记
DDM
(11:3)
单双剂量标记比例
Rate of SDM to DDM
(%)
偏分离
比例标记
DM
偏分离标记比例
Rate of DM
(%)
Co419 281 104(1:1) 47(11:3) 54 130 46
Y75/1/2 224 75(1:1) 35(11:3) 49 114 51
双亲共有标记
Markers present in both parents
125 37(3:1) 30 88 70
F1群体合计
Total in F1 population
630 216 82 47 332 53
02/356 219 85(1:1) 31(11:3) 53 103 47
Roc25 135 55(1:1) 22(11:3) 57 58 43
双亲共有标记
Markers present in both parents
217 71(3:1) 33 146 67
BC1群体合计
Total in BC1 population
571 211 53 46 307 54
SDM: single dose marker; DDM: double dose marker; DM: distorted marker.

02/356>Y75/1/2>ROC25。总体来说虽然在同样的引物下
用 F1群体较用 BC1群体获得更多的分离标记, 但从单双
剂量标记比例来看 , 两个群体获得有效构图标记的效率
基本相等。从双亲共有标记数量来看, F1群体的 125个共
有标记数少于 BC1群体的 217个, 其中单剂量标记数少于
BC1群体 34 个, 说明 BC1群体双亲的位点杂合性高于 F1
群体双亲。
2.2 分子遗传连锁图谱构建
将 F1群体 298个单双剂量标记用于构图, 在 LOD≥
5.0, 相邻标记遗传距离≤40 cM的条件下, 最终有 134个
标记进入连锁图谱, 其中来自单亲单剂量标记 87个, 双
亲共有单剂量标记 2个, 双剂量标记 45个, 共形成 8个同
源组 55个连锁群, 遗传距离为 1 458.3 cM, 标记间平均图
距为 10.9 cM (表 2和图 1), 根据 SSR位点, 39个连锁群归
属 8个同源组, 16个连锁群未列入; 其中含 8个标记的连
锁群有 1个(LG25), 含 4个标记的有 3个连锁群(LG2、LG3
和 LG22), 含 3个标记的有 12个连锁群, 其他为含两个标
记的连锁群, LG25遗传距离最长, 为 83.4 cM, LG14遗传
距离最短, 为 0.1 cM; 形成的 8个同源组中 HG1包含的
连锁群最多, 为 10 个, HG7 其次, 为 8 个。将 BC1 群体
264 个单双剂量标记用于构图, 最终有 133 个标记进入连
锁图谱, 其中来自单亲单剂量标记 90 个, 双亲共有单剂
量标记 19 个, 双剂量标记 24 个, 共形成 8 个同源组 47
个连锁群, 遗传距离为 1 059.6 cM (表 2和图 2), 标记间平
均图距为 8.0 cM, 其中 34 个连锁群归属 8 个同源组, 13
个连锁群未列入; 其中含 6 个标记的有 2 个连锁群(LG3
和 LG36), 含 5个标记的有 1个连锁群(LG39), 含 3个标
记的有 6个连锁群, 其他为含两个标记的连锁群, LG1遗
传距离最长, 为 70.7 cM, LG18、LG19遗传距离最短, 均
为 0.1 cM; 形成的 8个同源组中 HG2包含的连锁群最多,
为 9个, HG1其次, 为 8个。从 4个亲本单双剂量标记被
纳入的连锁群数来看, Co419最多, 被纳入 34个连锁群, 其
次为 Y75/1/2, 20个连锁群, 第 3为 02/356和 ROC25, 各
19个连锁群; 其中 Co419和 Y75/1/2共有单剂量标记仅被
纳入 1个连锁群; 而 02/356和 ROC25共有单剂量标记被
纳入 9个连锁群。总体来说, F1作图群体无论从形成的连
锁群数, 还是覆盖的遗传距离都优于 BC1作图群体。
3 讨论
3.1 作图群体构建
群体构建是遗传连锁图谱构建的重要前提条件和关
键因素, 构建过程中需要考虑的重要因素有亲本的选配、
分离群体的类型选择和群体大小等[17]。甘蔗属于较难自
然开花的作物, 因此需要通过光周期诱导来实现亲本的
开花杂交, 目前虽然可以实现大部分甘蔗品种的诱导开
花, 但由于双亲的花期不相遇等问题, 一些亲本背景清楚
的杂交组合依然难于配制成功, 极大影响了甘蔗作图群
体的创制, 鉴于此国外多选择品种自交 1代或品种与原种
或割手密杂交 1代的分离群体作为作图群体[7-16]。为了确
保作图群体的创制成功, 本研究选配了 20 多个热带种×

表 2 两个群体遗传图谱构建结果
Table 2 Result of constructing molecular genetic linkage map for F1 and BC1 populations
单剂量标记 SDM 群体
Population 1:1 3:1
双剂量标记
DDM
合计
Total
连锁群
Linkage group
同源组
Homo(eo)logy group
遗传距离
Map length
(cM)
F1 87 2 45 134 55 8 1458.3
BC1 90 19 24 133 47 8 1059.6
SDM: single dose marker; DDM: double dose marker.
180 作 物 学 报 第 36卷



图 1 F1群体 SSR和 AFLP分子遗传连锁图
Fig. 1 SSR and AFLP molecular genetic linkage map of F1 population
标注灰色的连锁群由来自 Co419的单双剂量标记形成, 白色的由来自 Y75/1/2的单双剂量标记形成, 黑色的为双亲共有单剂量标记形成。
Gray LGs were formed with SDMs and DDMs from Co419, white LGs from Y75/1/2, and black LGs from both parents.
第 1期 刘新龙等: 甘蔗 SSR和 AFLP分子遗传连锁图谱构建 181




图 2 BC1群体 SSR和 AFLP分子遗传连锁图
Fig. 2 SSR and AFLP molecular genetic linkage map of BC1 population
标注灰色的连锁群由来自 02/356的单双剂量标记形成, 白色的来自 ROC25的单双剂量标记形成, 黑色的为双亲共有单剂量标记形成。
Gray LGs were formed with SDMs and DDMs from 02/356, white LGs from ROC25, and black LGs from both parents.
182 作 物 学 报 第 36卷

割手密、商业品种×割手密杂交组合进行诱导开花杂交,
最终 Co419×Y75/1/2 组合获得有足够真实后代的 F1群体,
由于花期难于相遇, 只好选择与 Co419 血缘相近的亲本
ROC25 作为替代亲本回交, 最终获得有足够后代的 BC1
群体。而热带种×割手密杂交后代由于获得后代数量少且
难于回交, 无法用于遗传连锁图谱构建研究。群体大小在
很大程度上决定了构建遗传图谱的分辨率和精度 , 群体
越大, 作图精度越高[17], 基因定位也越准确, 对于杂交后
代基因型复杂多样的多倍体作物, 群体数量越大越好[19],
本研究两个群体数量分别为 269个和 266个, 大于国外作
图群体数量, 因此适合开展相关研究。
3.2 作图分离标记的选择
由于甘蔗品种及割手密都属于遗传基础比较复杂的
多倍体 , 很难判断分离群体的类型和基因分离模式
(AA×Aa、Aa×Aa、Aa×aa、aa×Aa、Aa×AA), 因此在分离
标记的统计时所有分离模式都给予考虑。前人研究表明,
甘蔗的基因位点高度杂合 , 一个基因座上有多个标记或
等位基因, 因此很难确定后代群体的基因型, 极大影响了
甘蔗遗传图谱的构建, Wu 等[19]依据二倍体作物的染色体
配对行为及与多倍体的同源性 , 发展了一种新的多倍体
遗传图谱构图方法 , 该方法从分离标记里选出符合孟德
尔遗传规律的标记如单剂量标记(1 1∶ 和 3 1)∶ 、双剂量
标记(11 3)∶ 用于遗传图谱构建, 促进了甘蔗分子遗传连
锁图谱研究的发展。根据该方法, 割手密 SES208、热带
种 La Purple、品种 SP701006、品种 R570、品种 Q165的
分子遗传连锁图谱相继被构建[7-16]。鉴于此单双剂量的检
测数量和比例可作为检测作图群体质量的条件之一。本研
究表明, 两个群体单双剂量的检测比例在 46%~47%之间,
其他多剂量标记和偏分离标记所占的比例在 53%~54%之
间, 两群体间没有大的差异, 而与 Hoarau 等[9]构建的 R570
自交群体和 Aitken等[7]构建的 Q165×IJ76-514 (热带种)群
体 79%的单双剂量标记检出效率相比, 两个群体还存在
差距。
3.3 甘蔗遗传连锁图谱
构建分子标记遗传连锁图谱是性状基因定位及分子
标记辅助选择育种的基础[21]。由于多倍体作物的统计分
析远复杂于二倍体作物 , 后代群体基因型复杂及对基因
组成结构不清楚 , 导致多倍体作物的分子遗传连锁图谱
研究落后于二倍体作物[22]。而甘蔗属于更为复杂的多倍
体 , 基因组血缘组成高度复杂 , 染色体数量庞大 , 在
100~150 条之间, 因此相关分子遗传连锁图谱研究落后于
其他作物[1,6-9]。虽然倍性相对简单的甘蔗两个原始亲本热
带种和割手密及现代甘蔗品种 R570、Q165的分子遗传连
锁图谱相继被构建, 但图谱的覆盖范围还比较小, 且标记
之间遗传距离还很大, 都属于极度不饱和图谱。如近年来
使用大量分子标记构建的 R570[9]和 Q165[7]图谱, 遗传距
离分别到达了 5 849 cM和 9 058.3 cM, 也仅覆盖了甘蔗基
因组的一半左右。本研究使用 SSR, AFLP 标记构建了两
张甘蔗的分子遗传连锁图谱, 其中 F1群体图谱由 55 个遗
传连锁群组成, 遗传距离为 1 458.3 cM; BC1群体图谱由
47个遗传连锁群组成, 遗传距离为 1 059.6 cM, 总体来说
F1 群体的构图质量要高于 BC1 群体, 但图谱覆盖基因组
较小, 不饱和度高。据 Hoarau等[9]和 Aitken等[7]的初步估
计, 甘蔗的遗传距离大约在 17 000~18 000 cM之间, 如果
要构建一个平均距离为 0.5 cM 的饱和遗传连锁图谱, 大
概需要 34 000~36 000个单双剂量标记, 即使按照 80%的
单双剂量标记入选率来算, 也需要 42 500~45 000个分离标
记, 这远大于水稻的 3 000个标记, 玉米的 5 000个标记[17],
因此构建甘蔗的饱和遗传图谱在现阶段依然是不可能完
成的, 阻碍了利用图位克隆技术 [23]开展甘蔗相关数量质
量基因的定位研究。目前利用其他生物技术发掘甘蔗优良
基因将成为甘蔗分子遗传学研究新的热点领域 , 同时进
一步增强对甘蔗诱导开花的花期调控能力 , 利用倍性简
单的热带种创建永久分离群体开展图谱构建值得我们尝
试和探索。
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