全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(5): 788−793 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD06B03)和国家公益性行业(农业)科研专项(nyhyzx07-018)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 熊和平, E-mail: ramiexhp@2118.cn; Tel: 0731-88998500
第一作者联系方式: E-mail: ibfc-maxif@163.com
Received(收稿日期): 2009-08-26; Accepted(接受日期): 2009-12-21.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00788
根癌农杆菌介导的转双价抗虫基因(CryIA+CpTI)苎麻
马雄风 1,3 喻春明 1 唐守伟 1 郭三堆 2 张 锐 2 王延周 1 朱爱国 1
朱四元 1 熊和平 1,*
1 中国农业科学院麻类研究所 / 农业部麻类遗传改良与工程微生物重点开放实验室, 湖南长沙 410205; 2 中国农业科学院生物技术
研究所, 北京 100081; 3 中国农业科学院棉花研究所, 河南安阳 455000
摘 要: 利用苎麻下胚轴高频再生体系, 将携带人工合成的 CryIA杀虫基因和 CpTI基因的高效双价杀虫基因的植物
表达载体 pGBI4ABC转化到苎麻主栽品种中苎 1号中。经根癌农杆菌侵染和共培养后, 用 50 mg L−1卡那霉素+ 300
mg L−1头孢霉素筛选共获得 32株抗性植株; PCR检测显示 26株为阳性, 占 80%。Southern杂交结果证实, 外源基因
已经整合到苎麻的基因组中。这项研究为最终创造兼抗鳞翅目及鞘翅目等害虫的苎麻种质材料奠定了基础。
关键词: 苎麻; 抗虫基因; 根癌农杆菌; 转基因植株
Transgenic of Ramie with Synthetic CryIA+CpTI Gene by Agrobacterium tume-
faciens-Mediated
MA Xiong-Feng1,3, YU Chun-Ming1, TANG Shou-Wei1, GUO San-Dui2, ZHANG Rui2, WANG Yan-Zhou1,
ZHU Ai-Guo1, ZHU Si-Yuan1, and XIONG He-Ping1,*
1 Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic Improvement & Engineering Microbiology for
Bast Fiber Crops, Changsha 420105, China; 2 Biotechnology Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
3 Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Anyang 455000, China
Abstract: Ramie [Boehmeria nivea L. (Guad.)] is a perennial herbaceous plant of the urticaceae family. Ramie can be affected by
many insect pests above and below the ground during the growing season. The pests damage has become an important factor affecting
ramie yield and quality in China. Application of chemical insecticides not only is less effective and costly, but also causes environ-
mental pollution. Development of a genetic transformation system to introduce desired genes (e.g. toxin genes) into ramie could im-
prove its agromonic traits such as resistance to insects. The study was conducted to transfer CryIA gene and CpTI gene into the ramie
variety Zhongzhu 1. The CryIA gene encodes Bt toxin protein from Bacillus thuringiensis toxin of Vitis pseudoreticulata; while, the
CpTI gene encodes a cowpea trypsin inhibitor produced by Vigna unguiculata. Synthesized CryIA gene and CpTI gene were inserted
into plant expression vector pGBI4ABC which carried high efficient bivalent insect resistant genes. With high frequency of adventi-
tious shoot induction and plant regeneration, ramie hypocotyls of the variety Zhongzhu 1 were transformed with Agrobacterium tu-
mefaciens strain LB4404 harboring the plant expression vector pGBI4ABC, and then shoot buds formed from calli induced from hy-
pocotyls were selected with the mixed solution of 50 mg L−1 Kanamycin and 300 mg L−1 Cefotaxime. The result showed that 32
Kanamycin-resistant plants were obtained, and therein 26 plants were positive in PCR test, indicating that 80% of the Kanamy-
cin-resistant plants contain CryIA gene and CpTI gene. Southern blot and GUS analysis also verified that the foreign genes of CryIA
and CpTI were successfully integrated into the genome of the transgenic plants and expressed.
Keywords: Ramie; Insect resistant genes; Agrobacterium tumefaciens; Transegenetic plants
苎麻[Boehmeria nivea L. (Guad.)]是荨麻科苎麻
属宿根型多年生草本植物, 生产上受鳞翅目(如苎麻
夜蛾、苎麻黄蛱蝶、苎麻斑蛱蝶等)和鞘翅目(如金
龟子、苎麻天牛等)等害虫的危害, 严重影响产量和
品质[1]。抗虫育种采用转基因手段, 抗虫专一性好,
对环境影响小, 目前该技术已成功用于棉花、玉米
等许多农作物[2]。本研究中用的 CryIA 基因是人工
合成的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bacillus
第 5期 马雄风等: 根癌农杆菌介导的转双价抗虫基因(CryIA+CpTI)苎麻 789


thuringiensis, Bt), CpTI基因是用 PCR的方法对豇豆
胰蛋白酶抑制剂基因进行修饰, 在基因内部去除了
EcoR I位点, 在基因的 5′及 3′端分别增添 Pst I、Sac
I位点, 并去除 5′端约 50 bp非翻译序列, 构建到植
物表达载体 pBI121 上, 获得的双价基因表达载体
pGBI4ABC [3]。本文以苎麻下胚轴为外植体材料, 采
用农杆菌介导法将 CryIA和 CpTI双价抗虫基因导入
苎麻植株中, 获得了双价抗虫苎麻新材料, 以期达
到抗鳞翅目、鞘翅目害虫的育种目标。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 植物材料 由中国农业科学院麻类研究所
国家种质资源圃提供栽培品种中苎 1 号和中饲苎 1
号种子, 择籽粒饱满、有光泽的种子, 用 95%的酒精
浸泡 1 min; 转入 0.1%升汞浸泡 5~10 min; 用无菌
水洗涤 3~4次, 每次约 3 min, 洗涤过程中不断搅动
种子, 以清除种子表面残留的升汞; 然后用无菌滤
纸吸干种子表面的液体, 置无激素的 1/2 MS培养基
上培养, 切取 7~8 cm株高无菌苗的下胚轴。
1.1.2 质粒和菌株 由中国农业科学院生物技术
所郭三堆研究员提供双价抗虫基因(CryIA+CpTI)表
达载体 pGBI4ABC (图 1)。菌株为根癌农杆菌(Agro-
bacterium tumefaciens) LBA4404。
1.1.3 酶和试剂 各种限制性内切酶和 Taq DNA
聚合酶均购自MBI公司, DNA凝胶回收试剂盒购自
北京天为时代公司, 抗生素为 Sigma 产品, 其他生
化试剂为国产分析纯。Southern 杂交试剂盒 DIG
High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
和 RNA 探针标记试剂盒 DIG RNA Labeling Kit
(SP6PT7)购自德国 Roche公司。
1.1.4 培养基 (1) 农杆菌培养所用培养基为
LB; (2) 种子苗培养基为 1/2MS培养基(含 3%蔗糖);
(3) 愈伤组织诱导培养基为 MS + 1 mg L−1 6-BA +
0.1 mg L−1 TDZ + 3%蔗糖; (4) 分化培养基为 MS +
0.1 mg L−1 IAA + 0.05 mg L−1 TDZ + 0.2 mg L−1
GA3+ 3%蔗糖; (5) 生根培养基为 MS + 1 mg L−1
NAA。
1.2 农杆菌活化
挑取培养皿平板上含质粒 pGBI4ABC 的单菌落,
接种于 LB培养基(含 50 mg L−1 Kan + 50 mg L−1 Str
+ 25 mg L−1 Rif), 在 28℃ 220×g摇床上振荡培养过
夜。24 h后取 1 mL上述培养液, 转移至相同的新鲜
LB 培养基中, 在 28℃、220×g 摇床上振荡培养至
OD600约为 0.5, 在 8 000×g下离心 2 min, 弃上清液,
沉淀用同体积 MS基本培养基重新悬浮备用[4]。
1.3 侵染和共培养
外植体采用由无菌苗得到的下胚轴切段。将下
胚轴在农杆菌重悬液中浸泡 8 min (期间不断摇动菌
液使侵染充分), 无菌滤纸吸干后转入添加 0.1 mg
L−1 AS的愈伤组织诱导培养基, 在 28℃条件下黑暗
共培养 2 d。
1.4 植株再生和 Kan抗性筛选
将预培养 2 d的下胚轴转至含 200 mg L−1 Cef
的诱导培养基上培养 7 d, 然后将愈伤组织转至含
200 mg L −1 Cef和 50 mg L−1 Kan的分化培养基上,


图 1 双元表达载体 pGBI4ABC 示意图
Fig. 1 Sketch map of binary expression vector pGBI4ABC
790 作 物 学 报 第 36卷

培养条件为 25℃和 40 μmol m−2 s−1连续光照(期间每
3周换 1次新鲜培养基)。当分化的抗性芽长 2~3 cm
时, 切下小芽转入含 50 mg L−1 Kan和 200 mg L−1
Cef 的生根培养基进行抗性植株生根筛选, 以获得
完整植株。
1.5 DNA提取
利用改良 CTAB 法提取植株幼嫩组织总
DNA[5]。
1.6 RNA提取
取转基因植株叶片混合液氮速冻研磨后 , 用
Invitrogen专门针对含较多酚、树脂、淀粉等植物组
织设计的试剂 Plant RNA Reagent, 进行提取。用吸
光值法测定韧皮纤维各时期的 RNA 的浓度和纯度,
凝胶电泳检测 RNA 的完整性。将符合要求的 RNA
样品保存于−80℃备用。
1.7 PCR检测
利用 1对Bt基因特异性引物Bt1 (5-CCTCTTCT
AACTTGCCCTCCGC-3)和 Bt2 5-CACCCACGAT
GTTACCGAGTG-3和 1 对 CpTI 基因特异性引物
Cpti1 (5-GATTTGAAGCACCTCGGAAG-3)和 Cpti2
(5- CTCATCATCTTCATCCCTGG-3)进行 PCR检测,
以 pGBI4ABC质粒和非转基因植株质粒分别为阳性
和阴性对照。PCR 扩增体系为 25 μL, 扩增程序为
94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min 30 s, 35
个循环; 72℃延伸 10 min。取 5 μL PCR产物进行 1%
琼脂糖凝胶电泳, 分离并观察扩增产物。
1.8 GUS组织染色
参照文献[6]的方法进行转基因再生植株的 GUS
活性检测。
1.9 Southern blot检测
分别取 30~40 μg 转化和对照植株的基因组
DNA, 以限制性内切酶 EcoR I (CryIA基因中没有该
酶切位点)在 37℃下酶切 12 h。酶切产物经 1.2%的
琼脂糖凝胶电泳分离 (0.5×TBE 缓冲液 )后 , 转移
DNA 到尼龙膜(Roche, Germany)上, 与 CryIA 基因
探针杂交。按 DIG High Prime DNA Labeling and
Detection Starter Kit I (Roche, Germany)使用说明进行
探针标记、标记效率检测、膜杂交及显色处理等[7]。
2 结果与分析
2.1 转基因植株的获得
将培养 10 d后的种子无菌苗下胚轴作为农杆菌
侵染的外植体受体, 预培养 2 d后, 经共培养后分别
置含 50 mg L−1 Kan + 200 mg L−1 Cef的下胚轴分化
培养基上培养。10 d后下胚轴在含卡那霉素的分化
培养基上开始膨大并产生愈伤组织(图 2-B), 而在

图 2 转化植株的再生及 GUS 活性检测
Fig. 2 Regenerated plantlets and analysis of GUS activity
A: 非转化愈伤组织; B: 抗性愈伤组织; C: 抗性植株再生; D: 具有抗性芽的愈伤组织; E: 生根的转基因小苗; F: 移栽的转基因植株;
G: 共培养 2 d后的下胚轴 GUS的瞬时表达; H: 抗性愈伤组织 GUS表达; I: 转基因叶片 GUS表达。
A: non-transformed calli on the selective medium containing kanamycin; B: calli induced from hypocotyls; C: shoot buds formed from calli
induced from hypocotyls; D: shoots amplified on subculture medium; E: rooting on MS basal medium with 2.46 μmol L–1 NAA; F: plantlets
transferred to trays; G: transient GUS expression in hypocotyls explants after 2 d co-cultivation with LBA4404 in the dark; H: GUS expres-
sion of calli from hypocotyls; I: GUS expression of transgenic leaf.
第 5期 马雄风等: 根癌农杆菌介导的转双价抗虫基因(CryIA+CpTI)苎麻 791


15 d后未经农杆菌侵染的下胚轴在含卡那霉素的选
择培养基上都黄化死亡(图 2-A)。20 d后下胚轴边缘
有绿色凸起, 30 d 后凸起处直接分化出绿色芽点(图
2-B), 40 d后绿色芽点抽出绿色单芽(图 2-D)。当抗性
芽长到 2 cm 时转到生根培养基(图 2-E), 经芽分化和
诱导生根两个阶段筛选, 共获得 32株抗性植株。
2.2 PCR分析
抗性植株 DNA扩增到 CryIA基因 591 kb的特
异性片段和CpTI基因的 281 kb的特异性片段, 与试
验预期片段和阳性对照吻合, 而非转化植株则无该
片段的产生(图 3)。32株抗性植株中有 26株扩增到
特异性条带, 占 80%。

图 3 转化植株的 PCR 检测
Fig. 3 PCR analysis of transformed plants
M: DNA分子量标记; 1: pGBI4ABC质粒; 2: 非转基因苎麻植株;
3~17: 转基因苎麻植株。
M: 200 bp ladder; 1: plasmid pGBI4ABC; 2: non-transgenenic
plants; 3–17: transgenenic plants.

2.3 再生植株的 RT-PCR鉴定
提取的苎麻总RNA用无RNase的DNase I处理,
除去污染的基因组 DNA。以未转化的阴性对照和再
生植株的叶片总 RNA 为模板逆转录合成 cDNA 第
一链, 用 CryIA基因和 CpTI基因的引物扩增到部分
片段, 检测结果如图 4。阴性对照泳道 2中没有扩增
条带, 而泳道 3~6 转化的植株中扩增出明显的特异
条带。这表明目的基因已经整合入基因组, 并且可
以转录为 mRNA。

图 4 转化植株的 RT-PCR 检测
Fig. 4 Detection of transgenic plants by RT-PCR
M: DNA分子量标记; 1: pGBI4ABC质粒; 2: 非转基因苎麻植株;
3~6: 转基因苎麻植株。
M: 200 bp ladder; 1: plasmid pGBI4ABC; 2: non-transgenenic
plants; 3–6: transgenic plants.
2.4 GUS组织染色
所有未转化的下胚轴、愈伤组织和叶片中没有
检测到 GUS 表达活性。共培养 2 d 后的下胚轴中
GUS 的瞬时表达和抗性愈伤组织中检测表现阳性,
呈现蓝色反应(图 2-G~H)。为测定外源目的基因的
稳定表达效果, 选取部分 PCR检测阳性植株叶片进
行 GUS酶组织化学检测。检测结果表明, 部分叶片
呈阳性反应(图 2-I)。
2.5 Southern blot分析
为明确外源 CryIA 基因在苎麻基因组中的整合
拷贝数, 提取部分(5 株) PCR 鉴定阳性植株的基因
组 DNA, 酶切后产物进行电泳转膜 , 以标记的
CryIA基因探针与其进行 Southern杂交。结果发现 2
株各有 2条杂交带, 3株各有 1条杂交带, 非转基因植
株无杂交信号, 表明外源基因已整合到苎麻基因组的
DNA中, 且外源基因多以单拷贝形式插入(图 5)。

图 5 转化植株 Southern blot 检测
Fig. 5 Detection of transgenic ramie by Southern blot
C: 非转基因苎麻植株; 1~5: 转基因苎麻植株。
C: non-transgenic ramie; 1–5: transgenic plantlets.

3 讨论
由于苎麻为高度杂合体, 其遗传背景十分复杂,
有性杂交等常规方法育种周期长, 工作量大和效率
低 , 难以取得育种上的突破 , 因此 , 利用外源基因
进行苎麻定向遗传改良研究一直倍受人们关注。
1993 年, Dusi 等[8]首次报道根癌农杆菌介导苎麻的
遗传转化。易自力等[9]和汪波等[10]又报道了根癌农
杆菌介导的苎麻遗传转化方法, 但这些研究大多以
证明根癌农杆菌介导的苎麻遗传转化方法的可行性
为目的, 而且以苎麻子叶为外植体建立遗传转化体
系也存在着转化周期长和转化率低等缺点[11-17]。目
前苎麻的遗传转化受到基因型的限制, 本文在前人
792 作 物 学 报 第 36卷

研究的基础上, 以目前推广面积最大的栽培品种中
苎 1号为试材, 采用本实验室多年研究的苎麻下胚
轴高频再生体系 [13], 在已优化转化条件的基础上 ,
建立了该品种的遗传转化体系[18]。由于该体系直接
转化主要的推广栽培品种, 其利用潜力大大增加。
本研究得到了 32株抗性株。其中有 26株 PCR
检测阳性, 占抗性植株总数的 80%, 可能是转化产
生嵌合体和转化后基因沉默等原因造成的。在短时
间内以器官再生途径再生植株很容易造成嵌合体现
象, 但可通过自交的育种方式解决该问题。
通过对 4株 PCR阳性植株的 RT-PCR检测发现,
转化植株的 cDNA 模板都可扩增出明显的抗虫基因
的特异条带, 表明目的基因已经整合入基因组, 并
且可以转录为 mRNA, Southern 杂交检测表明外源
基因多以单拷贝或双拷贝形式插入。
GUS 组织染色检测结果表明, 抗性愈伤组织中
检测表现阳性, 但对植株的叶片的检测发现有部分
叶片呈阳性反应, 也有没有呈现蓝色的反应的叶片,
这也有可能是嵌合体的存在造成的。
本文以对抗性植株的分子检测为主要研究内容,
我们还将继续检测转基因植株的抗虫性, 由于苎麻
的重要害虫每年都在 7~8 月暴发, 且目前农杆菌转
化转基因植株仅仅是 T0代, 还需进行多代材料的系
统抗虫鉴定实验和转基因后代的遗传分析, 以确定
转化所得转基因植株在苎麻分子育种中的应用
价值。
2007年, 全球 Bt抗虫棉的种植面积达 1 400万
公顷, 我国的抗虫棉种植面积达 380 万公顷[19]。与
棉花相似, 苎麻为纺织业原料, 不直接进入人的食
物链。转基因品种容易被批准在生产中使用。目前
成功利用的抗虫基因主要是 Bt 杀虫晶体蛋白和
CpTI 基因。其中经人工改造后的 Bt 杀虫晶体蛋白
抗虫性大大提高。郭三堆等人率先构建了双价抗虫
基因(CryIA+CpTI), 并已导入到大面积应用的棉花
生产品种中, 培育出第二代抗虫棉。因此, 本实验选
用郭三堆等人率先构建的双价抗虫基因 (CryIA
+CpTI), 有针对性地将其转入苎麻, 得到抗虫转基
因株系, 有望培育双价抗虫苎麻新品系。
4 结论
利用苎麻种子苗下胚轴再生体系将双价抗虫基
因导入目前推广面积最大的栽培品种中苎 1 号, 这
为后续的抗虫苎麻田间生物学鉴定奠定了基础。
致谢: 感谢宋芸老师在转基因工作中的给予的帮助。
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