全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(1): 1−7 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(30471098); 教育部重点科技项目(204101); 湖南省教育厅重点项目(03A017)
作者简介: 严明理(1979– ), 男, 湖南省洞口县人, 博士生, 研究方向为作物分子育种。Tel: 0731-4635290; Fax: 0731-4618778;
E-mail: ymljack@126.com。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘忠松(1963–), 男, 湖南省常宁市人, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向为油菜分子育种。
Tel: 0731-4618158; Fax: 0731-4618778; E-mail: zsliu48@sohu.com
Received(收稿日期): 2007-06-15; Accepted(接受日期): 2007-08-26.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00001
芥菜型油菜 4-二氢黄酮醇还原酶基因的克隆和表达分析
严明理 刘显军 刘忠松* 官春云 袁谋志 熊兴华
(湖南农业大学油料作物研究所, 湖南长沙 410128)
摘 要: 利用同源克隆方法, 在芥菜型油菜中克隆了 DFR 基因。在 DNA 和 cDNA 中扩增的 DFR 基因大小分别为
1 612 bp和 1 214 bp。该基因含有 5个内含子, 开放阅读框为 1 158 bp, 预计编码 385个氨基酸, 预测分子量为 42 886.0 Da,
推测的等电点为 5.54。DFR 基因在芥菜型油菜紫叶芥和黑籽近等基因系的叶片、胚和种皮中都表达, 在四川黄籽中
只在叶片和胚中表达。DFR 基因在四川黄籽种皮中不表达, 导致种皮中花色素和原花色素不能合成, 从而种皮透明,
形成黄籽, 因此 DFR基因是油菜种皮颜色形成途径中一个关键基因。本研究为利用该基因与种子、种皮特异启动子
构建反义表达载体或 RNAi载体, 阐明油菜种皮颜色形成的分子机理和创造黄籽油菜新种质奠定了基础。
关键词: 芥菜型油菜; 4-二氢黄酮醇还原酶基因; 克隆; RT-PCR分析
Cloning and Expression Analysis of the Dihydroflavonol 4-reductase
Gene in Brassica juncea
YAN Ming-Li, LIU Xian-Jun, LIU Zhong-Song*, GUAN Chun-Yun, YUAN Mou-Zhi, and XIONG Xing-Hua
(Oilseed Research Institute, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China)
Abstract: The yellow-seeded cultivars of rapeseed have higher oil content than those of the black-seeded varieties. Yellow seeds
of rapeseed have lower fibre content compared with those of black-seeded varieties. They may also have higher protein content
than black seeds. Higher protein content and lower crude fibre content are desirable traits in rapeseed meal, which is the most
important fodder product of rape. However, there is little knowledge on the biosynthesis of seed coat color in rapeseed. Therefore,
it is necessary to elucidate the mechanism of seed coat color in rapeseed. Dihydroflavonol 4-reductase (DFR) gene is a key gene
in the way of proanthocyanidins biosynthesis of seed coat in Arabidopsis thaliana, its mutation caused transparent testa. In order
to study molecular mechanism of seed coat color in rapeseed, dihydroflavonol 4-reductase (DFR) gene was cloned from Brassica
juncea using homology-based cloning strategy. The cloned gene of 1 612 bp contains 5 introns. The complementary DNA (cDNA)
consists of 1 214 bp and has an open reading frame of 1 158 bp encoding a deduced polypeptide of 385 amino acids with a pre-
dicted molecular weight of 42 886.0 Da and an estimated isoelectric point of 5.54. RT-PCR analysis showed that DFR expressed
in leaves, embryos and seed coats of Purple-leaf Mustard (PLM) and two black-seeded near-isogenic lines (NILs) developed from
backcross breeding using Sichuan Yellow (SY) as a current parent, whereas the gene expressed only in the leaves and embryos of
SY, not in the seed coats. No expression of DFR blocked the biosynthesis of anthocyanidins and proanthocyanidins in yellow seed
coats, and seeds displayed yellow appearance because of transparent testa. So DFR is a key gene for the formation of seed coat
color in B. juncea. This work provided a foundation for understanding molecular mechanism of seed coat color and developing
novel yellow-seeded rapeseed germplasm through antisense expression or RNAi-suppression of DFR gene in black-seeded culti-
vars using a seed- or seed-coat-specific promoter.
Keywords: Brassica juncea; Dihydroflavonol 4-reductase gene; Cloning; RT-PCR analysis
2 作 物 学 报 第 34卷

在相同遗传背景下, 黄色种皮油菜与黑色种皮
油菜相比具有种皮薄、含油量高、油中色素和杂质
少、木质素含量低等优点[1-3], 因此, 选育黄籽油菜
新品种是当前油菜育种的一个主要目标。虽然育种
家培育了许多黄籽甘蓝型油菜, 但甘蓝型油菜黄籽
性状遗传不稳定仍然是黄籽油菜育种的一个重要难
题。黄籽由黑籽突变产生[1], 芥菜型油菜黄籽性状一
般由 2 对隐性重叠基因控制[1,4], 这些基因位点编码
什么基因尚未见报道。在拟南芥中种皮颜色的突变
与控制类黄酮合成基因有关, 已经发现 22 个基因
(tt1-tt19、ttg1、ttg2和aha10)突变形成种皮透明突变体
[5]。这些基因一部分为结构基因, 编码参与类黄酮生物
合成的酶; 一部分为调控基因, 编码控制类黄酮生物
合成的转录因子; 还有一些编码色素转运积累有关的
蛋白质。油菜与拟南芥同属十字花科, 推测在芥菜型
油菜中控制类黄酮合成的途径可能与拟南芥类似。
4-二氢黄酮醇还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,
DFR)是拟南芥类黄酮合成途径中一个关键酶, 它催
化 香 橙 素 (dihydrokaempferol), 二 氢 槲 皮 素
(dihydroquercetin), 二氢杨梅酮(dihydromyricetin)等
形成白花色苷 (leucoanthocyanidins), 该类物质的A
环主要为邻二酚羟基结构等黄烷醇类物质[6-8]。拟南
芥的TT3 基因编码DFR, 其突变体导致种皮中花青
素和原花色素不能合成, 种皮黄色透明, 与野生型
的黑色种皮区别明显。芥菜型油菜黑色种皮中含有
3-OH的黄烷醇类多酚, 而黄色种皮没有; 黑色种皮
的黄酮醇类多酚A环主要为邻二酚羟基结构, 而黄
色种皮的黄酮醇类多酚A环主要为单酚羟基[9]。因此
推断芥菜型油菜种皮类黄酮合成途径的差异导致种
皮颜色的变化。
本研究根据已经发表的DFR基因序列设计引物
从黑籽紫叶芥中克隆 DFR基因, 并对该基因在紫叶
芥、四川黄籽及其黑籽近等基因系叶片、种子和种
皮中的表达进行了分析。
1 材料与方法
1.1 试验材料
亲本紫叶芥(种皮黑色)、四川黄籽(种皮黄色)以
及通过连续回交培育的 2 个含有单个显性基因的黑
籽近等基因系NILA和NILB [4]。
1.2 油菜叶片总 DNA提取
用CTAB方法提取四川黄籽、紫叶芥叶片总DNA。
1.3 油菜种子和叶片总 RNA提取
在冰上用镊子剥取 0.1 g油菜种子或叶片于预冷
的研钵中, 加液氮迅速研磨成粉末, 移入加有 500 μL
裂解液RL (TIANGEN公司, 使用前在 1 mL裂解液
中加 20 μL β-巯基乙醇)的离心管中。涡旋混匀、在
室温下静止 5 min, 加 400 μL苯酚-氯仿(25∶24)混
匀, 4 ℃ 16 000×g离心 5 min, 转移上清液至新离心
管中, 加上清液 0.1 倍体积的 3 mol L−1醋酸钠和 2
倍体积的无水乙醇 , 倒转几次混匀后在冰上放置
5 min。4 ℃ 16 000×g离心 4 min, 弃上清液, 75%乙
醇洗沉淀 2次, 室温下干燥, 用 200 μL DEPC处理的
高温灭菌双蒸水溶解沉淀, 置−70℃备用。
1.4 油菜种皮总 RNA提取
用镊子在冰上剥取油菜种皮, 立即放入盛有液
氮的小玻璃瓶, 当剥得约 0.1 g种皮后, 将其倒入预
冷研钵在液氮中迅速研磨成粉末。其他步骤同 1.3。
1.5 cDNA合成
用DNaseⅠ(TaKaRa)消化所得的RNA样品中的
DNA, 按TOYOBO公司的反转录酶操作说明反转录
成cDNA作为PCR模板。反转录反应体系总体积为 20
μL, 含无菌去离子水 10 μL, 5×RT buffer 4 μL, dNTP
mix(10 mmol L−1each) 2 μL, RNA酶抑制剂 (40 U
μL−1) 1 μL, oligo(dT)18 (10 μmol L−1)1 μL, 总RNA(1
μg μL−1) 1 μL, 反转绿酶(100 U μL−1) 1 μL。反转录
程序为 42℃合成cDNA 20 min; 99℃灭活 5 min,
4℃冷却 5 min, 反应完毕瞬间离心, 做PCR反应的
模板。
1.6 DFR基因同源克隆
以紫叶芥总DNA和种子 cDNA为模板进行基因
全长克隆。参照 NCBI上报道的 DFR基因(NM123645,
AY95320, AY228487, AK221622)全长的 5′端和 3′
序列设计引物。DFR 基因扩增用的引物 DFRU 是 5′
端引物 5′-AAWTAATGGTAGSTCASAAAGAG-3′;
3′端引物 5′-AAATCACACATTCATWAGWCAATMG-3′,
由上海英俊生物公司(Invitrogen Biotech- nology Co.,
Ltd.)合成。
PCR反应体系总体积为 20 μL, 含 10×PCR
buffer(2.0 μL)、dNTP mix(10 mmol L−1 each, 0.3 μL)、
10 mmol L−1 Forward Primer (1 μL)、10 mmol L−1
Reverse Primer(1 μL)、1 U Taq DNA聚合酶、 2.5
mmol L−1 MgCl2 (2 μL)、50 ng DNA模板或 1 μL反转
录产物、无菌去离子水(补足到 20 μL)。以上试剂购
自北京TIANGEN生物公司。
第 1期 严明理等: 芥菜型油菜 4-二氢黄酮醇还原酶基因的克隆和表达分析 3


析。利用 ACTIN基因的表达水平作为为基因表达分
析的内参。ACTIN基因扩增用的引物 ACT(5′端引物
序 列 为 5′-GACATTCAACCTCTTGTTTGCG-3′;
3′端引物序列为 : 5′-CTGCTCGTAGTCAAGAGCA
ATG-3), 反应体系同前。DFR基因的 PCR扩增程序
是 94℃预变性 4 min; 94℃变性 50 s, 58℃退火 50 s,
72℃延伸 60 s, 循环 38次; 最后 72℃延长 6 min。
ACTIN 基因的 PCR 扩增退火温度是 54℃, 循环 30
次, 其他同 DFR基因。
PCR扩增程序如下: 94℃预变性 4 min; 94℃变
性 50 s, 55℃退火 50 s, 72℃延伸 90 s, 循环 38次; 最
后 72℃延长 6 min。
将 PCR 产物用 QIAquick Gel Extraction Kit
(QIAGEN)进行切胶回收纯化后 , 连接到 pMD18-T
Vector (TaKaRa), 热激转化到大肠杆菌 DH5α, 进行
Amp抗性和 X-gal/IPTG蓝白斑筛选。选白色菌落做
菌落 PCR, 将检测结果为阳性的菌落进行 LB 液体
培养, 以强碱法提取质粒。以质粒为模板进行 PCR
检测。每个片段选取 2 个含阳性质粒菌的菌液送上
海英俊生物技术公司用 M13 引物进行双向测序 ,
将测序结果拼接，得到序列与GenBank/DDBJ/EMBL
数据库进行生物信息学分析。应用 ClustalW 1.83 软
件(http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/clustalw)对推导的氨
基酸序列进行多序列比较构建系统树。
2 结果与分析
2.1 芥菜型油菜 DFR基因的克隆
用引物 DFRU 扩增紫叶芥叶片总 DNA 获得 1
条约 1 600 bp左右带, 扩增紫叶芥种子 cDNA获得
了 1条约 1 200 bp带, 将上述扩增产物进行测序, 测
得长度分别为 1 612 bp和 1 214 bp, 序列比对发现
DFR基因含有 5个内含子(图 1中下划线序列), 起始
编码子为 ATG, 终止编码子为 TAG, 见图 1。将所克
隆的 DFR 基因的 DNA 序列在 NCBI 上进行 Blastn
分析, 发现与白菜型油菜(B. rapa)的 DFR 全长序列
1.7 DFR基因差异表达分析
根据上面所测序列, 在 DFR基因的保守区设计
引物 DFRD(5′端引物: 5′-CTCACAAAGAGACCG
TGTGCGTAAC-3′; 3′端引物序列为: 5′-CTCCAT
TCACTGTCGGTTTTATCAC-3′) 用于基因表达分


图1 芥菜型油菜DFR基因核酸序列和推导的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of DFR gene in Brassica juncea
图中阴影部分为引物DFRU, 下划线序列为5个内含子, 黑体为起始编码子ATG和终止编码子TAG。
The primer DFRU are shaded, the 5 introns are solid-underlined, boldfaced letters form are the start codon ATG and the stop codon TAG.
4 作 物 学 报 第 34卷

(AY953249)相似性最高, 为 96%, E值为 0.0; 与拟南
芥 DFR 基因的 DNA 序列(AB033294)的相似性为
78%, E值为 0.0。
同时将所克隆的 DFR 基因的 mRNA 序列在
NCBI 上进行 Blastn 分析, 发现与白菜型油菜(B.
rapa)的 DFR mRNA 序列(AY953250)相似性最高,
为 99%, E值为 0.0; 与拟南芥 DFR基因的 mRNA序
列(NM123645)的相似性为 85%, E值为 0.0。因此认
为, 本研究所克隆的基因就是芥菜型油菜的 DFR基
因。用 DFRU 引物扩增四川黄籽的叶片 DNA 和种
子的 cDNA, 同样分别获得 1条约 1 600 bp和 1条约
1200 bp 带, 测序和序列比对发现与紫叶芥的序列
完全一致, 并在 GenBank 登录, 基因登录号分别为
EF128034和 EF128035。
2.2 芥菜型油菜 DFR 基因推导酶蛋白氨基酸序
列比较与分子进化分析
根据 DFR cDNA序列, 利用软件 DNAMAN 3.0
所推导得到的蛋白质序列见图 1, 该基因编码 385个
氨基酸, 命名为 BjDFR。在线进行编码蛋白质分析
(http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam), 发现该基
因编码 385氨基酸, 分子量为 42 886.0 Da, 推测的
等电点 (pI)为 5.54。在线进行保守区域分析
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)
结果表明 , 芥菜型油菜 4-二氢黄酮还原酶属于
pfam01073, 3-β羟类脱氢酶或异构酶家族。BLASTp
分 析 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp) 结 果 表
明, 芥菜型油菜 DFR 编码蛋白与许多其他植物的
4-二氢黄酮醇还原酶有高度同源性 , 其中与白菜
(AAX53571) DFR同源性最高为 99%, E值为 0.0。多
序列比较 (http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/clustalw/clustalw
1.83)结果表明 , 芥菜型油菜与多种高等植物在
DFR 酶蛋白氨基酸序列系统进化上有高度保守
性(图 2), 与白菜、甘蓝和拟南芥的 DFR 基因属于
一类(图 3)。

BjDFR ----MVAHKETVCVTGASGFIGSWLVMRLLERGYFVRATVRDPGNLKKVQHLLDLPNAKT 56
AAX53571 ----MVAHKETVCVTGASGFIGSWLVMRLLERGYFVRATVRDPGNLKKVQHLLDLPNAKT 56
AAO73442 ----MVAHKETVCVTGASGFIGSWLVMRLLERGYFVRATVRDPGNLKKVQHLLDLPNAKT 56
BAA85261 ----MVSQKETVCVTGASGFIGSWLVMRLLERGYFVRATVRDPGNLKKVQHLLDLPNAKT 56
AAD26204 ----MGSESESVCVTGASGFIGSWLVMRLLEHGYTVRATVRDPTNQKKVKHLLDLPKAET 56
AAO39818 ----MGSESESVCVTGASGFIGSWLVMRLLEHGYTVRATVRDPTNQKKVKHLLDLPKAET 56
CAA72420 ----MGSQSETVCVTGASGFIGSWLVMRLLERGYTVRATVRDPTNVKKVKHLLDLPKAET 56
AAS00611 ----MGSIAETVCVTGASGFIGSWLIMRLLERGYAVRATVRDPDNKKKVKHLLELPKAST 56
CAC88859 MKDVNGSPATTVCVTGAAGFIGSWLVMRLLERGYVVRATVRDPANIKKVKHLLELPKADS 60
BAF49325 ------MTVETVCVTGAAGFIGSWLVMRLLERGYLVRATVRNPDNLKKLRHLLELPNAKS 54
:******:*******:*****:** ******:* * **::***:**:*.:
BjDFR QLTLWKADLSDEGSYDDAINGCDGVFHIATPMDFESKDPENEVIKPTVNGVLGIMKACDK 116
AAX53571 QLTLWKADLSDEGSYDDAINGCDGVFHIATPMDFESKDPENEVIKPTVNGVLGITKACDK 116
AAO73442 QLTLWKADLSDEGSYDDAINGCDGVFHIATPMDFESKDPENEVIKPTVNGVLGITKACDK 116
BAA85261 QLTLWKADLSEEGSYDDAINGCDGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTVNGMLGIMKACVK 116
AAD26204 HLTLWKADLADEGSFDEAIQGCSGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTINGLLDILKACQK 116
AAO39818 HLTLWKADLADEGSFDEAIQGCSGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTINGLLDILKACQK 116
CAA72420 HLTLWKADLADEGSFDEAIKGCTGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTIEGMLGIMKSCAA 116
AAS00611 HLTLWKADLAEEGNFDEAIRGCTGVFHLATPMDFESKDPENEVIRPTINGMVSIMRACKN 116
CAC88859 NLTLWKADLNEEGSFDEAIEGCFGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTINGVLSIIKSCTK 120
BAF49325 KLTLWKADLTEDGSYDDAIKGCTGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTIEGMLGIMKSCVK 114
:******** ::*.:*:**.** ****:****************:**::*::.* ::*
BjDFR AKTVRRIVFTSSAGTVNVEEHQKNVYDENDWSDLDFIMSKKMTGWMYFMSKTLAEKAAWD 176
AAX53571 AKTVRRIVFTSSAGTVNVEEHQKNVYDENDWSDLDFIMSKKMTGWMYFMSKTLAEKAAWD 176
AAO73442 AKTVRRIVFTSSAGTVNVEEHQKNVYDENDWSDLDFIMSKKMTGWMYFMSKTLAEKAAWD 176
BAA85261 AKTVRRFVFTSSAGTVNVEEHQKNVYDENDWSDLEFIMSKKMTGWMYFVSKSLAEKAAWD 176
AAD26204 AKTVRKLVFTSSAGTVNVEEHQKPVYDESNWSDVEFCRSVKMTGWMYFVSKTLAEQAAWK 176
AAO39818 AKTVRKLVFTSSAGTVNVEEHQKPVYDESNWSDVEFCRSVKMTGWMYFVSKTLAEQAAWK 176
CAA72420 AKTVRRLVFTSSAGTVNIQEHQLPVYDESCWSDMEFCRAKKMTAWMYFVSKTLAEQAAWK 176
AAS00611 AKTVRRLVFTSSAGTLDVEEHRKPVYDETSWSDLDFVRSVKMTGWMYFVSKTLAEQAAWK 176
CAC88859 AKTVKRLVFTSSAGTVNVQEHQQPVYDENNWSDLDFINEKKMTGWMYFVSKTLAEKAAWD 180
BAF49325 AKSVRRLVFTSSAGSVNVEERQQAEYDENSWTDVEFCRTRKMTGWMYFVSKTLAEKAAWE 174
**:*:::*******:::::*:: ***. *:*::* ***.****:**:***:***.
BjDFR YAKEKGIDFISIIPTLVIGPFITTSMPPSLITALSPITRNEAHYSIIRQGQYVHLDDLCN 236
AAX53571 YAKEKGIDFISIIPTLVIGPFITTSMPPSLITALSPITRNEAHYSIIRQGQYVHLDDLCN 236
AAO73442 YAKEKGIDFISIIPTLVIGPFITTSMPPSLITALSPITRNEAHYSIIRQGQYVHLDDLCH 236
BAA85261 FAEEKGLDFISIIPTLVVGPFITTSMPPSLITALSPITRNEAHYSIIRQGQYVHLDDLCN 236
AAD26204 YAKENNIDFITIIPTLVIGPFLMPSMPPSLITGLSPILRNESHYGIIKQGQYVHLDDLCL 236
AAO39818 YAKENNIDFITIIPTLVIGPFLMPSMPPSLITGLSPILRNESHYGIIKQGQYVHLDDLCL 236
CAA72420 YAKENNIDFITIIPTLVVGPFIMSSMPPSLITALSPITGNEAHYSIIRQGQFVHLDDLCN 236
第 1期 严明理等: 芥菜型油菜 4-二氢黄酮醇还原酶基因的克隆和表达分析 5


AAS00611 FAEENNIDFISIIPSLVVGPFLTSSMPPSLITALSPITRNEAHYPIIKQGQFVHLDDLCS 236
CAC88859 AAKENNIDFISIIPVLVVGPFIMPTFPPSLVTALSPITGNEPHYSIIKQGQFVHLDDLCE 240
BAF49325 FAQQNNIDFISIIPTLVVGPFLMPSMPPSLITALSPITGNQSHYSILKQIQLVHLDDLCN 234
*:::.:***:*** **:***: .::****:*.**** *:.** *::* * *******
BjDFR AHIFLYEQAAAKGRYVCSSHDATILTISEFLRQKYPEYNVPSTFEGVDENLKSIMFSSKK 296
AAX53571 AHIFLYEQAAAKGRYVCSSHDATILTISEFLRQKYPEYNVPSTFEGVDENLKSIMFSSKK 296
AAO73442 AHIFLYEQAAAKGRYICSSHDATILTISEFLRQKYPEYNVPSTFEGVDENLKSIMFSSKK 296
BAA85261 AHIFLYEQAAAKGRYICSSHDATILTISKFLRPKYPEYNVPSTFEGVDENLKSIEFSSKK 296
AAD26204 SHIYLYEHPKAEGRYICSSHDATIHELVKMLREKYPEYNIPTKFKGIDDNLEPVHFSSKK 296
AAO39818 SHIYLYKHPKAEGRYICSSHDATIHELVKMLREKYPEYNIPTKFKGIDDNLEPVHFSSKK 296
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AAS00611 AHIFLFEHPNAKGRYICSSHPATILELAKFLREKYPEFNVPTEFEDVDENMKNMLFSSKK 296
CAC88859 SHIFLFEHPEAEGRYICSSHDATIYDLAKMMREKWPEYNVPTEFKGIDKDIPKVSFSSEK 300
BAF49325 AHIYLFEHPESNGRYICSSHDATITDVANLLRHKFPEYNVPTKFMGVDENLKAVVFSSKR 294
:**:*:::. ::***:**** . * : :::* *:**:*:*: * .:*.:: : ***::
BjDFR LIDMGFNFKYSLEDMLVESIETCRQKGFLPVTLPEHLKSEDKVPGSDDNKEIKNGSAGLT 356
AAX53571 LIDMGFNFKYSLEDMLVESIETCRQKGFLPVTLPEHLKSEDKVPGSDDNKEIKNGSAGLT 356
AAO73442 LIDMGFNFKYSLENMLVESIETCRPKGFLPVTLPEHLKSEDRVPGSDDNKEIKNGSAGLT 356
BAA85261 LTEMGFNFKYSLEEMFIESIETCRQKGFLPVSLSYQSISEIKVPTKNEIIEVKTG-DGLT 355
AAD26204 LREIGFEFKYSLEDMFVGAVDACRAKGLIPIPIPAEKTEA-------------AEESNLV 343
AAO39818 LREIGFEFKYSLEDMFVGAVDACRAKGLIPIP--AEKTEA-------------AEESNLV 341
CAA72420 LTDLGFEFKYSLEDMFTGAVDTCRAKGLLPPS-----------------------HEKPV 333
AAS00611 LTDLGFKFKYSLDDMFTGAVDTCRAKGLLPLLC----------------------ENHVS 334
CAC88859 LIGMGFKFKYSLEDMFRGAIDTCREKGLLPYSN--------------------ATTANGT 340
BAF49325 LKDLGFNYKYTMEDMFVGAVTTCRRNGILPFTN---------------------KPKSAT 333
* :**::**::::*: :: :** :*::*
BjDFR DGMVACKKTEPGMAGEKADSHMSAQQICA 385
AAX53571 DGMVACKKTEPGMAGEKADSHMSAQQICA 385
AAO73442 DGMVACKKTEPGMVGEKADSHMSAQQICA 385
BAA85261 DGMKPCNKTETGVTGERTDAPMLAQQMCA 384
AAD26204 DVKVG------------------------ 348
AAO39818 DVKVGG----------------------- 347
CAA72420 DGKT------------------------- 337
AAS00611 EVSI------------------------- 338
CAC88859 NGTI------------------------- 344
BAF49325 KWSN------------------------- 337

图2 芥菜型油菜DFR基因编码氨基酸的多序列比较
Fig. 2 Multiple sequence alignment of Brassica juncea DFR putative amino acid sequence
蛋白质登录号和物种为AAX53571(白菜型油菜), AAO73442 (甘蓝), BAA85261(拟南芥), BAF49325(飞燕草×颠茄), CAC88859 (杜鹃花),
BAA84939(山茶), CAA72420(葡萄), AAD26204(苹果), AAO39818(梨子), BAA12723(玫瑰), AAC25960(草莓), AAS00611 (柑橘),
BM64800 (锦葵), AAN63056(白杨)。
The protein accession number and the corresponding species are: AAX53571(Brassica.rapa), AAO73442(Brassica oleracea),
BAA85261(Arabidopsis thaliana), BAF49325 (Delphinium × belladonna), CAC88859 (Rhododendron simsii), BAA84939(Camellia sinen-
sis), CAA72420(Vitis vinifera), AAD26204(Malus × domestica), AAO39818 (Pyrus communis), BAA12723 (Rosa hybrid cultivar),
AAC25960 (Fragaria × ananassa), AAS00611 (Citrus sinensis), BM64800 (Gossypium hirsutum), AAN63056 (Populus tremuloides).


图3 芥菜型油菜与其他植物同源的4-二氢黄酮醇还原酶氨基酸
序列通过Clustal W软件构建系统树
Fig. 3 Phylogenetic tree generated by Clustal W analysis of
DFR amino acid sequences from Brassica juncea and other
higher plants

2.4 DFR基因在叶片、种子和种皮中的表达
以四川黄籽、紫叶芥、NILA、NILB 的叶片和
授粉 15 d后的种子 cDNA为模板, 用 DFR-D引物和
ACTIN基因引物进行扩增的结果(图 4)表明, DFR基
因在所有供试材料的叶片和种子中均有表达, 不同
材料间的表达没有差异。但以授粉后 15 d和 25 d种
皮的 cDNA 为模板, 用相同引物进行扩增, 结果表
明(图 5), 在四川黄籽的种皮中未检测到 DFR 基因
的表达, 而在紫叶芥和黑籽近等基因系的种皮中都
检测到 DFR基因的表达。由此可以认为, DFR基因
表达受阻导致四川黄籽种皮不能合成原花色素, 种
皮透明, 种子表现出胚的颜色。

6 作 物 学 报 第 34卷


图4 DFR基因在芥菜型油菜叶片和种子中的转录
Fig. 4 Transcription levels of DFR in leaves and seeds of B. juncea
HL, AL, BL, ZL分别代表四川黄籽、NILA、NILB和紫叶芥叶片;
HS, AS, BS, ZS分别代表四川黄籽、NILA、NILB和紫叶芥种子。
HL, AL, BL, and ZL stand for the leaves of Sichuan Yellow, NILA,
NILB, and Purple-leaf Mustard, respectively; HS, AS, BS, and ZS
stand for the seeds of Sichuan Yellow, NILA, NILB, and Pur-
ple-leaf Mustard, respectively.

图5 DFR基因在芥菜型油菜的种皮中的转录
Fig. 5 Transcription levels of DFR in seed coats of B. juncea
H1, A1, B1, Z1分别代表四川黄籽、NILA、NILB和紫叶芥授粉
15 d种皮; H2, A2, B2, Z2分别代表四川黄籽、NILA、NILB和紫
叶芥授粉后 25 d的种皮。
H1, A1, B1, and Z1 stand for 15 DAP (Days After Pollination) seed
coats of Sichuan Yellow, NILA, NILB, and Purple-leaf Mustard
respectively; H2, A2, B2, and Z2 stand for 25 DAP seed coats of
Sichuan Yellow, NILA, NILB and Purple-leaf Mustard, respectively.

3 讨论
核酸序列和蛋白质序列的分析结果表明, 我们在
芥菜型油菜中已成功克隆了DFR基因的全长gDNA和
cDNA序列。序列分析也表明在芸薹属中 DFR基因
是比较保守的。
在四川黄籽种皮中DFR基因不表达致使后续的
花色素和原花色素不能合成 [5], 就不能产生黄烷
3,4-二醇类物质(图 6), 这与我们前文[9]报道的结果
完全相符。种皮因为不能合成花色素, 从而透明。
据报道, 在埃塞俄比亚芥[10]的叶片和种皮、洋
葱鳞茎[11-12]、番薯种子[13]和水稻胚乳[14]等中, DFR
基因是颜色形成的关键。它们的DFR基因表达受阻
或突变，都会表现出无色或白色等性状。
DFR基因在本研究所有供试材料的种子和叶片
中都表达, 说明在芥菜型油菜中DFR的表达不具有
组织特一性。四川黄籽和紫叶芥DFR基因的序列没
有差异 , 但在黄籽和黑籽种皮中的表达存在差异 ,
说明其在种皮中的表达受到其他基因的调控。什么
基因调控芥菜型油菜种皮中DFR基因的表达有待研
究。在拟南芥中DFR(TT3)基因受TT2(编码MYB类转
录因子)[15]、TT8 (编码bHLH转录因子) [16]和TTG1(编
码WD40 蛋白质 )基因调控 [5,15-17]。番薯种子中的
bHLH基因[13]和水稻的Rc(编码bHLH类转录因子)基
因[14]也调控DFR基因的表达。因此, 是否是bHLH等
基因的同源基因调控芥菜型油菜种皮DFR基因的表
达值得进一步研究。我们已经克隆了芥菜型油菜
TT2、TT8和TTG2的同源基因片段[18],正在克隆这些
基因的全长序列和进行表达分析。

图6 拟南芥中DFR催化的反应和在类黄酮生物合成途径中的位置
Fig. 6 The reaction catalyzed by DFR and its site on flavonoid biosynthetic pathway in Arabidopsis thaliana

4 结论
首次在芥菜型油菜中克隆了 4-二氢黄酮还原酶
基因。该基因编码 385氨基酸, 分子量为 42 886.0 Da,
推测的等电点为 5.54。该基因在芥菜型油菜胚中表
达, 在四川黄籽种皮中不表达, 在以其为轮回亲本
培育的黑籽近等基因系种皮中表达, 认为该基因可
能是导致芥菜型油菜黄黑种皮颜色差异的原因之
一。油菜种皮中 DFR基因的不表达, 会导致种皮的
类黄酮合成途径中花青素和原花色素不能合成, 致
使种皮透明, 种子呈黄色。

致谢: 本研究在湖南农业大学作物基因工程湖南省
重点实验室完成 , 得到陈信波教授的指导和帮助 ,
在此表示衷心感谢。
第 1期 严明理等: 芥菜型油菜 4-二氢黄酮醇还原酶基因的克隆和表达分析 7

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