全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 723−728 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30800699)和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2060302-17)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张宗文, E-mail: zongwenz@163.com, Tel: 010-82105685
第一作者联系方式: E-mail: wubin@caas.net.cn
Received(收稿日期): 2010-09-10; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00723
燕麦葡聚糖合酶基因 AsCSLH的克隆及特征分析
吴 斌 张宗文*
中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: β-葡聚糖是燕麦发挥保健作用的重要功能因子, 分离其合成关键基因有助于解析燕麦 β-葡聚糖积累的分子
机制。以高 β-葡聚糖燕麦地方品种夏莜麦为材料, 通过 RACE 和染色体步移的方法克隆了燕麦 β-葡聚糖合酶基因
AsCSLH及其基因组序列并分析其序列结构特征, 采用半定量 RT-PCR方法研究该基因组织表达特性。分离出的燕麦
CSLH基因包含 6个内含子, 内含子剪接方式均符合 GT/AG剪接规则, 编码区全长 2 277 bp, 在序列上与水稻 CSLH
基因的编码区序列相似性最高, 所预测的编码蛋白含有相关多糖合成酶保守结构域。AsCSLH基因在燕麦各组织中均
有表达, 在灌浆期籽粒中表达水平最高。推测 AsCSLH基因在燕麦籽粒的 β-葡聚糖合成中起重要作用。
关键词: 燕麦; β-葡聚糖合酶; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Analysis of β-Glucan Synthase Gene AsCSLH in Avena sativa L.
WU Bin and ZHANG Zong-Wen*
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Beta-glucan [(1→3,1→4)-β-D-glucan] is one of the important components in oat (Avena sativa L.) that has the function of
health protection for human beings. Cloning the β-glucan synthase gene is of significance to reveal the molecular mechanism of
β-glucan accumulation and guide oat breeding for β-glucan enhancement. A β-glucan synthase gene, designated AsCSLH, and its
genomic DNA sequence were cloned from the oat landrace Xiayoumai using rapid amplification of cDNA ends (RACE) and Ge-
nomeWalk from the cDNA, respectively. The AsCSLH gene contains a 2 277 bp open reading frame and encodes a peptide of 758
amino acid residues. Six introns were found in AsCSLH gene with typical GT/AG characteristic after comparison of its sequences of
genomic DNA and cDNA. Sequences analysis showed that AsCSLH gene shared the highest identity with rice CSLH gene
(BK000084). Structure analysis of predicted encoded protein also confirmed that this cDNA sequence was the oat β-glucan synthase
gene. The tissue-specific expression analysis by semiquantitative RT-PCR assays suggested that AsCSLH was expressed in different
tissues of oat with the highest level in immature seeds. These results suggested that AsCSLH plays an important role in oat β-glucan
synthesis.
Keywords: Oat (Avena sativa L.); β-glucan synthase; Gene cloning; Expression analysis
燕麦是禾本科燕麦属(Avena L.)一年生草本植物, 是
一种重要的粮饲兼用作物。燕麦营养丰富, 是谷物中最好
的全价营养食品之一, 与小麦、水稻、玉米等作物相比,
燕麦籽粒中的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质元
素等营养指标均位居前列[1]。燕麦制品被美国食品和药品
管理局于 1997 年正式确认为保健食品[2]。在燕麦的各组
分中, β-葡聚糖是其发挥保健作用的重要功能成分[3]。β-
葡聚糖是一种以混合的(1→3),(1→4)-β-糖苷键连接形成
的 D 型葡萄糖聚合物, 各器官中以籽粒的葡聚糖含量最
高 , 籽粒中的葡聚糖存在于胚乳和糊粉层细胞壁中 [4]。
Braaten 等[5]利用纯化的燕麦 β-葡聚糖对高胆固醇血症病
人进行临床试验, 表明燕麦 β-葡聚糖具有降低胆固醇的
作用。此外, 燕麦葡聚糖还具有减缓血液中葡萄糖含量,
预防和治疗糖尿病 , 促进肠道益生菌增值 , 预防肠道疾
病, 增强免疫力等作用[6-7], 由于 β-葡聚糖在燕麦发挥保
健功能中起着上述重要作用, 因此很早便是研究重点 [8],
但是迄今尚没有分离燕麦中葡聚糖合成相关酶及编码基
因的相关报道。为更好地研究燕麦 β-葡聚糖合成的分子
机制 , 本研究以高 β-葡聚糖含量燕麦种质资源为材料 ,
根据其他物种新近发现编码 β-葡聚糖合酶的 CSLH 基因
为信息模板 , 通过同源克隆的方法 , 分离了编码燕麦葡
聚糖合酶基因 cDNA 全长与相应的基因组序列, 并对基
724 作 物 学 报 第 37卷

因结构特征与表达模式进行了分析, 以期为进一步解析
燕麦 β-葡聚糖积累的分子机制及高 β-葡聚糖分子育种研
究提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
高 β-葡聚糖燕麦地方品种夏莜麦(Avena sativa L. cv.
Xiayoumai), 由中国农业科学院作物科学研究所郑殿升
研究员提供, 成株期的燕麦根、茎、叶片以及灌浆期籽粒
经液氮速冻后于−80℃保存, 用于总 RNA提取。
1.2 总 RNA的提取和 cDNA的合成
取液氮中保存的样品约 100 mg, 利用 Trizol 试剂
(Invitrogen)抽提总 RNA, 并用 DNase I (Qiagen)去除残留
的 DNA。参照 PrimeScript (TaKaRa)逆转录酶的说明书以
纯化的 RNA 为模板逆转录合成 cDNA, 制备好的 cDNA
保存于−20℃。
1.3 燕麦 AsCSLH基因的克隆与基因组区段分离
根据 GenBank 中收录的水稻和大麦 CSLH 基因
(GenBank登录号为 BK000084和 FJ459581)及其保守区序
列, 利用 Primer Premier 5.0 软件设计简并引物(P1: 5′-G
TGCGAGGCGTGGTTCG/ACCTTC-3′; P2: 5′-AGGTGAT
G/ACGTTGCATCCTGTG-3′)扩增合成的 cDNA, 引物由
上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 扩增产
物经电泳回收纯化后连接至 pGEMT-easy 载体(Promega)
并转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞。转化子经过蓝白斑
筛选及酶切验证鉴定, 阳性克隆送中国农业科学院重大
工程楼测序部测序, 并在 NCBI数据库中比对分析测序结
果。
以获得的 cDNA 片段为模板, 设计燕麦 CSLH 基因
RACE 用特异引物(P5R: 5′-CATCACGCCCGACACCCTT
GTCAGAAC-3′; P3R: 5′-CTGTTGGACACCACCCTACC
AGCGTTC-3′)。按照试剂盒说明书进行 5′和 3′RACE试验,
分别以 P5R、P3R和试剂盒提供的 UPM(通用引物混合物)
为引物进行 PCR 扩增, 经产物回收连接转化并测序, 得
到燕麦 CSLH基因片段 5′端序列和 3′端序列。通过 Vector
NTI软件 Contig Express将 5′端序列和 3′端序列以及中间
cDNA片段序列拼接, 获得燕麦 CSLH基因全长 cDNA序
列信息 , 以此为基础设计引物 (CF: 5′-GTGCGCTAGTT
TGTGACCTCTA-3′; CR: 5′-GCATTCGGTCACGCTTCCA
CTA-3′), 扩增出 CSLH基因 cDNA全长。
以燕麦基因组DNA为模板, P1、P2为引物扩增CSLH
的基因组片段, 扩增产物的回收纯化、转化、鉴定、测序
过程方法同上。根据测序结果设计引物通过染色体步移的
方法分两步扩增 AsCSLH 基因侧翼序列, 具体方法按照
GenomeWalker Universal Kit (Clontech)试剂盒说明书进行,
使用不同平末端内切酶对基因组 DNA 酶切后, 与试剂盒
中的接头连接。使用试剂盒提供的引物 AP1: 5′-GTA
ATACGACTCACTATAGGGC-3′ 和特异引物(PWU1: 5′-C
GTTACTCATCACGCCCGACACCCTTG-3′; PWD1: 5′-GT
CAGGAGGTACTTAGTTGCCGTCGTT-3′)进行 PCR扩增,
先行 7个循环 94 25 s, 72 3 min℃ ℃ ; 再行 32个循环, 94 ℃
25 s, 67 3 min℃ ; 最后于 67 7 min℃ 。取该 PCR产物稀释
50倍为模板, 以引物 AP2: 5′-CACCGGCCTTGAAGTTAT
GGTAGTGTT-3′和特异引物 (PWU2: 5′-CGTTACTCATC
ACGCCCGACACCCTTG-3′; PWD2: 5′-TCTGCCTACTC
ACAAACCAGTCCTTCT-3′)进行巢式扩增 , 反应程序同
上。扩增产物的转化、鉴定、测序方法同上。设计引物(GF:
5′-GCATTCGGTCACGCTTCCACTA-3′; GR: 5′-GAGAC
AGCCGTGCGCTAAGAGT-3′), 扩增出 CSLH基因与其启
动子在燕麦基因组中的相应序列。
1.4 燕麦 AsCSLH基因序列的生物信息学分析
用 NCBI (http://ncbi.nlm.ncih.gov/)中的 BLAST、
ORF、Spidey及 ExPASY中的 Compute pI/Mw tool等软件
进行生物信息学分析。通过 NCBI BLAST 2 sequences完
成 mRNA序列与基因组 DNA比对, 分析剪接位点供位、
受位与识别序列等信息; 搜索NCBI的 CDD库(Conserved
Domain Databases), 进行保守结构域的分析; 采用 GSDS
(gene structure display server)进行基因结构作图(http://gsds.
cbi.pku.edu.cn/index.php)。利用 TMHMM和 SignalP分别
预测跨膜区和信号肽; 蛋白质的疏水性由 ProtScale tool
预测。
1.5 燕麦 AsCSLH基因组织表达分析
依据 AsCSLH基因的 cDNA序列, 设计 1对能够特异
扩增 AsCSLH 基因片段的引物以检测基因表达 (QF:
5′-AAGGGTGTCGGGCGTGATGAGT-3′; QR: 5′-AAACA
GCCAGTCCCGCCATAGA-3′), 扩增的片段位于 AsCSLH
基因的第 846到 1 118个碱基之间, 长度为 272 bp。以持
家基因 Actin作为内参基因校正不同组织 cDNA模板丰度,
所设计的特异引物为 AP1: 5′-GACAGAGCGTGGTTAC
TCATTC-3′; AP2: 5′-TCATCCTATCAGCGATTCCAGT-3′。
利用上述引物, 以燕麦根、茎、叶和灌浆期籽粒的 cDNA
为模板进行 PCR 扩增, 以检测各部分 AsCSLH 基因的表
达水平, 每个样品 3 次重复。反应条件为 94℃预变性 3
min; 94 30℃ s, 55 30℃ s, 72 1℃ min, 25个循环; 72℃延
伸 5 min。以琼脂糖凝胶电泳检测 PCR反应产物。
2 结果与分析
2.1 燕麦 AsCSLH基因的克隆与基因组区段分离结果
利用简并引物 P1、P2 对燕麦 cDNA 和基因组 DNA
分别进行扩增, 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离, 获得 2
条明亮的目标条带。测序结果表明, 这 2个片段长度分别
为 1 673 bp和 2 350 bp。在 GenBank中进行序列比对, 发
现这 2 个扩增片段与大麦和水稻的 CSLH 基因同源性最
高。5′RACE 扩增获得了一个长度为 958 bp 的片段, 3′
RACE所获得的片段长度为 996 bp。在染色体步移过程中,
通过巢式 PCR (Nested PCR)经过两次 PCR扩增获得基因
组片段的上下游侧翼序列。测序结果表明, 所获得的上游
序列长 2 872 bp, 下游序列长 1 320 bp。对利用 RACE和
第 4期 吴 斌等: 燕麦葡聚糖合酶基因 AsCSLH的克隆及特征分析 725


Genome Walk方法从燕麦中克隆到的CSLH基因与基因组
序列分别进行电子拼接, 根据拼接获得的全长序列设计
具有完整编码区的 CSLH基因的特异引物, 分别以灌浆期
燕麦籽粒 cDNA与燕麦基因组 DNA为模板进行扩增, 结
果显示, 利用引物 CF/CR 扩增得到的 CSLH 基因 cDNA
片段长度为 2 476 bp, 与电子拼接所得到的结果相同 ,
cDNA内部含有完整的开放阅读框架, 5′非翻译区长 94 bp,
起始密码子 ATG位于序列的 95 bp处, 3′非翻译区长 163
bp, 存在 Poly(A)加尾信号 AATAAA (图 1)。将克隆到的
cDNA序列与已公开的其他物种基因序列比较, 发现该基
因与大麦和水稻的 CSLH 基因同源性最高, 其中与大麦
CSLH 基因序列 (FJ459581)的一致性为 85%, 与水稻
CSLH基因序列(BK000084)的一致性为 86%。在 NCBI数
据库中 BLAST 比对分析结果表明, 该基因是燕麦中克隆
到的 CSLH 全长 cDNA, 被命名为 AsCSLH。从基因组中
克隆到的片段长度为 5 312 bp, BLAST比对分析结果表明,
此 DNA 片段包含 CSLH 基因完整的编码序列, 将其提交
到 GenBank, 获得序列编号 HQ128579。
2.2 AsCSLH基因结构与调控区序列分析
AsCSLH 基因的编码区自起始密码子(ATG)至终止密
码子(TAA)长 2 277 bp, 由 7个外显子组成, 分别标为 Ex1
至 Ex7 (图 2)。Splign分析结果表明, AsCSLH基因的 6个
内含子 5′端为 GU 而 3′端为 AG, 其剪接接口符合内含子
常见的剪切特征。
对起始密码子周边序列的分析表明其符合 Kozak 规
则。起始密码子后第 1个碱基为 G, 起始密码子上游约 15
bp范围的侧翼序列内富含 GC碱基, 其中 C含量为 40%、
G的含量为 33%。这表明预测的起始密码子为翻译起始位
点。对上游启动子区段的分析表明, 除含有 TATA box,
CAAT box等真核生物启动子特征序列外, 还包含其他一
些特异表达所必需的调控元件, 包括 E-BOX, 核心序列
CANNTG, 位于−218 和−444 处, 该元件能调控储藏蛋白
的高效表达[9]; ARF 元件, 核心序列 TGTCTC, 位于−352
处 , 该元件所调控的基因表达受生长素调节 [10]; 另外还
有 ABRE, 核心序列 ACGTG(−489和−607处), MYB元件,
核心序列 CNGTTR (−415、−478 和−767 处)以及 WRKY
元件, 核心序列 TGAC (−625、−644 和−922 处), 这些元
件所调控的基因多受逆境影响[11-13]。综合燕麦 CSLH基因
启动子区段存在的这些调控元件来看, 燕麦中 CSLH基因
的表达可能受生长素调节, 能在贮藏组织表达并且受环
境条件的影响。
2.3 AsCSLH基因编码蛋白的氨基酸序列分析
利用 NCBI提供的在线工具 ORF Finder分析所获得
的AsCSLH基因序列, 其开放阅读框为 2 277 bp, 编码 758
个氨基酸, 所编码蛋白的分子量为 83.15 kD, 等电点(pI)
为 6.8。SignalP信号肽分析工具对蛋白的分析表明, 该蛋
白为分泌型蛋白, 存在信号肽, 概率为 0.997, 最可能的
分隔位点位于第 57和第 58位氨基酸之间, 概率为 0.352。
利用 ProtComp 和 PSORT 对蛋白的亚细胞定位分析表明,
该蛋白定位于高尔基体和内质网上时分值最高, 分别为

图 1 燕麦 CSLH基因的 cDNA序列与编码氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequence of AsCSLH gene and its deduced amino acid sequence
粗斜体碱基表示相应引物; 带下画线的碱基表示加尾信号; 带下画线氨基酸表示跨膜的氨基酸螺旋位置。
Corresponding primers are shown in italic and bold. Polyadenylation signal is underlined and the underlined amino acid denote the position of trans-
membrane helices.
726 作 物 学 报 第 37卷

5.6 和 4.0, 表明该蛋白有可能存在于高尔基体或内质网
上。用 TMHMM 对氨基酸序列的跨膜结构域进行分析表
明, AsCSLH 蛋白共有 6个跨膜区, 其中 2个在氨基末端
(12~34和 49~71处), 另外 4个在羧基末端(618~640、673~
695、707~729 和 734~756 处, 图 1)。两末端跨膜结构域
之间约有 550个氨基酸长度的间隔。
结构域分析表明, AsCSLH蛋白包含 β-糖苷转移酶的
保守氨基酸序列, 比较典型的如 D_D_D_QxxRW (D: 天
冬氨酸 , Q: 谷氨酰胺 , R: 精氨酸 , W: 色氨酸)保守区 ,
D_D 区含有几个保守的天冬氨酸残基, 可结合多糖合成
的底物; 而 QxxRW 区则与多糖合成酶的催化活性有关,
两区之间约间隔 120 个到 250 个氨基酸残基 [14], 燕麦
CSLH 蛋白中为 QFKRW, 两区间隔为 206 个氨基酸残基
(图 3)。根据碳水化合物活性酶数据库(CAZy)对 CSLH蛋
白的分类, CSLH蛋白属于糖基转移酶家族 2(GT2)里的成
员 , 这类蛋白能以尿苷二磷酸-葡萄糖(UDP-glucose) 为
底物催化合成 β 糖苷链[15]。这表明所克隆的 AsCSLH 基
因编码蛋白具有催化多糖合成功能。
2.4 AsCSLH的同源性比较
与已公开发表的其他作物 CSLH 蛋白氨基酸序列比
较, 结果表明, 不同物种间的 CSLH 蛋白大小不同, 其中
燕麦的最大, 包含 758 个氨基酸残基, 水稻的最小, 有
750个残基, 大麦则有 751个残基。ClustalW比对结果显
示, 尽管长度不同, 这 3个物种的 CSLH蛋白有着较高的
相似性(图 3), 并且三者都含有 3 个区域与糖基转移酶保
守区 A型相似, 在 β-糖苷转移酶的保守区, D_D区三者序
列相同, 都为 DCD; 在 QxxRW 区, 燕麦和大麦的序列为
QFKRW 而水稻为 QLKRW, 这些区域是催化活性位点,
表明 CSLH 基因尽管有着不同的进化过程但功能区域仍
相当保守。

图 2 燕麦 CSLH基因座结构(含起始于−94 bp处的 TSS)
Fig. 2 Structure of oat CSLH locus with Transcription Start Site (TSS) beginning at –94 bp

图 3 燕麦 CSLH基因与已公开的其他植物编码的氨基酸序列比对
Fig. 3 Comparison of amino acid sequences of AsCSLH and other published CSLH proteins
带下画线的氨基酸残基表示糖基转移酶保守结构域; 方框部分表示 D_D_D_QxxRW功能域。
Lines denote regions similar to glycosyltransferase conserved domain. Boxed amino acids represent the D_D_D_QxxRW motif.

2.5 燕麦 AsCSLH基因组织表达分析
RT-PCR 分析结果表明, AsCSLH 基因在正常生长的
燕麦的根、茎、叶和灌浆期籽粒均有表达, 其中灌浆期籽
粒中的表达量最高 , 其次在叶中 , 在茎和根中表达量最
低(图 4)。
3 讨论
CSLH基因是类纤维素合酶 CSL (cellulose synthase-
like)基因家族的成员之一。CSL基因家族是一个广泛存在
于植物中的超级基因家族, 与纤维素合酶 CesA 基因家族
第 4期 吴 斌等: 燕麦葡聚糖合酶基因 AsCSLH的克隆及特征分析 727



图 4 CSLH在燕麦不同组织中的表达模式
Fig. 4 Transcription profile of CSLH in different tissues of oat

有着较高的相似性 , 但从二者间的序列分析来看 , 不同
物种间的 CesA基因相似性远大于与同一物种中 CSL基因
相似性, 表明 CSL基因家族不同于 CesA基因家族[16-17]。
CSL 基因家族成员大多数从 cDNA 文库测序与分析模式
植物的基因组序列过程中发现, 目前已发现并命名的成
员除 CSLH 基因外, 还包括 CSLA~G 以及 CSLJ。但并非
这些基因在所有的植物中都存在 , 从现有的研究来看 ,
CSLB 和 CSLG 仅存在于双子叶植物和裸子植物中, 而
CSLF和 CSLH仅存在于单子叶植物中[18]。而 CSL基因编
码的氨基酸序列聚类分析表明, CSL基因家族中, CSLH基
因和CSLB基因相似性最高, 起初认为CSLH基因是CSLB
基因家族的一个成员, 后来 Hazen 等[14]通过比较发现与
CSLB基因不同, CSLH基因仅存在于单子叶植物中, 认为
这两个基因可能起源于同一个基因, 在单子叶和双子叶
植物分化之前就已经分化。
对燕麦 CSLH 蛋白跨膜结构域进行分析显示该蛋白
氨基末端和羧基末端跨膜结构域之间有较长的间隔且具
有典型的亲水性 , 可形成环状结构延伸至细胞质。而
Carpita 对(1→3),(1→4)-β-D-葡聚糖的合成研究表明 β-葡
聚糖合酶的催化功能域暴露于高尔基体的细胞质面, 底
物 UDP-葡萄糖从高尔基体的细胞质面进入, 合成的 β-葡
聚糖穿过高尔基体进入内腔后随囊泡分泌组装入微纤
丝[20]。从 TMHMM软件对 AsCSLH蛋白跨膜结构域的分
析结果来看, AsCSLH蛋白跨膜结构符合 β-葡聚糖合酶的
结构特征。结合对 AsCSLH蛋白转运肽的分析, 推测燕麦
CSLH 蛋白在细胞质基质中合成后, 经过蛋白转运, 锚定
于细胞高尔基体或内质网膜上行使催化功能。
CSLH 基因最初由 Hazen 等[14]通过对水稻基因组序
列的分析发现, 但功能一直未确定。Doblin等[19]将克隆到
的大麦 CSLH基因转入拟南芥中, 观察到在原本不能合成
葡聚糖的拟南芥中有葡聚糖生成, 随后的生化分析更进
一步证明所生成的多糖为葡聚糖, 从而验证了 CSLH基因
对葡聚糖合成的调控作用。而 Read等[21]运用 DH作图群
体对大麦葡聚糖含量QTL定位研究也表明, 在包含CSLH
基因座的大麦第 2H条染色体短臂上有一个控制葡聚糖含
量的主效 QTL。这一结果也印证了 CSLH 基因对大麦葡
聚糖的合成起调控作用。
Hamann等[22]利用芯片技术对拟南芥中基因的表达
进行研究, 结果表明 CSL基因的表达普遍低于 CesA基因,
受昼夜节律、乙烯以及渗透调节, 并且家族中各成员的表
达具有组织特异性。本研究发现燕麦 CSLH基因在各组织
器官中均有表达, 但在灌浆籽粒和叶中的表达量高于根
和茎, 这和已报道的大麦 CSLH基因表达模式相似[19], 而
Fincher[16]对大麦各组织多糖的含量分析表明籽粒和叶片
中葡聚糖含量远高于其他组织 ; 综合这些研究结果 ,
CSLH 基因的表达水平对不同组织器官中葡聚糖含量有
重要影响, 并且很可能对籽粒中的 β-葡聚糖合成起着重
要调节作用。
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