全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(8): 1403−1408 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973计划)前期研究专项(2007CB116209)
作者简介: 张海娜(1978–), 女, 在读博士。研究方向为作物生理与分子生物学。
*
通讯作者(Corresponding author): 肖凯。E-mail: xiaokai@hebau.edu.cn; Tel: 0312-7528115
Received(收稿日期): 2008-01-04; Accepted(接受日期): 2008-03-28.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01403
过量表达小麦超氧化物歧化酶(SOD)基因对烟草耐盐能力的影响
张海娜1 李小娟2 李存东1 肖 凯1,*
(1河北农业大学农学院; 2河北农业大学生命科学学院, 河北保定 071001)
摘 要: 利用前期克隆的小麦超氧化物歧化酶(SOD)基因 TaSOD1.1 和 TaSOD1.2, 构建融合上述基因编码阅读框
(ORF)的双元表达载体。采用农杆菌介导的遗传转化技术, 获得了过量表达 TaSOD1.1 和 TaSOD1.2 的转基因烟草植
株。研究表明, NaCl 处理下, 与对照相比, 转基因植株伤害较小, 叶片失绿面积较少, 植株长势明显增强, 叶片的
SOD活性均明显提高, 而 MDA含量明显降低。转基因植株的叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素含量, 以及可溶性糖
和可溶性蛋白含量也表现与 SOD活性相同的趋势。表明在烟草中高表达小麦 TaSOD1.1和 TaSOD1.2基因, 通过外源
基因在转录水平上的调节, 能增加植株 SOD 活性, 减轻盐分胁迫造成的细胞膜质过氧化, 增强植株抵御盐分胁迫的
能力。
关键词: 超氧化物歧化酶(SOD)基因; 遗传转化; 烟草; 耐盐能力
Effects of Overexpression of Wheat Superoxide Dismutase (SOD) Genes
on Salt Tolerant Capability in Tobacco
ZHANG Hai-Na1, LI Xiao-Juan 2, LI Cun-Dong 1, and XIAO Kai 1,*
(1 College of Agronomy; 2 College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei, China)
Abstract: For identification of the function of wheat novel superoxide dismutase (SOD) genes TaSOD1.1 and TaSOD1.2 in im-
proving the salt tolerance, the transgenic tobacco plants with high expression levels of TaSOD1.1 and TaSOD1.2 were generated
by the Agrobacterium tumerficians-mediated transformation approach. On NaCl treatment, the transgenic plants showed a better
growth performance with less injured and more greenish leaves than control. The SOD activity was largely elevated in the tested
transgenic tobacco plants than that in the control, so were the chlorophyll a, b contents, carotenoid content, soluble sugar content
and soluble protein content. In the meantime, the MDA content was dramatically declined. Therefore, the transgenic tobacco
plants with high expression levels of TaSOD1.1 and TaSOD1.2 could increase the SOD activity, alleviate the over-oxidation de-
gree of cytoplasm membrane caused by NaCl stress, and enhance the NaCl tolerant capacity by the up-regulation of exotic target
genes at the transcriptional level.
Keywords: Superoxide dismutase (SOD) gene; Genetic transformation; Tobacco; Salt tolerant capacity
作物在生长发育和产量形成过程中, 经常遭遇
盐分、高温、干旱、辐射、盐碱、病原菌侵染和养
分供应不平衡等逆境, 引发细胞内部产生大量的超
氧自由基, 导致活性氧的产生和清除平衡遭到破坏,
造成植株损伤或生理功能衰退[1]。超氧化物歧化酶
(superoxide dismutase, SOD)通过改善细胞活性氧的
清除能力 , 在植株遭受逆境时减少活性氧的累积 ,
对减轻逆境的伤害具有重要作用[2]。
按照与金属离子的结合形式, 植物体内的SOD
主要分为铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、锰超氧
化物歧化酶 (Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶 (Fe-
SOD) 3种类型[3]。其中, Cu/Zn-SOD在活性氧清除酶
系统中的作用尤为重要[1,3], 与作物的抗逆性和抗衰
老等密切相关[3-4]。迄今, 有关小麦、玉米和水稻等作
物中Cu/Zn-SOD基因的克隆已有较多报道[5-8]。SOD
基因的遗传转化研究表明, 在低温或氧化胁迫条件
1404 作 物 学 报 第 34卷

下, 超表达SOD基因的转基因苜蓿和转基因玉米植
株, 抗低温和抗氧化能力明显增强[9-10]。
我们在先前的研究中, 从盐分胁迫的小麦品种石
新 733 叶片中克隆了 2 个高表达水平的新型Cu/Zn-
SOD基因TaSOD1.1和TaSOD1.2。其中, TaSOD1.2的
表达受到NaCl胁迫的诱导[6]。表明上述基因在抵御
盐分胁迫等逆境中可能具有较重要的作用。基于此,
构建了融合上述基因编码阅读框(ORF)的双元表达
载体, 采用农杆菌介导的遗传转化技术, 建立了高
表达TaSOD1.1 和TaSOD1.2 的转基因烟草。该转基
因烟草植株, 抵御NaCl胁迫的能力明显增强。因此,
Cu/Zn-SOD基因TaSOD1.1 和TaSOD1.2 在今后采用
转基因技术创制抗盐作物品种可能具有一定的应用
价值。
1 材料和方法
1.1 供试小麦 Cu/Zn-SOD 基因 TaSOD1.1 和
TaSOD1.2
前期研究中, 在国际生物信息学网站(http://www.
tigr.org)的表达序列标签(ESTs)库内, 筛查到 2 个高
度同源、前人尚未进行特征和功能研究的小麦
Cu/Zn-SOD基因(TaSOD1.1 和TaSOD1.2), 并对上述
基因的编码蛋白特性、盐胁迫等逆境条件下的表达
特征进行了研究 , 发现TaSOD1.1 和TaSOD1.2 在
NaCl胁迫下均高度表达 [6]。现将 TaSOD1.1 和
TaSOD1.2用作本项研究的靶基因。
1.2 TaSOD1.1和 TaSOD1.2表达载体构建
根据已知TaSOD1.1 和TaSOD1.2 cDNA全长序
列 [6], 设计特异性正反向引物 , 以融合上述基因的
TA (pUCm-T, 上海生工生物工程有限公司)克隆质
粒为模板, 扩增靶基因的开放阅读框(ORF)。其中,
扩增TaSOD1.1 的正向引物为 5′-CCATGGCCGCGC
AGAGCCTCCT-3′(含有Nco I限制性内切酶切点 ),
反向引物为 5′-GGTAACCAGCGACCTACAACGGG-
3′(含有Bst E II限制性切点); 扩增TaSOD1.2的正向
引物为 5′-TTCCGCTTCCGAAGACAGCCATGG-3′
(含 有 Nco I限 制性 切 点 ), 反向 引物 为 5′-
AGGTAACCGAG 到 AATGGCGTCGTTACAAG-3 ′
(含有BstE II限制性切点)。参照韩胜芳等[11]的PCR扩
增反应体系和反应条件, TaSOD1.1和TaSOD1.2扩增
的产物大小分别为 618 bp和 694 bp。扩增上述基因
产物进行TA(pUCm-T)连接后 , 转化DH5α, 获得的
阳性克隆经测序(上海生工生物工程有限公司)验证
无误后, 进行Nco I和BstE II双酶切, 回收目的基因
编码框DNA, 与相同限制性内切酶消化双元表达载
体pCAMBIA- 3301 后获得的大片段连接, 构建融合
TaSOD1.1 和TaSOD1.2 目的基因的双元表达载体。示
意框架如图 1。
1.3 烟草遗传转化和转基因系建立
采用农杆菌介导的遗传转化法转化烟草 (cv.
Wisconsin 38)。首先, 用TaSOD1.1和TaSOD1.2双元
表达载体质粒转化感受态农杆菌EHA105, 获得阳
性克隆。挑取阳性克隆菌落在 28℃下于LB培养基中
振荡培养至OD600 = 0.6, 用于烟草叶圆片外植体的
遗传转化。除选用的外植体不同外, 农杆菌浸染、
植株再生和转基因系的建立均参照谷俊涛等[12]的方
法。以转化pCAMBIA3301质粒获得的转基因系作对
照(CK)。
1.4 转基因系 PCR鉴定
采用 CTAB法提取对照和转基因系叶片 DNA。
采用用于 TaSOD1.1 ORF 扩增的引物对该基因转化
系进行 PCR检测。由于在扩增 TaSOD1.2 ORF的正
向引物内, 引入的限制性内切酶切点位于 3′端, 酶切
后融合至双元表达载体后该正向引物不能用于转



图 1 融合 TaSOD1.1 (A)和 TaSOD1.2 (B)的双元表达载体示意图
Fig. 1 The diagram of binary expression vectors fused TaSOD1.1 (A) and TaSOD1.2 (B)
LB：T-DNA左边界; T35：CaMV35S基因 PolyA加尾序列; Bar(R)：除草剂抗性基因; P35S：CaMV35S启动子;
TNOS：终止子序列; RB：T-DNA右边界。
LB: T-DNA left border; T35: PolyA tailing sequence of CaMV35S; Bar(R): herbicide resistance gene; P35S: CaMV35S promoter;
TNOS: terminator sequence; RB: T-DNA right border.

第 8期 张海娜等: 过量表达小麦超氧化物歧化酶(SOD)基因对烟草耐盐能力的影响 1405


基因系的 PCR 扩增, 因此设计一条新的正向引物,
用于转基因系的 PCR 检测。引物序列为 5′-TCGC
CGACGCCACCAAGAAGG-3′。该正向引物和原反
向引物组合的新引物对扩增产物为 541 bp。对照和
转基因系的 PCR 反应体系和反应条件, 与表达载体
构建时扩增 TaSOD1.1和 TaSOD1.2的 ORF相同。
1.5 插入单拷贝靶基因转基因系筛选
将获得的 16 个TaSOD1.1 转基因系和 18 个
TaSOD1.2 转基因系在含有PPT(5 mg L−1)选择压下,
于光照培养箱内(25℃, 光周期 12 h)培养至生长出
健壮茎叶和发达根系 , 移栽至装有基质 (1/2 蛭石
+1/2 营养土)的塑料钵内, 在生长室中培养至成熟,
收获种子。将各转基因系种子室温贮存 30 d, 以
0.10% HgCl2消毒 10 min并用无菌水冲洗后, 播至含
有 5 mg L−1 PPT的LB固体培养基上, 根据各转基因
系T2 抗与不抗PPT植株的分离比例, 鉴定出插入单
拷贝TaSOD1.1或TaSOD1.2的转基因系各 3个。
1.6 转基因系目的基因表达水平检测
对对照和转基因系T2植株, 进行半定量RT-PCR
表达鉴定。总RNA采用Trizol试剂盒提取(Invitrogen),
参照试剂盒(TaKaRa)说明进行反转录(RT)。以反转
录产物为模板, 进行PCR。其反应体系和反应条件与
上述以DNA为模板的PCR相同。对照(CK)和转基因
系 的 R T - P C R 为 3 次 重 复 , 分 析 结
果在重复间均稳定一致。以其中表达水平高的 2 个
TaSOD1.1(TaSOD1.1-a 和 TaSOD1.1-b)及 2 个
TaSOD1.2转基因系(TaSOD1.2-a和 TaSOD1.2-b)做进
一步研究。
1.7 植株盐分胁迫处理和表型比较
用 0.10% HgCl2将对照和高表达TaSOD1.1 和
TaSOD1.2 转基因系种子消毒 10 min后, 播至LB固
体培养基(琼脂含量 0.8%), 生长至 6 叶期。选择长
势均匀的植株, 轻轻取出置含 150 mmol L−1 NaCl的
LB固体培养基(琼脂含量 0.5%)生长 7 d。对照和各
转基因系均培养 6 株。用数码相机拍摄对照和转基
因系NaCl处理植株照片。
1.8 盐分胁迫处理下生理指标测定
NaCl处理后 , 取对照和转基因系的相同叶位
(倒 3 叶), 参照Cakmak等 [13]的方法测定SOD活性;
参照邹琦等[14]的方法测定MDA(丙二醛)含量; 参照
赵世杰[15]的方法测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜
素含量; 参照Read等[16]的方法测定可溶性蛋白含量;
采用蒽酮法测定可溶性糖含量[17]。
2 结果与分析
2.1 高表达 TaSOD1.1 和 TaSOD1.2 转基因烟草
的分子检测
采用 CTAB法提取对照和转基因系(TaSOD1.1-a,
TaSOD1.1-b; TaSOD1.2-a, TaSOD1.2-b)的高纯度
DNA(图 2-A), 采用基因特异性引物进行 PCR 结果表
明, 目的外源基因在转基因系中均得到了特异性扩
增(图 2-B)。以提取的对照和上述转基因系总 RNA (图
2-C)为反转录模板, 各材料 3次稳定重复的 RT- PCR
结果如图 2-D。表明 TaSOD1.1和 TaSOD1.2基因在各
自的转基因系植株中均有较多的转录本存在。
2.2 盐分胁迫下对照和转基因系的表型差异
由图 3 可见 , 转基因系 Ta S O D 1 . 1 - a 和
TaSOD1.2-a 在 NaCl 处理一定时间后的植株伤害较
对照(CK)小。转基因系植株叶片的失绿面积较小 ,



图 2 对照和转基因系的 DNA(A)、PCR检测(B)、总 RNA(C)和 RT-PCR结果(D)
Fig. 2 The extracted DNA (A), PCR amplification (B), isolated total RNA (C) and results of RT-PCR (D)
1：TaSOD1.1-a转基因植株; 2：TaSOD1.1-b转基因植株; 3：TaSOD1.2-a转基因植株; 4：TaSOD1.2-b转基因植株。
1：TaSOD1.1-a; 2：TaSOD1.1-b; 3：TaSOD1.2-a; 4：TaSOD1.2-b.
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图 3 NaCl处理下对照(CK)和转基因系 TaSOD1.1-a和 TaSOD1.2-a的植株形态比较
Fig. 3 Comparison of plant phenotype in control (CK), transgenic lines TaSOD1.1-a and TaSOD1.2-a under NaCl treatment

具有相对较多的单株绿叶面积。此外, NaCl 处理后
转基因系的植株长势也明显强于对照。
2.3 盐分胁迫下对照和转基因系的 SOD 活性和
MDA含量
在非盐分胁迫条件下, 对照和各转基因系叶片
的 SOD 活性和 MDA 含量没有明显差异(资料未列
出 )。盐分处理后 , 与对照相比 , TaSOD1.1 和
TaSOD1.2转基因系叶片的 SOD活性均明显提高(图
4-A); 而MDA含量明显降低(图4-B)。此外, TaSOD1.1-
a 和 TaSOD1.2-a 分别较 TaSOD1.1-b 和 TaSOD1.2-b
具有相对较高的 SOD活性和相对较低的MDA含量,
与上述转基因系各自外源 TaSOD基因的表达水平具
有较密切的正、负相关。表明高表达小麦 TaSOD1.1
和 TaSOD1.2的转基因烟草, 通过外源基因在转录水
平上的调节, 能增强植株的 SOD 活性, 减轻盐分胁
迫造成的细胞膜质过氧化。
2.4 盐分胁迫下对照和转基因系的叶绿素、类胡
萝卜素、可溶性糖和可溶性蛋白含量
在盐分胁迫后, 与对照(CK)相比, 各转基因系叶
绿素 a、叶绿素 b含量和类胡萝卜素含量均有较大幅
度增加(图 5-A, B); 可溶性糖含量和可溶性蛋白含量
也具相同趋势(图 5-C, D)。表明在盐分胁迫条件下高
表达 TaSOD1.1和 TaSOD1.2后, 转基因烟草的生理功
能得到明显改善。与 SOD活性的表现趋势相一致, 转
基因系 TaSOD1.1-a和 TaSOD1.2-a的叶绿素 a、叶绿
素 b、类胡萝卜素、可溶性糖和可溶性蛋白含量均分
别高于转基因系 TaSOD1.1-b和 TaSOD1.2-b。
3 讨论
研究发现, 盐碱、高光强、干旱、高温、冷冻、
营养元素缺乏和衰老等均会导致植物细胞内超氧阴
离子等自由基增加, 使自由基代谢平衡遭到破坏, 进



图 4 NaCl处理下对照(CK)和转基因系的 SOD活性(A)和 MDA含量(B)
Fig. 4 The SOD activities and MDA contents in control (CK) and transgenic lines under NaCl treatment
第 8期 张海娜等: 过量表达小麦超氧化物歧化酶(SOD)基因对烟草耐盐能力的影响 1407




图 5 NaCl处理下对照(CK)和转基因系的叶绿素 a、b(A)、类胡萝卜素(B)、可溶性糖(C)和可溶性蛋白(D)含量
Fig. 5 The chlorophyll a and b (A), carotenoid (B), soluble sugar (C), and soluble protein (D) contents in control (CK) and transgenic
lines under NaCl treatment

而使植株生理功能受到影响[2]。盐分胁迫等非生物逆
境导致植株体内的活性氧产生和清除能力失衡, 诱
发过多活性氧累积导致细胞膜质过氧化加剧, 是造
成植株功能衰退或伤害的重要原因之一[1,3]。超氧化
物歧化酶(SOD)通过清除细胞内的活性氧、减少细胞
内部的活性氧累积, 对于增强植株的耐盐等抗逆能
力具有重要作用[2-3,18-21]。
在植物体内存在的 3 种超氧化物歧化酶中 ,
Cu/Zn-SOD 的含量最高, 约占SOD总量的 86%[2-3]。
Cu/Zn-SOD具有叶绿体和胞质两种同工酶形式, 在
抵御盐分等非生物逆境和病菌侵染等生物逆境中具
有重要作用[2]。小麦TaSOD1.1 和TaSOD1.2 基因全
长分别为 980 bp和 1 121 bp, 均编码 201个氨基酸,
含有一个由 79 个氨基酸残基组成的Cu/Zn-SOD保守
区, 在蛋白质的N-端存在一个由 45个氨基酸残基组成
的转运肽, 表明上述基因编码产物靶向叶绿体[6]。研究
发现, 盐胁迫条件下TaSOD1.1 和TaSOD1.2 在小麦
叶片中均高度表达, 且TaSOD1.2的表达受到盐胁迫
的诱导[6]。表明上述基因在植株抵御盐分胁迫逆境
中可能具有重要作用。
有关遗传转化SOD基因改善植株的抗逆性研究
已有一些报道[9-10,22-23]。Du等研究发现, 在玉米中超
表达小麦Mn-SOD基因 [5], 转基因植株抗氧化能力
较未进行基因遗传转化的对照显著增强[5,10]。将拟南
芥Fe-SOD基因、番茄和豌豆Cu/Zn-SOD基因转化烟
草后, 转基因植株抵御干旱诱发的氧化逆境能力明
显提高[22]。用烟草Mn-SOD基因为靶基因, 在叶绿体
中高表达的遗传转化玉米叶片具有明显增强的抗氧
化能力 [23]。本研究发现 , 超表达小麦TaSOD1.1 和
TaSOD1.2 基因的转基因烟草, 在盐分胁迫条件下,
植株通过外源TaSOD1.1 和TaSOD1.2 基因在转录和
翻译水平上的调节, 能明显缓解NaCl对植株的伤害
作用。表明通过增强上述小麦新型SOD基因的表达,
能提高转基因植株抵御盐分的能力。
本研究发现, 转基因植株在NaCl处理下的光合
色素(叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素)含量、可溶
性糖含量和可溶性蛋白含量均明显增加, 表现规律
与 SOD活性相似, 表明转基因植株超表达外源 SOD
基因后, 通过增强盐分胁迫条件下活性氧的清除能
力, 减少了膜质过氧化产物MDA数量, 减轻细胞膜
质过氧化, 维持了细胞相对较强的生理功能。因此,
超表达 TaSOD1.1 和 TaSOD1.2 的转基因烟草植株,
1408 作 物 学 报 第 34卷

)
在盐分胁迫条件下生理功能的改善, 以及抵御盐胁
迫能力的增强, 与植株体内 SOD数量的增多和 SOD
活性的增强, 进而改善细胞内部活性氧产生与清除
能力的平衡状态、维持细胞相对良好的分隔化膜系
统有关。
4 结论
NaCl 处理下, 与对照相比, 转基因系植株受到
的伤害较小, 叶片失绿面积较少, 植株长势明显增
强; 转基因系叶片的 SOD活性、叶绿素 a、叶绿素 b
含量及类胡萝卜素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋
白含量明显增加; MDA含量明显降低。在烟草中过
量表达小麦 TaSOD1.1 和 TaSOD1.2 基因, 能减轻盐
分胁迫诱导的细胞膜质过氧化程度, 增强植株抵御
盐分胁迫的能力。
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