全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(3): 534−538 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 湖南省湖南农业大学人才引进资助项目(2003YJ007)
作者简介: 钟军(1973−), 女, 湖南沅江人, 副教授, 博士, 硕士生导师, 研究方向为遗传育种。Tel: 0731-4617641; E-mail: zhhjp2005@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2007-06-05; Accepted(接受日期): 2007-09-18.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00534
柱花草子叶组织培养多因素组合数学模型的研究
钟 军 1,2 郑 卓 3 智旭丹 2
(1湖南农业大学农学院, 湖南长沙 410128; 2湖南农业大学细胞工程实验室, 湖南长沙 410128; 3井冈山大学生命科学学院, 江西吉安
343009)
摘 要: 采用正交试验研究了影响柱花草子叶组织培养的可控因子, 并建立了柱花草子叶培养对可控因子反应的数
学模型。结果表明, 可控因子与柱花草愈伤组织诱导率、芽分化系数和生根率之间存在真实的回归关系, 最佳回归模
型分别为 Y = 86.90+3.34X1+1.36X3+2.86X1X3、Y = 7.70 +1.52X2和 Y = 299.30+6.39X1+4.32X1X2。从模型的解析可看出,
对愈伤组织诱导率影响最大的是 NAA, 其次是 NAA 与蔗糖之间的互作, 最后是蔗糖; 对芽分化有影响的是 KT; 对
生根率影响最大的是 NAA, 其次是 NAA/IAA的比值。
关键词: 柱花草; 子叶培养; 多因素组合; 数学模型; 正交设计
Mathematical Model of Multifactor Combination on Tissue Culture for
Stylosanthes Cotyledon
ZHONG Jun 1,2, ZHENG Zhuo3, and ZHI Xu-Dan2
( 1 College of Agriculture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan; 2 Cell Engineering Laboratory, Hunan Agricultural University,
Changsha 410128, Hunan; 3 School of life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an 343009, Jiangxi, China)
Abstract: Stylosanthes guianensis is regarded as one of the newest green leguminous forage in tropical and subtropical regions
of China. It is a species of stylosanthes (Stylosanthes spp.), which has good traits including high dry matter yield, cold tolerance,
anthracnose resistance and late maturity. But there were few reports on optimal media recipes for tissue culture in Stylosanthes
guianensis. To investigate the main factors affecting tissue culture, callus was induced with a cultivar Reyan 10 (Stylosanthes
guianensis cv.), surviving callus was cultured on different media after 2 weeks, then, the buds with 2–3 cm in length were regen-
erated on root induction medium after 3 weeks, finally they were transplanted into soil as the roots had formed after 2–3 weeks.
Meanwhile the main medium components affecting the tissue culture were determined with orthogonal design, and mathematical
model between the medium components and traits was established. The results was showed that there was a real regression rela-
tion between regulated factors and rate of callus induction, coefficient of bud differentiation, rate of root induction, with the
equations of Y = 86.90+3.34X1+1.36X3+2.86X1X3, Y=7.70+1.52X2, and Y=299.30 +6.39X1+4.32X1X2, respectively. For callus in-
duction, NAA was the most efficient factor, interaction between NAA and sucrose was the second factor, and sucrose was the last
one. Also, the important factors were KT for bud induction as well as NAA and NAA/IAA for root induction.
Keywords: Stylosanthes; Cotyledon culture; Multifactor Combination; Mathematical model; Orthogonal design
柱花草(Stylosanthes spp.)是一种优良的热带豆科牧
草, 原产中南美洲, Stylosanthes有种或亚种 44个以上[1]。
通过遗传工程获得转基因柱花草具有广阔的前景 , 但成
功的关键在于组织培养技术。国外自 20世纪 60年代就开
展柱花草组织培养的研究[2-6], 然而使用的材料比较单一,
大多是有钩柱花草种; 国内的研究起步较晚, 且多集中于
抗病育种和分子标记上。蒋昌顺等[7]通过盆栽植株和离体
叶片接种试验, 研究了 45 份柱花草种质对中国 2 种类型
炭疽病原菌生理小种 CATAS292(A型)和 CATAS100(B型)
的反应。梁英彩等[8]对柱花草 907品种的选育过程进行了
研究, 并认为抗病性是选种必须考虑的因素之一。易克贤
等[9]认为, 柱花草在传统抗病育种方面进展缓慢, 但利用
分子育种 , 从表型选择到基因型选择可使育种具有更强
的操作性并可提高育种的预见性。王冬梅等[10]对热研 2
号柱花草转化体系进行了研究 , 试图通过基因工程的手
段达到柱花草抗病的目的。蒋昌顺等[11]采用 AFLP技术分
第 3期 钟 军等: 柱花草子叶组织培养多因素组合数学模型的研究 535


析了 42 个圭亚那柱花草品系的遗传多样性, 并对其抗病
性进行了接种鉴定, 又用 RAPD 技术比较了 45 个柱花草
品种的遗传多样性和抗病性 [12]; 同时对柱花草的研究进
展进行了评价 , 指出了分子标记技术对柱花草尤其在抗
病方面起到的作用[13]。
凭经验来筛选和优化培养基往往比较繁琐费时, 且
不一定能取得最佳效果 , 因此制定一个科学的实验方案
是相当必要的。正交设计是多因素分析的有利工具 , 它
可以很方便地从众多因素中选出主要影响因素及最佳水
平组合 , 用较少的试验次数获得较多的信息 , 为组织培
养进行多因素综合定量模式化研究提供了有效的方法和
手段。汤绍虎等 [14]以“雪青”梨为材料, 采用正交设计
快速获得了无菌外植体 , 为建立其优良的无性系和进行
遗传转化打下了基础。孙丽等[15]采用二次回归正交组合
设计, 对西洋参和胡萝卜愈伤组织的生长率进行了研究,
并通过组合试验设计与优化 , 得到可同时满足西洋参与
胡萝卜愈伤组织生长的理想培养基, 为 2 种植物的原生
质体融合奠定了基础。韩秀慧等[16]以微型月季茎段不定
芽分化培养基中 6-BA和 NAA浓度的优选为例, 采用二
次回归正交设计 , 实现了激素浓度和比例的定量优化。
本文在前期工作的基础上 [17], 进行柱花草子叶愈伤组织
的诱导、芽分化和生根培养 , 探讨几个主要性状和可控
因子之间的关系以及可控因子的优化技术指标 , 以期为
柱花草的定量化和模式化离体培养提供理论依据和
参考。
1 材料与方法
1.1 材料
热研 10号柱花草由湖南农业大学细胞工程实验室提供。
1.2 外植体的建立及培养条件
去掉种子表面的褐色种衣, 经 80℃热水处理 5 min,
70%酒精灭菌 5 min, 无菌水冲洗 1次, 10%次氯酸钠灭菌
10 min, 无菌水冲洗 3~4次, 接种于无激素的 MS培养基
上进行培养, 待子叶伸展时, 切取 0.5 cm2 子叶, 随机接
种在试验设计的培养基上, 每一种外植体各接种 3 瓶, 每
瓶接种 10个外植体。各阶段培养条件均为温度(28±2)℃,
光照时间 12 h/12 h, 光照强度 1 500 μmol m−2 s−1。
1.3 试验设计
1.3.1 试验各因素各水平及其编码值的确定 以 MS
为基本培养基, 并在愈伤组织的诱导、芽分化和生根培养
阶段各设 3 个因素和 2 个水平, 按 L8(27)正交试验设计。
为叙述方便, 将因素 j 的水平定义为 Zj, 因素的最高浓度
(上限)记作 Z2j, 编码值为 l; 因素的最低浓度(下限)记为
Z1j, 编码值为−l; 因素的零水平记为 Z0j(为上限和下限水
平的算术平均值), 编码值为 0, 仅在零水平的试验组合设
置 3次重复(表 1)。

表 1 正交设计的 3个因素和 2个水平
Table 1 Three factors and two levels of orthogonal design
因素 Factor 处理
Treatment

X1 (NAA, mg L−1) X2 (KT, mg L−1) X3 (sucrose, % )
Z2j 1.5 5.0 4.0
Z1j
愈伤组织诱导 Callus-inducing
0.5 3.0 2.0
Z2j 0.1 3.0 4.0
Z1j
芽分化 Buds differentiation
0.0 1.0 2.0
X1 (IAA, mg L−1) X2 (NAA, mg L−1) X3 (KT, mg L−1)
Z2j 1.5 1.5 0.3
Z1j
生根 Roots-regenerating
0.5 0.5 0.1

1.3.2 数学模型的组建 一次回归正交试验设计要求
每个因素都取 2个水平, 一次回归的方程为:
0
1
j j ij j
p
j i j
Y B B X B Xα α α αξ
= <
= + + +∑ ∑
拟合情况的 t 值检验模型为 t = [(b0－y0)×( df剩 +
df0)1/2] / [( SS剩 +SS0)
1/2×(1/N+1/m0)1/2]
1.4 统计参数
愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的外植体数/接种外
植体数×100%
芽分化系数=有效芽数/接种愈伤组织数
生根率=有生根现象的芽数/接种的芽数×100%
2 结果与分析
2.1 建立回归方程
由试验所得数据计算各项回归系数(表 2), 并分别建
立可控因子与愈伤组织诱导率、芽分化系数和生根率之间
的回归方程 Y=86.90+3.34X1−0.33X2+1.36 X3+0.94X1
X2+2.86X1 X3 + 2.47X2X3、Y =7.70+0.35X1+1.52X2−0.23X3
−0.09X1X2−0.01X1X3−0.01X2X3 和 Y=299.30 + 6.39X1+
0.69X2−0.61X3 +4.32X1X2−0.57X1X3+0.99X2X3。
2.2 回归方程的显著性检验
表 3表明, 在愈伤组织诱导率的回归方程中, NAA和
NAA 与蔗糖之间的互作达极显著水平, 蔗糖和KT与蔗糖

536 作 物 学 报 第 34卷

表 2 正交设计的处理组合与结果
Table 2 Treatments combination and results in orthogonal design
处理
Treatment
X0 X1 X2 X3 X1X2 X1X3 X2X3
Y
(A, % )
Y
(B)
Y
(C, % )
1 1 1 1 1 1 1 1 97.58 9.78 311.26
2 1 1 1 −1 1 −1 −1 84.21 9.43 309.11
3 1 1 −1 1 −1 1 −1 91.44 6.11 296.72
4 1 1 −1 −1 −1 −1 1 87.92 7.38 303.59
5 1 −1 1 1 −1 −1 1 83.34 8.44 288.44
6 1 −1 1 −1 −1 1 −1 81.37 9.73 289.08
7 1 −1 −1 1 1 −1 −1 80.90 6.06 296.27
8 1 −1 −1 −1 1 1 1 88.86 5.66 295.78
9 1 0 0 0 0 0 0 86.48 7.84 297.56
10 1 0 0 0 0 0 0 85.17 5.71 299.99
11 1 0 0 0 0 0 0 88.65 8.56 301.56
aj 11 8 8 8 8 8 8 ∑Y=955.92 ∑Y=84.7 ∑Y=3289.36
Bj A 955.90 26.68 −2.62 10.90 7.48 22.88 19.78 SS 总=232.27
bj 86.90 3.34 −0.33 1.36 0.94 2.86 2.47 SS 回=226.02
uj 88.90 0.86 14.85 6.99 65.43 8.90 SS 剩=6.25
Bj B 84.70 2.81 12.17 −1.81 −0.73 −0.03 −0.07 SS 总=26.19
bj 7.70 0.35 1.52 –0.23 −0.09 −0.01 −0.01 SS 回=19.98
uj 0.99 18.51 0.41 0.07 0.00 0.00 SS 剩=6.21
Bj C 3289.30 51.11 5.53 −4.87 34.59 −4.57 7.89 SS 总=516.14
bj 299.03 6.39 0.69 −0.61 4.32 −0.57 0.99 SS 回=493.27
uj 326.53 3.82 2.96 149.56 2.61 7.78 SS 剩=22.87
aj=∑Xj2 , Bj=∑XjY, bj= Bj/aj, uj=Bj2/ aj.
A, B和 C分别表示出愈率、芽分化系数和生根率。
A, B, and C represent callus-inducing rate, buds differentiation coefficient and roots-regenerating rate respectively.

表 3 回归方程的显著性检验
Table 3 Significance test of regression equation
变异来源 Variation origin df SS MS F F0.05 F0.01
A X1 1 88.98 88.98 57.04** 6.60 16.26
X2 1 0.86 0.86 0.55 6.60 16.26
X3 1 14.85 14.85 9.52* 6.60 16.26
X1X2 1 6.99 6.99 4.48 6.60 16.26
X1X3 1 65.43 65.43 41.94** 6.60 16.26
X2X3 1 8.90 8.90 7.71* 6.60 16.26
回归 Regression 6 226.02 37.67
剩余 Remnant 4 6.25 1.56
总变异 Total variation 10 232.27

B X1 1 0.99 0.99 0.64 6.60 16.26
X2 1 18.51 18.51 11.95* 6.60 16.26
X3 1 0.41 0.41 0.26 6.60 16.26
X1X2 1 0.07 0.07 0.04 6.60 16.26
X1X3 1 0.00 0.00 0.00 6.60 16.26
X2X3 1 0.00 0.00 0.00 6.60 16.26
回归 Regression 6 19.98 3.33
剩余 Remnant 4 6.21 1.55
总变异 Total variation 10 26.19

C X1 1 326.53 326.53 57.09** 6.60 16.26
X2 1 3.82 3.82 0.67 6.60 16.26
X3 1 2.96 2.96 0.52 6.60 16.26
X1X2 1 149.56 149.56 26.15** 6.60 16.26
X1X3 1 2.61 2.61 0.47 6.60 16.26
X2X3 1 7.78 7.78 1.36 6.60 16.26
回归 Regression 6 493.27 82.21
剩余 Remnant 4 22.87 5.72
总变异 Total variation 10 516.14
* 代表 F>F0.05, ** 代表 F>F0.01。A, B和 C分别表示出愈率、芽分化系数和生根率。
* and ** mean significant difference at 0.05 and at 0.01 probability levels respectively. A, B, and C represent callus-inducing rate, buds differen-
tiation coefficient and roots-regenerating rate respectively.
第 3期 钟 军等: 柱花草子叶组织培养多因素组合数学模型的研究 537


之间的互作达显著水平, 而 KT 和 NAA 与 KT 之间的互
作均不显著; 在芽分化系数的回归方程中, 只有 KT 达显
著水平 , 而其他因子表现均不显著; 在生根率的回归方
程中, 只有 IAA和 IAA与NAA之间的互作达极显著水平,
其他因子表现均不显著。因此可将其平方和及自由度并入
剩余项, 进行第二次显著性检验分析。
表 4表明, 愈伤组织诱导率除与 NAA和蔗糖之间的
互作不显著外 , 与其他因子的回归达显著水平 , 因此愈
伤组织诱导的回归方程可简化为 Y = 86.90+3.34X1+
1.36X3+2.86X1X3; 芽分化系数与 KT 达极显著, 因此芽分
化系数的回归方程可简化为 Y = 7.70+1.52X2; 生根率与
IAA和 IAA×NAA达极显著, 因此生根的回归方程可简化

表 4 回归方程的第二次显著性检验
Table 4 The second significance test of regressive equation
变异来源 Variation origin df SS MS F F0.05 F0.01
A X1 1 88.98 88.98 37.86** 5.99 13.74
X3 1 14.85 14.85 6.32* 5.99 13.74
X1X3 1 65.43 65.43 27.84** 5.99 13.74
X2X3 1 8.90 8.90 3.79 5.99 13.74
回归 Regression 4 218.17 54.54
剩余 Remnant 6 14.10 2.35
总变异 Total variation 10 232.27

B X2 1 18.51 18.51 21.78** 5.12 10.56
回归 Regression 1 18.51 18.51
剩余 Remnant 9 7.68 0.85
总变异 Total variation 10 26.19

C X1 1 326.53 326.53 54.42** 5.32 11.26
X1X2 1 149.56 149.56 29.91** 5.32 11.26
回归 Regression 2 476.10 238.05
剩余 Remnant 8 40.04 5.00
总变异 Total variation 10 516.14
*代表 F>F0.05; **代表 F>F0.01。A, B和 C分别表示出愈率、芽分化系数和生根率。
* and ** mean significant difference at 0.05 and at 0.01 probability levels respectively. A, B, and C represent callus-inducing rate, buds differen-
tiation coefficient and roots-regenerating rate respectively.

为 Y = 299.30 +6.39X1+4.32X1X2。
2.3 回归方程的拟合检验
上述回归关系显著, 只说明一次回归方程在试验点上
与试验结果拟合得好, 至于被研究的整个回归区域内部, 特
别是中心区域拟合得如何, 还要进一步做回归方程的拟合
检验。愈伤组织诱导率零水平重复试验的偏差平方和:
0 0 0
3
2
1
( ) 6 18.j
j
SS Y Y
=
= − =∑
t愈伤组织诱导率 =[(b0－ y0) ×( df剩 + df0)1/2]/ [( SS剩 +SS0)1/2×
(1/N+1/m0)1/2]
=[(86.90−86.77)×(6+2)1/2]/[(14.1+6.18)1/2
×(1/11+1/2)1/2] =0.11
芽分化系数零水平重复试验的偏差平方和:
0 0 0
3
2
1
( ) 4.4j
j
SS Y Y
=
= − =∑
t芽分化系数 =[(b0－ y0) ×( df剩 + df0)1/2]/ [( SS剩 +SS0)1/2
×(1/N+1/m0)1/2]
=[(7.70 − 7.37)×(9+2)1/2]/[(7.68+4.4)1/2×(1/11+1/2)1/2]
= 0.41
生根率零水平重复试验的偏差平方和:
0 0 0
3
2
1
( ) 8.12j
j
SS Y Y
=
= − =∑
t生根率 =[(b0－ y0) × ( df剩 + df0)1/2] / [( SS剩 +SS0)1/2×
(1/N+1/m0)1/2]
=[(299.3－ 298.7)× (8+2)1/2] / [(40.04+8.12)1/2×
(1/11+1/2)1/2] =0.36
实得 t愈伤组织诱导率＜t(11, 0.05)=2.201、 t芽分化系数＜t(8, 0.05)
=2.306、t 生根率＜t(10, 0.05)=2.228, 表明平均效应 b0项与零水
平重复试验实测数据的算术均数之间无显著差异, 这就
说明回归方程在回归区域中心拟合得较好, 回归方程可
以用来在回归区域内部进行预报。
2.4 利用回归方程进行预报
根据表 4 中的剩余平方和及零水平重复试验的实测
值相对于试验平均效应偏差平方和, 所预报的标准误差
如下:
S 愈伤组织诱导率 = (SS 剩/ df 剩)1/2 = (14.1/6)1/2=2.35 1/2 =1.53
S 芽分化系数 = (SS 剩/ df 剩)1/2 = (7.68/9)1/2=0.85 1/2 =0.92
S 生根率 = (SS 剩/ df 剩)1/2 = (40.04/8)1/2=5.00 1/2 =2.24
如果选定 95% 的置信概率进行预报, 则预报方程如
下:
Y 愈伤组织诱导率=y±t0.05×S=86.90+3.34X1+1.36X3+2.86X1X3±0.17
Y 芽分化系数=y±t0.05×S=7.70+1.52X2±0.40
Y 生根率=y±t0.05×S=299.30 +6.39X1+4.32X1X2±0.81
今分别设愈伤组织诱导培养基配方为 1.0 mg L−1萘
538 作 物 学 报 第 34卷

乙酸、4.0 mg L−1激动素和 3% 蔗糖; 芽分化培养基配方
为 0.05 mg L−1萘乙酸、2.0 mg L−1激动素和 3%蔗糖; 生
根培养基配方为 1.0 mg L−1萘乙酸、1.0 mg L-1激动素和
2%蔗糖。因此将 X1、X2和 X3编码全部变换为 0.5, 代入
预报方程分别获得愈伤组织诱导率 Y=(89.97±0.17)%, 芽
分化系数 Y=8.46±0.40, 生根率 Y=(303.58±0.81)%。在培
养基配方与本试验条件相近的情况下, 其预报愈伤组织
诱导率在 89.8%~90.14%、芽分化系数在 8.06~8.86、生根
率在 302.97%~304.39%的可靠程度为 95%。
3 讨论
正交设计是根据数理统计学观点 , 以正交性原理 ,
对多个因素同时进行考查, 在各个因素都处于变动的情
况下 , 用一套规范化的正交表来合理地安排试验 , 它可
以较少的试验获得精度较高的回归方程。有关植物组织培
养中的正交试验设计方法也有报道, 而本文的特点在于
以回归设计方程进行预报, 更精确地筛选柱花草组织培
养中所用的各植物激素的浓度配比, 既保留了正交试验
设计的优点, 又达到浓度优化的目的。
利用正交试验设计, 分别建立了可控因子与愈伤组
织诱导率、芽分化系数和生根率之间的回归方程。愈伤组
织诱导率与培养基中的 NAA、NAA×蔗糖互作和蔗糖有
关; 芽分化系数只与激动素有关; 而生根率不仅与 IAA
有关, 而且还与 IAA和 NAA之间的互作有关。
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