全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(10): 1634−1641 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30471098)，湖南省自然科学基金项目(09JJ6059)，湖南省教育厅青年基金项目(09B029)和作物种质创新与资
源利用国家重点实验室培育基地开放基金项目(2009-3)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 刘忠松, E-mail: zsliu48@sohu.com, Tel: 0731-84617381
第一作者联系方式: E-mail: ymljack@126.com, Tel: 0731-58291416
Received(收稿日期): 2010-04-05; Accepted(接受日期): 2010-05-03.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01634
芥菜型油菜 TT1基因的克隆和 SNP分析
严明理 1,2 刘显军 2 官春云 2 刘丽莉 1 陆 赢 1,2 刘忠松 2,*
1 湖南科技大学生命科学学院, 湖南湘潭 410201; 2 湖南农业大学油料作物研究所, 湖南长沙 410128
摘 要: 拟南芥的 TT1 基因(编码含有 WIP 结构域的锌指蛋白)对种皮的发育和颜色的形成具有重要的调控作用。本
研究利用同源克隆和 RACE 技术分离了芥菜型油菜 TT1 基因, 在芥菜型油菜黄黑籽材料的种皮中进行转录水平的分
析, 比较了黑籽油菜与黄籽油菜基因序列的差异, 并采用等位基因特异(allele-specific) PCR 技术对可能存在的单核
苷酸多态位点进行验证。结果表明, 芥菜型油菜 TT1基因的 DNA序列全长为 2 197 bp, 包含 1个内含子, 与甘蓝型
油菜 TT1-1基因的 DNA序列的相似性为 99%, 与拟南芥的 TT1基因 DNA序列的相似性为 85%; 推导的 TT1蛋白序
列为 300 氨基酸残基, 理论分子量为 33.97 kD, 等电点为 6.99; TT1在所有材料的种皮中均检测到表达; 比较紫叶芥、
四川黄籽、NILA和NILB的 TT1基因序列, 共发现 8个核苷酸变异位点, 均在基因的外显子区域, 其中紫叶芥和NILA
的序列相同, 黒四川黄籽和 籽近等基因系 NILB的序列相同。与紫叶芥相比, 黒籽近等基因系 NILB有 8个核苷酸差
异, 但种皮颜色与紫叶芥一样, 均为黑色, TT1基因这些位点的突变并不影响芥菜型油菜种皮的颜色。通过等位特异
PCR可以区分来自四川黄籽与紫叶芥的 TT1基因。
关键词: 芥菜型油菜; TT1基因; 克隆; 单核苷酸多态性
Cloning and SNP Analysis of TT1 Gene in Brassica juncea
YAN Ming-Li1,2, LIU Xian-Jun2, GUAN Chun-Yun2, LIU Li-Li1, LU Ying1,2, and LIU Zhong-Song2,*
1 School of Biology, Hunan University of Science and Technology, Xiangtan 411201, China; 2 Oilseed Research Institute, Hunan Agricultural Univer-
sity, Changsha 410128, China
Abstract: The quality of rapeseed can be further improved through the development of yellow-seeded cultivars, which are known
to contain less lignin and more proteins, both enhancing the dietary feed value. The TT1 gene encodes a WIP domain protein with
Zn-finger, which is essential for seed coat development and organ color in Arabidopsis, its mutation causes transparent testa. In
order to study molecular mechanism of seed coat color in rapeseed, TT1 gene was cloned from Brassica juncea using homol-
ogy-based cloning and RACE (rapid-amplification of cDNA ends) strategy. A modified allele-specific PCR procedure developed
for assaying single nucleotide polymorphisms of TT1 gene in Brassica juncea. In this study, cloning and characterization of the
orthologous TT1 gene from Brassica juncea were reported. The full length DNA sequence of TT1 gene was 2 197 bp with one
intron. The TT1 cDNA sequence was 1 412 bp in length, 903 bp of which was open reading frames (ORF) encoding a deduced
polypeptide of 300 amino acids with a predicted molecular weight of 33.97 kD and an isoelectric point of 6.99. The
above-mentioned genomic sequences showed 99% identity with the TT1 gene from Brassica napus, and 85% identity with the
TT1 gene from Arabidopsis. RT-PCR analysis showed that TT1 expressed in the seed coats of both the black- and the yel-
low-seeded B. juncea lines. Comparison of sequences of Sichuan Yellow (yellow seed) and purple-leaf mustard (black seed) re-
vealed nucleotide variation at the eight sites which all are located within the coding region of the gene. However, the mutations of
the TT1 gene at these sites had no effect on the seed coat color in B. juncea through comparing the sequences of NILB and pur-
ple-leaf mustard. The allele-specific PCR of the TT1 gene could distinguish purple-leaf mustard from Sichuan Yellow.
Keywords: Brassica juncea; TT1; Cloning; Single nucleotide polymorphism
在相同遗传背景下, 黄色种皮油菜与黑色种皮
油菜相比具有种皮薄、含油量高、木质素含量低等
优点[1-2], 选育黄籽油菜新品种是当前油菜育种的一
个主要目标。无论是黄籽油菜还是黑籽油菜种子的
第 10期 严明理等: 芥菜型油菜 TT1基因的克隆和 SNP分析 1635


胚都是黄色的, 黄籽的种皮是透明的, 黑籽的种皮
为黑色, 黄籽的颜色是其胚颜色的体现, 黄黑籽油
菜种子颜色的差别是种皮决定的。芥菜型油菜
(Brassica juncea)黄籽性状稳定, 一般由 2 对隐性重
叠基因控制[3-4], 但这些基因位点编码的基因尚未见
报道。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 种皮颜色
的改变与控制类黄酮合成的基因突变有关, 这些基
因一部分为结构基因, 编码参与类黄酮生物合成的
酶; 一部分为调控基因, 编码控制类黄酮生物合成
的转录因子; 还有一些编码色素转运积累有关的蛋
白质[5-6]。在油菜中, 关于种子颜色与控制类黄酮合
成的基因的转录有一些报道, BnTT12-2 在甘蓝型油
菜(B. napus)黄籽种子中未检测到转录, BrTT12在白
菜型油菜 (B. rapa)黄籽的种子中未检测到转录 [7],
推断黄籽可能与 TT12基因有关。笔者利用香草醛对
芥菜型油菜不同种皮颜色近等基因系的授粉后 15 d
和 25 d种子种皮进行染色, 发现黑籽近等基因系的
种皮很快被染成红色, 而黄籽近等基因系种皮不染
色, 从而认为黑籽近等基因系的种皮含有 3,4-二羟
基黄烷酮和 4-羟基黄烷酮, 而黄籽种皮中没有这些
物质 [8]; 利用能与原花色素(也叫聚合单宁)特异结
合产生蓝色物质的染料对二甲氨基肉桂醛(DMACA)
对芥菜型油菜种皮进行染色, 发现黑籽种皮被染上
蓝色, 而黄籽种皮不染色, 表明在黄籽种皮中不含
原花色素 [9], 因此认为原花色素是导致芥菜型油菜
黄黑籽种皮颜色差异的主要物质。
在拟南芥中, TT1基因(WIP domain protein with
Zn-finger)是类黄酮生物合成途径中的一个重要的转
录因子, tt1 突变体的种子缺乏原花色素, 因而显黄
色[10]。拟南芥 TT1蛋白含有 303个氨基酸残基。该
蛋白含有两个锌指结构域, 间隔 63 个氨基酸残基, 是
典型的植物锌指蛋白。其 N 端基序属于 C2H2家族,
且有一保守序列(Trp-Ile-Pro, 为 WIP 结构域), 而 C
端则为不完整的 C2HC 结构, 故根据其保守序列的
前 3个氨基酸残基命名为 WIP域, WIP域可能在与
其他因子互作或DNA识别中起作用, 从而能调节其
他基因的转录。在拟南芥中, TT1基因能与花色素还
原酶(ANR, 也叫 BAN：BANYULS)基因启动子作用
来调节 ANR 的转录, 从而控制原花色素前体物质
表 -3-羟基黄烷酮 (epi-flavan-3-ols)的合成来影响种
皮颜色[5-6]。在甘蓝型油菜中, 拟南芥的 BAN基因启
动子能增强种皮原花色素合成, 推断甘蓝型油菜中
可能有类似拟南芥的 TT1等基因调节 ANR的表达来
影响种皮的颜色[11]。在芥菜型油菜黄籽材料的种皮
中没有检测到 ANR 基因的转录, 黒而 籽中都检测到
ANR 基因的转录[12], 因此推测芥菜型油菜中 TT1 基
因可能调节 ANR 基因的转录, TT1 基因的突变会导
致黄籽的产生。
本研究根据已报道的拟南芥 TT1 基因序列设计
引物, 以芥菜型油菜为材料, 结合 RT-PCR和 RACE
技术, 获得 TT1基因的全长 cDNA和全长基因序列,
比较 TT1 基因在芥菜型油菜黄籽材料与黑籽材料中
序列的差异, 寻找其单核苷酸多态性(single nucleo-
tide polymorphism, SNP)位点, 研究 TT1在种皮中的
表达, 旨在为探讨油菜 TT1 基因的结构、功能、多
态性及其与种皮颜色的关系奠定基础。通过分析紫
叶芥、四川黄籽及其黑籽近等基因系 NILA和 NILB
的 TT1 基因核苷酸序列特征, 开发出能够识别 TT1
基因来源的 SNP标记。
1 材料与方法
1.1 试验材料
芥菜型油菜 (Brassica juncea, 异源四倍体 ,
2n=4x=36, 基因组组成 AABB)地方品种紫叶芥(种
皮黑色, 种皮颜色位点基因型为 AABB, 自交 6代)、
四川黄籽(种皮黄色, 种皮颜色位点基因型为 aabb,
自交 8代)及其近等基因系 NILA (种皮黑色, 种皮颜
色位点基因型为 AAbb, BC6F4代)和 NILB (种皮黑色,
种皮颜色位点基因型为 aaBB, BC6F4代) [4], 把这些
材料种在人工气候箱中, 日长/夜长为 16 h/8 h, 日
温/夜温为 22℃/16℃。
1.2 核酸提取
根据香草醛和 DMACA 染色结果发现, 在授粉
后 15 d左右, 开始检测到种皮中有原花色素前体物
质如表-3-羟基黄烷酮等的合成, 授粉后约 25 d该合
成达到高峰, 按照严明理等[13]方法提取授粉后 15 d
和 25 d 种皮的总 RNA。采用 CTAB 法提取叶片总
DNA[14]。
1.3 芥菜型油菜 TT1全长 cDNA克隆和 DNA序
列的克隆
用 DNase I (TaKaRa)消化 RNA样品中的 DNA
后, 按 TOYOBO公司的反转录酶操作说明将其反转
录成 cDNA后作为 PCR模板。依据拟南芥 TT1基因
的序列设计同源简并引物 TT1(表 1), 以紫叶芥授粉
后 15 d种皮的 RNA反转录的产物为模板, 扩增 TT1
基因 cDNA 部分序列。根据分离的芥菜型油菜 TT1
1636 作 物 学 报 第 36卷

基因 cDNA部分序列设计 RACE引物。根据扩增出
的 cDNA序列合成 4条特异性引物 GSPF、NGSPF、
GSPR和 NGSPR (表 1)。依照 Clontech公司的试剂
盒(SMART kit)说明书上的步骤合成 5′- 和 3′-RACE
的 cDNA。5′-RACE扩增体系包括 2.5 μL的 5′-cDNA
以及通用引物 UPM 和 GSPR, 3′-RACE 扩增体系包
括 2.5 μL的 3′-cDNA以及 UPM和 GPSF。按试剂盒
(SMART Kit)说明书建立反应体系和 PCR扩增条件。
取 1 μL PCR 产物作为模板, 采用嵌套式通用引物
NUP和 NGSPF或 NGSPR分别进行第 2次 PCR, 扩
增条件为 94℃, 45 s; 63℃, 45 s; 72℃, 1.5 min; 共 30
个循环后, 72℃延长 6 min。

表 1 用于基因克隆和表达分析的引物
Table 1 Primers used in gene cloning and transcription analysis
引物名称
Primer name
序列
Sequence (5→3)
引物名称
Primer name
序列
Sequence (5→3)
TT1 TT1F: CCAATCCCTTGATCTCTTYCCTAAC TT1U TT1UF:CGAGATCTATAAACAAACATTCCCA
TT1R: CAATTYTTCTCRTGTGTKCGCCAATC TT1UR:CGAAATAAACAGATACCACACATTC
GSPF TGTTGGCGAAGGAGATGACGAGG TT1D TT1DF: CTTGCCATGTATGCTTCAAGACA
NGSPF AACAATCTTCAGATGCACATGTG TT1DR: GTTTAAAATCGGAACCGCAAACA
GSPR CCCTTTCAGTGACTCTGGTCCTTTCCT ACT ACTF: GACATTCAACCTCTTGTTTGCG
NGSPR CCTCGTCATCTCCTTCGCCAACATA ACTR: CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG

PCR产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 切胶回
收纯化后, 连接到 pMD18-T Vector (TaKaRa), 转化
大肠杆菌, 送上海英骏生物技术公司测序, 将测序
结果拼接后, 再设计扩增基因全长引物 TT1U (表 1),
扩增程序为 94℃预变性 3 min; 94℃变性 30 s, 55℃
退火 30 s, 72℃延伸 100 s, 循环 38次; 最后 72℃延
长 8 min。以紫叶芥、四川黄籽、NILA和 NILB的
DNA为模板, 使用 Pfu酶(北京 TIANGEN)进行 PCR
扩增后, 切胶回收纯化扩增产物, 用试剂盒加 A 尾
后, 连接到 pMD18-T Vector (TaKaRa), 转化大肠杆
菌, 随机挑选 2个阳性菌落送上海英骏生物技术公司
双向测序。
1.4 TT1的序列分析
利用DNAMAN 6.0软件推测出紫叶芥 TT1基因
编码的蛋白质序列 , 利用编码蛋白质在线分析
(http://www.expasy.org/tools), 预测分子量和等电点。
用DNAMAN 6.0软件分析供试材料TT1基因序列多态
性。在 GenBank/DDBJ/EMBL数据库中应用 BLASTP
程序对 TT1 蛋白质进行相似性比对, 选取相似度高
的物种的蛋白序列, 应用 MEGA 4.0 软件对推导的
氨基酸序列进行多序列比较构建进化树。
1.5 TT1基因转录水平的分析
根据 TT1基因的序列, 设计引物 TT1D (表 1)用
于基因表达分析, 模板分别为各材料授粉后 15 d和
25 d RNA的反转录产物。利用看家基因 Actin的表
达水平作为基因表达分析的内参[15], 其引物序列见
表 1。PCR反应体系总体积为 20 μL, 含 10 × PCR
buffer 2.0 μL、10 mmol L−1 dNTP mix各 0.3 μL、10
mmol L−1正向引物 1 μL、10 mmol L−1反向引物 1 μL、
1 U Taq DNA聚合酶、2.5 mmol L−1 MgCl2 2 μL、1 μL
反转录产物、无菌去离子水(补足到 20 μL)。引物
TT1D的扩增程序是 94℃预变性 3 min; 94℃变性 30
s, 58℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 循环 38次; 最后
72℃延长 6 min。Actin基因的 PCR扩增退火温度是
54℃, 循环 30次, 其他同 TT1D的扩增程序。
1.6 以等位基因特异 PCR 检测 TT1 基因单核苷
酸多态性(SNP)
根据 4 个供试材料中 TT1 基因的多态性位点,
参照 Drenkard等[16]、Hayashi等[17]方法和 TT1基因
序列的特性, 通过多次设计引物和优化 PCR 条件,
选择 16条检测 SNP位点的引物, 以起始密码子(ATG)
的 A编号为第 1, TT1UR为检测第 1 596和第 1 619
位点公共的下游引物, TT1UF为检测第 15、第 38、
第 77、第 149、第 194 和第 379 位点公共的上游引
物, 引物序列见表 2。PCR反应体系总体积为 20 μL,
含 10× PCR buffer 2.0 μL、10 mmol L−1 dNTP mix各
0.3 μL、5 mmol L−1正向引物 1 μL、5 mmol L−1反向
引物 1 μL、1 U Taq DNA聚合酶、2.5 mmol L−1 MgCl2
2 μL、50 ng DNA 模板、无菌去离子水(补足到 20
μL)。PCR扩增程序为 94℃预变性 3 min; 94℃变性
45 s, 退火 45 s, 引物的退火温度见表 2, 72℃延伸,
延伸时间 90 s, 循环 38次; 最后 72℃延长 6 min。
第 10期 严明理等: 芥菜型油菜 TT1基因的克隆和 SNP分析 1637


表 2 用于等位特异 PCR的引物
Table 2 Primers of allele-specific PCR
引物名称
Primer name
序列
Sequence (5→3)
检测位点
Site for detected
退火温度
Annealing temperature (℃)
ZTT1-15 TTCCCAAATGTTTTCATCACGT
HTT1-15 TTCCCAAATGTTTTCATCACGC
15 58
ZTT1-38 CAAACCACTGTTCACCACAGTC
HTT1-38 CAAACCACTGTTCACCACAGTT
38 57
ZTT1-77 ACTCAAGCTCTTCTTCTGATAA
HTT1-77 ACTCAAGCTCTTCTTCTGATAT
77 51
ZTT1-149 ACCCTAATAACAACAATACTCT
HTT1-149 ACCCTAATAACAACAATACTCG
149 50
ZTT1-194 CGATAGGATCAACTTAAACTCACG
HTT1-194 CGATAGGATCAACTTAAACTCACA
194 57
ZTT1-379 AAATGAAGTTTCCGGCACGG
HTT1-379 AAATGAAGTTTCCGGCACGT
379 60
ZTT1-1596 GACCAGGTCCAAAAGCCTTCAC
HTT1-1596 GACCAGGTCCAAAAGCCTTCAT
1596 61
ZTT1-1619 AGCGTTTCAGAGACAGAAGAGCA
HTT1-1619 AGCGTTTCAGAGACAGAAGAGCG
1619 60
斜体下画线为错配核苷酸; 引物名称以 Z 开头的是以紫叶芥 TT1 基因序列设计的引物, H 开头的是以四川黄籽 TT1 基因序列设
计的引物。
Mismatched nucleotides are italic-underlined. Primer names beginning with Z were designed from TT1 sequence of purple-leaf mustard.
Primer names beginning with H were designed from TT1 sequence of Sichuan Yellow.

2 结果与分析
2.1 芥菜型油菜 TT1基因的克隆
紫叶芥 TT1基因全长 DNA为 2 176 bp (图 1),
TT1基因的 cDNA序列全长为 1 412 bp (图 1), 对比
二序列发现, TT1基因含有 1个内含子, 起始密码子
为 ATG, 终止密码子为 TAA (图 1)。在 GenBank数
据库用 BLASTN程序分析发现, 所克隆 TT1基因的
DNA序列与拟南芥的 TT1基因DNA序列(AF190297)
相似性达 85%, E值为 0; TT1基因的 cDNA序列与拟
南芥的 TT1 基因 cDNA 序列(NM_103201)相似性为
91%, 与大豆(Glycine max)WIP1 基因(AJ311808)的
相似性为 73%, 与水稻 (Oryza sativa)WIP4 基因
(EF626940)相似性为 73%。与文献[18]中报道的甘蓝
型油菜 TT1-1 的 DNA 序列相似性为 99%, TT1-2 的
DNA序列相似性为 95%。
2.2 芥菜型油菜 TT1 基因推导的氨基酸序列比
较与分子进化分析
根据紫叶芥 TT1 基因的 cDNA 序列, 利用软件
DNAMAN 6.0 推导得到的蛋白质序列见图 1, 该基因
编码一个含 300个氨基酸残基的多肽, 命名为 BjTT1。
蛋白质在线分析发现, BjTT1 的理论分子量为 33.97
kD, 推测的等电点为 6.99。同源性比较结果表明 ,
BjTT1与路小春[18]报道的甘蓝型油菜的 BnTT1-1和
BnTT1-2 同源性分别为 97%和 96%, 与拟南芥
TT1(NP_174737)的同源性为 94%, 与葡萄锌指蛋白
(CAN67026)、篦麻 TT1(XP_002513936)、拟南芥
AtWIP3 (NP_172306)等 WIP 蛋白也有较高的同源
性。多序列比较分析表明, BjTT1 和甘蓝型油菜的
TT1 距离最近, 其次为拟南芥 TT1(NP_174737) (图
2), 可以推定在芥菜型油菜中, BjTT1是甘蓝型油菜
和拟南芥等植物 TT1的同源蛋白。
2.3 芥菜型油菜种皮 TT1基因的转录分析
以四川黄籽、紫叶芥、NILA、NILB授粉后 15 d
和 25 d种皮的 cDNA为模板, 用 TT1D引物和 Actin
基因引物进行扩增的结果(图 3)表明, 在所有供试材
料的种皮中都检测到 TT1 基因的转录, 不同材料间
的转录没有明显的差异。由此可以认为, 在芥菜型
油菜中, TT1基因在黄籽和黑籽的种皮中均表达。
2.4 芥菜型油菜 TT1基因的 SNP分析
对 4 个芥菜型油菜供试材料的 TT1 基因序列比
对分析显示, 每个材料所选的 2个菌落所测序列完全
一致。NILA 的 TT1 序列与紫叶芥的 TT1 序列相同;
NILB 的 TT1 序列与四川黄籽的 TT1 序列相同。比
1638 作 物 学 报 第 36卷



图 1 芥菜型油菜 TT1核苷酸序列和推导的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequence and its deduced amino acid sequence of TT1 gene from Brassica juncea
下画线序列为内含子, 黑体为起始编码子 ATG和终止编码子 TAA。
The intron is solid-underlined, boldfaced letters show the start codon ATG and the stop codon TAA.



图 2 芥菜型油菜 TT1氨基酸序列与其他植物锌指蛋白氨基酸序列通过 MEGA4.0构建的进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree generated by MEGA4.0 of TT1 amino acid sequences from Brassica juncea and zinc finger proteins from the
other higher plants
BjTT1: 芥菜型油菜紫叶芥 TT1; BnTT1-1: 甘蓝型油菜 TT1-1; BnTT1-2: 甘蓝型油菜 TT1-2; NP_174737: 拟南芥 TT1; CAN67026葡萄
锌指蛋白; XP_002513936: 篦麻 TT1; AAO64176: 拟南芥锌指蛋白; NP_191326: 拟南芥WIP2; CAC86165: 大豆WIP1; ABR21212: 水
稻 WIP4; NP_175533: 拟南芥 WIP5; NP_188724: 拟南芥 WIP4; NP_172306: 拟南芥 WIP3; BAD25257: 水稻 WIP2。
BjTT1: Brassica juncea TT1; BnTT1-1: Brassica napus TT1-1; BnTT1-2: Brassica napus TT1-2; NP_174737: Arabidopsis thaliana TT1;
CAN67026: Vitis vinifera zinc finger protein; XP_002513936: Ricinus communis TT1; AAO64176: Arabidopsis thaliana zinc finger protein;
NP_191326: Arabidopsis thaliana WIP2; CAC86165: Glycine max WIP1; ABR21212: Oryza sativa WIP4; NP_175533: Arabidopsis thaliana
WIP5; NP_188724: Arabidopsis thaliana WIP4; NP_172306: Arabidopsis thaliana WIP3; BAD25257: Oryza sativa WIP2.

第 10期 严明理等: 芥菜型油菜 TT1基因的克隆和 SNP分析 1639




图 3 TT1基因在芥菜型油菜种皮中的转录
Fig. 3 Transcription levels of TT1 in seed coats of B. juncea
H1、A1、B1、Z1分别代表四川黄籽、NILA、NILB和紫叶芥授
粉 15 d种皮; H2、A2、B2、Z2分别代表四川黄籽、NILA、NILB
和紫叶芥授粉后 25 d的种皮。
H1, A1, B1, and Z1 stand for seed coats of Sichuan Yellow, NILA,
NILB and purple-leaf mustard at 15 DAP (days after pollination), re-
spectively; H2, A2, B2, and Z2 stand for seed coats of Sichuan Yellow,
NILA, NILB, and purple-leaf mustard at 25 DAP, respectively.

较紫叶芥和四川黄籽 TT1 基因序列, 共发现 8 个单
核苷酸多态性位点(表 3), 它们均位于基因的外显子
区域, 其中的第 15、38、149、194、379、1 596 和
1 619 位多态性位点是碱基转换的结果, 第 77 位多态
性位点是碱基颠换的结果。进行 BjTT1 蛋白的氨基
酸序列比对分析, 发现第 15位的核苷酸变异属于同
义突变, 其他 7 个位点变异均导致氨基酸的改变(图
4)。与紫叶芥 TT1 基因相比, 四川黄籽和 NILB 的
TT1基因有 8个核苷酸发生突变, 导致 NILB和四川
黄籽的 TT1 蛋白有 7 个氨基酸同紫叶芥和 NILA 不
一致, 与 Sagasser 等[10]的研究结果比较发现, 突变
的位点在蛋白质功能区之外, 这些位点的突变可能
不会影响功能的变化, 即NILB的 TT1基因虽有这些
单核苷酸多态性位点, 但种皮仍然是黑色。紫叶芥
与 NILB 的 TT1 基因序列的差异并不能影响种皮的
颜色, TT1 不是决定这几个材料种皮颜色的关键基
因, 这些序列的差异只是物种进化的痕迹。
2.5 以等位基因特异 PCR检测 TT1基因的 SNP
序列比对发现, 紫叶芥与四川黄籽 TT1 基因 8
个位点核苷酸发生了碱基变异, 根据这些位点, 设
计了 SNP 检测引物分别在紫叶芥、四川黄籽和
NILA、NILB的 DNA中进行扩增, 通过多次设计引
物和优化 PCR条件后, 结果见图 5, 在表 2的 16条
引物中, 引物 ZTT1-15、HTT1-15在 4个供试材料中
均能扩出目的带, 因此除检测这个位点的 2 条 SNP
引物(ZTT1-15和 HTT1-15)外, 其他 14条引物(占总
引物的 86%)均可利用等位特异 PCR区分紫叶芥 TT1
基因与四川黄籽 TT1 基因。因此, 通过检测 TT1 基
因序列中 SNP 位点可以有效地识别芥菜型油菜 TT1
基因的来源。
3 讨论
本研究从芥菜型油菜中克隆获得 TT1 基因全
长序列, TT1 基因在供试的黄黑籽材料种皮中都表



图 4 紫叶芥和四川黄籽 TT1基因编码氨基酸序列的比较
Fig. 4 Alignment of amino acid sequences of TT1 in Sichuan yellow and purple-leaf mustard
HBjTT1: 四川黄籽; ZBjTT1: 紫叶芥; 黑体: 为突变的氨基酸; 下画线区: WIP-Zn指蛋白的功能区。
HBjTT1: Sichuan yellow; ZBjTT1: purple-leaf mustard; boldfaced letters: amino acid of mutation; solid-underlined letters: function region of
WIP-Zn protein.

表 3 紫叶芥/NILA与四川黄籽/NILB 的 TT1基因区域 SNPs位点
Table 3 Sites of single nucletide polymorphism (SNP) identified between the purple-leaf mustard/NILA and Sichuan Yellow/NILB in
the coding region of the gene TT1
单核苷酸变异位点 Sites of single nucletide polymorphism (bp) 材料
Accession 15 38 77 149 194 379 1596 1619
紫叶芥/NILA Purple-leaf mustard /NILA T C A T G G G T
四川黄籽/NILB Sichuan Yellow/NILB C T T G A T A C
1640 作 物 学 报 第 36卷



图 5 等位基因特异引物 PCR检测结果
Fig. 5 Results of the allele-specific PCR amplification
Z、A、B、H分别代表四川黄籽、NILA、NILB和紫叶芥, 引物
名称同表 2。
Z, A, B, and H stand for purple-leaf mustard, NILA, NILB, and
Sichuan Yellow, respectively. The primer names are the same as
listed in Table 2.

达, 表达量没有明显差异。芥菜型油菜 TT1 基因与
其他植物编码 WIP类蛋白的基因同源性高。在拟南
芥中 , TT1 基因编码的是 WIP 锌指蛋白 , 通过
NCBI-BLAST 分析可以认为本研究所克隆的芥菜型
油菜 TT1蛋白是一种WIP锌指蛋白。在真核生物中,
锌指蛋白含有 DNA 结合域, 包含 RNA 结合位点并
具调节蛋白质相互作用的能力, 在组织发育和分化
中有很重要的作用[19-21]。在拟南芥中, TT1可以作为
一种调节蛋白控制类黄酮的生物合成, 它是细胞类
黄酮积累所必需的锌指蛋白。本研究所克隆的芥菜
型油菜 TT1 基因序列与拟南芥 TT1 基因高度相似,
四川黄籽和黑籽近等基因系 NILB 的 TT1 基因序列
没有差异。在甘蓝型油菜中已克隆 TT1 基因, 表达
研究发现 TT1 在黄籽种子中表达量下调, 但未研究
TT1 基因在种皮中的表达和在黄黑籽中的序列差
异[18]。在芥菜型油菜中黄籽的产生是不是 TT1基因
突变所致, 还需要进一步研究。研究表明 ANR 在部
分黄籽芥菜型油菜的种皮中没有检测到表达[12], 但
ANR 的转录是芸薹属植物种子合成原花色素所必需
的[22]。结合拟南芥的研究结果[5-6], 在芥菜型油菜类
黄酮的合成途径中, ANR 基因的转录是不是受 TT1
基因以外的调控基因(TT2、TT8、TT16 和 TTG1)所
控制, 还需进一步研究。究竟是哪个基因突变导致
芥菜型油菜种皮颜色的变化, 可以利用所培育的近
等基因系为材料, 找到与种皮颜色连锁的分子标记,
然后筛选基因组文库, 克隆目的基因, 或者利用在
黄黑种皮中差异表达基因的启动子为诱饵, 筛选芥
黒菜型油菜 籽 cDNA 文库, 也可能找到调控芥菜型
油菜种皮颜色的基因。
在拟南芥中, 与野生型相比, tt1 突变体中 TT1
基因的 3个核苷酸的突变导致蛋白锌指结构的破坏,
从而使种皮颜色出现差异[10]。与紫叶芥 TT1基因相
比, 四川黄籽和NILB的 TT1基因有 8个核苷酸发生
突变, 导致 NILB 和四川黄籽的 TT1 蛋白有 7 个氨
基酸同紫叶芥和 NILA 不一致, 但这些突变位点不
在锌指结构的功能区域, 没有破坏 NILB 和四川黄
籽的 TT1编码的蛋白的功能域(图 4), 推断这些位点
的变化不影响种皮的颜色。在拟南芥中, tt1 突变体
营养器官的类黄酮合成没有受到影响, 但能影响种
皮中细胞的色素合成[9], 说明 TT1 基因受其他基因
的调节。在芥菜型油菜中, TT1基因被调控的模式如
何, 对植物器官颜色有何影响, 有待进一步研究。
等位基因特异 PCR 检测 TT1 基因 SNP 的结果
验证了黑籽近等基因系 NILB 的序列和轮回亲本四
川黄籽序列一致, 黑籽近等基因系 NILA 的序列和
供体亲本紫叶芥序列一致, 说明只要设计好合适的
引物, 优化好 PCR 条件, 用特异 PCR 检测基因的
SNP是可行的, 可用特异 PCR很方便地检测基因的
多态性和等位基因的来源。在转基因芸薹属的基因
漂移分析中, 尤其是在缺少转基因筛选标记的情况
下, 可以利用 TT1 基因作为转基因油菜或者芸薹属
花粉漂移检测时的标记基因, 可为基因漂移风险分
析提供新的方法[23]。
TT1 基因在拟南芥中只有 1 个拷贝[24], 但芥菜
型油菜是由白菜型油菜(B. rapa)和黑芥(B. nigra)天
然杂交、加倍形成的异源四倍体, 含有 A 和 B 2 个
基因组, 基因组大小是拟南芥的 6 倍, 理论上每个
同源基因应该有 2 个或更多拷贝[25-26]。但在本研究
中, 基于同源克隆和 RACE方法, 在紫叶芥、四川黄
籽、NILA和 NILB中分别只获得了一个 TT1基因序
列, 而 TT1 基因在芥菜型油菜中究竟有几个拷贝,
还需研究。
4 结论
在芥菜型油菜中克隆了 TT1 基因, 该基因由 2
个外显子和 1 个内含子组成, 编码一个 300 个氨基
酸残基的多肽, 具有其他物种中已有 WIP 锌指蛋白
的保守结构域; TT1 基因在芥菜型油菜黄黑籽材料
的种皮中均检测到表达; 比较紫叶芥、四川黄籽、
NILA和 NILB的 TT1基因序列, 共发现 8个单核苷
酸变异位点, 它们均在基因的外显子区域; 与紫叶
芥相比, 黒籽近等基因系NILB有 8个核苷酸发生突
第 10期 严明理等: 芥菜型油菜 TT1基因的克隆和 SNP分析 1641


变, 但种皮颜色与紫叶芥一样, 均为黑色, 推断 TT1
基因这些位点的突变并不影响芥菜型油菜种皮的颜
色。通过等位特异 PCR可以区分来自四川黄籽与紫
叶芥的 TT1基因。
References
[1] Rashid A, Rakow G, Downey R K. Development of yellow
seeded Brassica napus through interspecific crosses. Plant Breed,
1994, 112: 127–134
[2] Rahman M H, Joersho M, Poulsen M H. Development of yel-
low-seeded Brassica napus of double low quality. Plant Breed,
2001, 120: 473–478
[3] Vera C L, Woods D L. Isolation of independent gene pairs at two
loci for seed coat color in Brassica juncea. Can J Plant Sci, 1982,
62: 47–50
[4] Yan M L, Liu Z S, Guan C Y, Chen S Y, Yuan M Z, Liu X J. In-
heritance and molecular markers for the seed coat color in Bras-
sica juncea. Front Agric China, 2009, 3: 1–6
[5] Lepiniec L, Debeaujon I, Routaboul J M, Baudry A, Pourcel L,
Nesi N, Caboche M. Genetics and biochemistry of seed flavon-
oids. Ann Rev Plant Biol, 2006, 57: 405–430
[6] von Wettstein D. From analysis of mutants to genetic engineering.
Ann Rev Plant Biol, 2007, 58: 1–19
[7] Chai Y R, Lei B, Huang H L, Li J N, Yin J M, Tang Z L, Wang R,
Chen L. TRANSPARENT TESTA 12 genes from Brassica napus
and parental species: cloning, evolution, and differential in-
volvement in yellow seed trait. Mol Genet Genom, 2009, 281:
109–123
[8] Debeaujon I, Leon-Kloosterziel K M, Koornneef M. Influence of
the testa on seed dormancy, germination and longevity in Arabi-
dopsis. Plant Physiol, 2000, 122: 403–413
[9] Sharma S B, Dixon R A. Metabolic engineering of proanthocya-
nidins by ectopic expression of transcription factors in Arabidop-
sis thaliana. Plant J, 2005, 44: 62–75
[10] Sagasser M, Lu G H, Hahlbrock K, Weisshaar B. A. thaliana
TRANSPARENT TESTA 1 is involved in seed coat development
and defines the WIP subfamily of plant zinc finger proteins.
Genes Dev, 2002, 16: 138–149
[11] Nesi N, Lucas M O, Auger B, Baron C, Lecureuil A, Guerche P,
Kronenberger J, Lepiniec L, Debeaujon I, Renard M. The pro-
moter of the Arabidopsis thaliana BAN gene is active in proan-
thocyanidins-accumulating cells of Brassica napus seed coat.
Plant Cell Rep, 2009, 28: 601–617
[12] Liu X-J(刘显军), Yuan M-Z(袁谋志), Guan C-Y(官春云), Chen
S-Y(陈社员), Liu S-Y(刘淑艳), Liu Z-S(刘忠松). Inheritance,
mapping, and origin of yellow-seeded trait in Brassica juncea.
Acta Agron Sin (作物学报), 2009, 35(5): 839−847 (in Chinese
with English abstract)
[13] Yan M-L(严明理), Liu Z-S(刘忠松), Guan C-Y(官春云), Chen
S-Y(陈社员), Liu X-J(刘显军). Method for high-quality RNA
isolation from the seeds and their testa of Brassica species. Bio-
tech Bull (生物技术通报), 2007, (6): 97–100 (in Chinese with
English abstract)
[14] Dellaporta S L, Wood J, Hicks J B. A plant DNA minipreparation:
version II. Plant Mol Biol Rept, 1983, 1: 19–21
[15] Yan M-L(严明理), Liu X-J(刘显军), Liu Z-S(刘忠松), Guan
C-Y(官春云), Yuan M-Z(袁谋志), Xiong X-H(熊兴华). Cloning
and expression analysis of the dihydroflavonol 4-reductase gene
in Brassica juncea. Acta Agron Sin (作物学报), 2008, 34(1): 1–7
(in Chinese with English abstract)
[16] Drenkard E, Richter B G, Rozen S, Stutius L M, Angell N A,
Mindrinos M, Cho R J, Oefner P J, Davis R W, Ausubel F M. A
simple procedure for the analysis of single nucleotide polymor-
phisms facilitates map-based cloning in Arabidopsis. Plant
Physiol, 2000, 124: 1483–1492
[17] Hayashi K, Hashimoto N, Daigen M, Ashikawa I. Development
of PCR-based SNP markers for rice blast resistance genes at the
Pi-z locus. Theor Appl Genet, 2004, 108: 1212–1220
[18] Lu X-C(路小春 ). Molecular Cloning of Transparent Testa
(BnTT1) Gene Family Encoding WIP-Zinc Finger Proteins and
Differential Expression between Yellow- and Black-seeded Lines
of Brassica napus. MS Dissertation of Yunnan Agricultural Uni-
versity, 2006 (in Chinese with English abstract)
[19] Wolfe S A, Nekludova L, Pabo C O. DNA recognition by
Cys2His2 zinc finger proteins. Ann Rev Biophys Biomol Struct,
2000, 29: 183–212
[20] Mackay J P, Crossley M. Zinc fingers are sticking together.
Trends Biochem Sci, 1998, 23: 1–4
[21] Laity J H, Lee B M, Wright P E. Zinc finger proteins: new in-
sights into structural and functional diversity. Curr Opin Struct
Biol, 2001, 11: 39–46
[22] Auger B, Baron C, Lucas M O, Vautrin S, Berges H, Chalhoub B,
Fautrel A, Renard M, Nesi N. Brassica orthologs from BANYULS
belong to a small multigene family, which is involved in procya-
nidin accumulation in the seed. Planta, 2009, 230: 1167–1183
[23] Wu Y H, Xiao L, Wu G, Lu C M. Cloning of fatty acid elongase
1 gene and molecular identification of A and C genome in Bras-
sica species. Sci China (Ser C-Life Sci), 2007, 50: 343–349
[24] Winkel-Shirley B. Flavonoid biosynthesis: a colorful model for
genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology. Plant
Physiol, 2001, 126: 485–493
[25] Lysak M A, Berr A, Pecinka A, Schmidt R, McBreen K, Schubert
I. Mechanisms of chromosome number reduction in Arabidopsis
thaliana and related Brassicaceae species. Proc Nat Acad Sci
USA, 2006, 103: 5224–5229
[26] Lysak M A, Cheung K, Kitschke M, Bures P. Ancestral chromo-
somal blocks are triplicated in Brassiceae species with varying
chromosome number and genome size. Plant Physiol, 2007, 145:
402–410