全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(3): 526−529 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金重点项目(30330400)
作者简介: 马爱芬(1980−), 女, 河南清丰县人, 硕士, 研究方向: 植物分子育种。E-mail: mafeifei3@163.com
*
通讯作者(Corresponding author): 刘列钊(1973−), 男, 四川泸州人, 副教授, 从事作物遗传育种。Tel: 023-68250701; E-mail: liez-
hao2003@126.com
Received(收稿日期): 2007-07-18; Accepted(接受日期): 2007-09-25.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00526
甘蓝型油菜种皮色泽相关基因的 cDNA-SRAP差异显示
马爱芬 李加纳 谌 利 钱 伟 付福友 刘列钊*
(西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716)
摘 要: 为探寻甘蓝型油菜黄黑籽之间的种皮色泽表达差异的分子基础, 探索 cDNA-SRAP 差异显示的可行性, 选
用培育 7年的重组自交系群体(RILs), 根据群体分离分析法(bulked segregant analysis, BSA)构建了种子的RNA混合池,
利用 cDNA-SRAP法进行了差异显示研究。996对 SRAP引物组合扩增出 2 100条带, 2次扩增重复率为 65.2%, 其中
在黄黑籽材料之间重复稳定出现的差异片段有 12条, 长度在 100~300 bp之间。选择其中 7条差异片段, 进行回收、
克隆和测序, 发现 2个片段分别与拟南芥的 NAD+ADP核糖转移酶及小肽转移蛋白 3具有很高的同源性。结果表明,
利用 SRAP方法可以对甘蓝型油菜 cDNA混合池进行差异显示研究, 2条差异片段可能与甘蓝型油菜的种皮色泽基因
表达相关。
关键词: 甘蓝型油菜; cDNA-SRAP; 群体分离分析法; 差异显示
Differential Display of Related Genes to Seed-Coat Color by cDNA-SRAP
in Brassica napus L.
MA Ai-Fen, LI Jia- Na, CHEN Li, QIAN Wei, FU Fu-You, and LIU Lie-Zhao*
(College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China)
Abstract: The yellow-seed and black-seed in Brassica napus L. have different characters and different mechanisms in the seed
color formation. The objective of this research was to explore the molecular mechanism of the differential expression between
yellow and black immature seeds and demonstrate the feasibility of cDNA-SRAP for differential display. On the basis of the dif-
ferent lines with yellow and black seed-coat from recombinant inbred lines (RILs) which had self-pollinated for 7 generations, the
yellow and black immature seed RNA bulked pools were constructed. SRAP was used to analysis the different cDNA pools tran-
scribed from RNA pools. Totally, 2 100 amplifiedbands were obtained with 996 pairs of SRAP primer and the repeated bands
were 65.2%. Twelve steady differential fragments with length of 100–300 bp between yellow and black immature seeds were
acquired. Seven stable differential fragments were sorted out, cloned and sequenced. Sequence analysis revealed that only two of
the fragments had significant homologous nucleotide sequence with Arabidopsis thaliana, one was similar to NAD+ADP-ribosyl
transferase and the other was peptide transporter protein 3. The results indicated that cDNA pools with SRAP marker could be
used for differential display on Brassica napus, and the two fragments may be related to the seed coat color expression of Bras-
sica napus.
Keywords: Brassica napus L.; cDNA-SRAP; Bulked segregant analysis (BSA); Differential display
从 1992年 Liang等[1]建立mRNA差异显示技术(mRNA
differential display, DD)以来 , 该技术得到日益广泛的应
用 , 特别是在筛选某些表型相关的新基因方面更是取得
了重大进展[2]。Kaoru等[3]1994年提出用 RAPD引物筛选
随机扩增的 cDNA差异显示方法。随着差异显示技术的发
展, 出现了 cDNA-AFLP差异显示技术[4]。
Li和 Quiros[5]建立了相关序列扩增多态性(sequence-
related amplified polymorphism, SRAP)标记技术。SRAP
标记所用的模板可以是 DNA, 也可以是 cDNA。Li 等[6]
利用 SRAP 技术对花椰菜与花茎甘蓝的杂交双二倍体的
mRNA 进行反转录得到的 cDNA 进行扩增, 用 48 对引物
组合标记 88 个 cDNA 样品, 得到 281 个多态性条带。卢
第 3期 马爱芬等: 甘蓝型油菜种皮色泽相关基因的 cDNA-SRAP差异显示 527


泳全等[7]应用 SRAP技术对大米草的耐盐性状进行差异显
示研究, 鉴定出一个与水稻的 β-1,3-葡聚糖酶有 30%相似
性的差异片段。
自 Michelmore 等 [8]1991 年提出群体分离分析法
(bulked segregant analysis, BSA)以来, BSA法已经广泛运
用于植物抗、耐等性状的基因分离及鉴定。在油菜遗传育
种中, 目前大家关注的热点之一是选育甘蓝型黄籽油菜,
不仅因为黄籽较相同遗传背景的黑籽的含油量及蛋白质
含量高 , 而且黄籽油菜的粗纤维含量低 [9]。本研究根据
BSA 原理构建甘蓝型油菜黄、黑籽 RNA 混合池, 进而反
转录形成 cDNA 混合池。以 cDNA 混合池做 SRAP 差异
显示研究 , 期望获得与甘蓝型油菜种皮色泽表达相关的
基因信息。对了解甘蓝型油菜种皮色泽表达差异的遗传分
子机理有重要意义 , 对甘蓝型油菜黄籽育种工作有很好
的辅助作用。
1 材料与方法
1.1 材料
选自重庆市油菜工程研究中心的重组自交系群体
(RILs)。由 GH06 × 中油 821选系杂交经一粒传法连续自
交 7代, 父本中油 821 选系是性状稳定的黑籽材料, 母本
GH06 为具有一个显性黄籽主效基因的黄籽材料, 该亲本
黄籽度达到 90%, 黄籽率 100%, 黄籽性状表现稳定[10]。
根据 BSA 法选取连续 7 代黄籽度为 90%, 黄籽率 100%,
田间表现一致的 10 个株系构建黄籽混合池, 籽粒黄籽度
为 0, 田间表现一致的 10个株系构建黑籽混合池。每株系
取 5株性状一致的花后 45 d未成熟荚果, 立即放入液氮中,
−80℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 抽提、纯化及 RNA 混合池构建 在冰
上剥取种子, 液氮研磨后用总 RNA抽提试剂盒W6771(华
舜 , 上海 ), 按说明书进行抽提 , 用无 RNase 的 ddH2O
(Sangon, 上海)溶解 RNA。总 RNA 中的痕量 DNA 用
DNase I (TaKaRa, 大连 )处理 , 经酚 /氯仿 /异戊醇(25∶
24∶1)纯化后用无 RNase的 ddH2O溶解。用 GENE SPEC
I及 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA质量。用无 RNase的
ddH2O 平衡各株系间的 RNA 使其浓度相同, －80℃保存
备用。取等量的各株系 RNA混合, 构建相应的 RNA混合
池。
1.2.2 第一链 cDNA的合成 采用M-MLV(RNase H-)逆转
录酶(TaKaRa, 大连), 并按照其说明操作。反转录引物为
Oligo(dT)18(Invitrogen, 上海), 产物用无菌 ddH2O 稀释 6
倍(根据浓度对比试验得出的最佳稀释倍数), 于－20℃保
存备用。
1.2.3 第一链 cDNA 的 SRAP 扩增、PCR 产物电泳及检
测 PCR反应体系为 10×buffer 1.2 μL, Mg2+ 25 nmol
L−1, Forward Primer 5 nmol L−1, Reverse Primer 5 nmol L−1,
dNTP 2 nmol L−1, Taq DNA聚合酶 0.5 U(Transgen, 北京),
第一链 cDNA稀释产物 1 μL, 加水至 12 μL。根据 Li和
Quiros[6]设计引物, 正向引物有 17碱基, 5端前 10个碱基
为“填充”序列, 接着为 CCGG序列, 随后 3端的 3个选择
碱基为随机组合; 反向引物有 18碱基, 5端前 11个碱基为
“填充”序列, 接着为 AATT 序列, 随后 3端的 3个选择碱
基为随机组合, 由上海博亚生物技术公司合成。扩增程序
主要参照 Li和 Quiros[6]的方法。PCR产物在 6%的非变性
聚丙烯酰胺凝胶上以 150 mA恒流电泳 35 min。用银染法
染色和显影, 参考 Budowle[11]和 Bassan[12]提供的方法。
1.2.4 差异片段的回收、扩增及再回收 用改进的
Maxam和Gilbert[13-14]的破碎浸泡法回收差异 cDNA片段。
用 10 μL TE溶解回收产物; 检测回收与原片段大小相同
且没有杂带时, 取 5 μL回收产物用于 PCR再次扩增, 反
应体系扩大 4倍至 60 μL, PCR程序和初扩的 SRAP反应
相同。用琼脂凝胶检测产物并用浓缩型胶回收试剂盒
W5611(华舜, 上海)回收纯化目的片段, 最后溶于 ddH2O
中。
1.2.5 差异片段的克隆筛选、测序及分析 将回收的差
异片段克隆到 pMD18-T 载体(TaKaRa, 大连)上, 转化大肠
杆菌 DH5α感受态细胞、进行蓝白斑筛选。阳性克隆经菌落
PCR 检测后, 菌液送上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen)
测序。利用 NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
的 BLAST分析软件比对分析测序结果。
2 结果与分析
2.1 RNA提取的质量与定量
提取的总 RNA 经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测, RNA
的带型完整且清晰, 说明 RNA 质量较好(图 1)。RNA 经
GENE SPEC I 测定 , RNA 样品的 OD260/OD280 值在
1.80~1.98 之间, 说明所提取的 RNA 浓度较高, 符合试验
要求。

图 1 部分材料的 RNA
Fig. 1 RNA of some materials

2.2 甘蓝型油菜种皮色泽的 cDNA-SRAP差异显示
从图 2可以看出 SRAP引物组合Em33Me43在 350 bp
和 120 bp 处黄黑籽混合池之间不存在差异, 但有多态性
条带出现 , 说明这对引物扩增的片段可能与种皮色泽表
达无关, 其多态性是反映其他性状的。图 3中 SRAP引物
组合 Em11Me45在 190 bp处黄、黑混合池之间有差异, 在
黄籽混合池有表达 , 同时差异片段只在黄籽混合池所有
528 作 物 学 报 第 34卷

成员内表达, 说明这一片段可能与种皮色泽表达有关。综
合两种情况说明 cDNA混合池建立是可行的。
用 996对引物组合对 2个 cDNA混合池进行扩增, 获
得 2 100多条带, 长度在 50~500 bp之间。2次 PCR重复
扩增重复率为 65.2%, 两次扩增在黄、黑籽混合池间表现
相同的差异片段有 12条, 长度在 100~300 bp之间, 黄籽
池中呈阳性的差异片段有 2条, 黑籽池呈阳性的差异片段
有 10条。

图 2 Em33Me43引物组合的扩增结果
Fig. 2 The amplified result of primer combination Em33Me43
M: Marker, B: 黑籽混合池; Y: 黄籽混合池; B1~B10: 黑籽株系; Y1~Y10: 黄籽株系。
M: marker; B: black-seeded Pool; Y: yellow-seeded Pool; B1–B10: lines of black seeded pool; Y1–Y10: lines of yellow seeded pool.

图 3 Em11Me45引物合组的扩增结果
Fig. 3 The amplified result of primer combination Em11Me45
M: Marker; B: 黑籽混合池; Y: 黄籽混合池; B1~B10为黑籽株系; Y1~Y10为黄籽株系。
M: marker; B: black-seeded Pool; Y: yellow-seeded Pool; B1–B10: lines of black seeded pool; Y1–Y10: lines of yellow seeded pool.

2.3 差异片段的序列分析
选择重复扩增稳定表现的相同差异片段 7 条进行测
序 , 同源性分析表明其中 2 条 (序列号为 NM-123973,
NM-122152)分别与拟南芥的 NAD+ADP 核糖转移酶
(NM-123973)及小肽转移蛋白 3 (NM-122152)具有很高的同
源性(表 1), 同源性都接近 90%, 且 2个片段都在黑籽材料
中呈阳性。其余 5 条在数据库中未找到已知功能的同源
序列。

表 1 部分 cDNA-SRAP差异片段的序列分析
Table 1 Sequence analysis of a part of differential cDNA-SRAP fragments
编号 a
Codea
GenBank 登录号
GenBank accession No.
SRAP引物
SRAP Primer
相似蛋白
Similar protein
片段长度
Length of sequences (bp)
Em35Me32 NM-123973 5-GACTGCGTACGAATTGAG-3 5-TGAGTCCAAACCGGCTT-3
小肽转移蛋白 3
peptide transporter protein 3
205
Em45Me11 NM-122152 5-GACTGCGTACGAATTGTA-3 5-TGAGTCCAAACCGGAGG-3
NAD+ADP核糖转移酶
NAD+ADP-ribosyltransferase
184
a: 用对应的 SRAP引物编号进行编制。
a: Fragments codes were named after corresponding SRAP primers.
3 讨论
cDNA-RAPD 差别显示技术简便, 同时对低表达基
因敏感, 但假阳性高、重复率低[3]。cDNA-AFLP 对反应
条件及模板质量的敏感性优于前者 , 稳定性较高 , 但其
操作复杂, 成本高[15]。cDNA-SRAP引物设计是针对表达
序列, 操作简单、安全, 成本低。缺点是带型不够丰富, 稳
定性介于前两者之间。差异显示技术本身假阳性比较高,
实验中我们用DNase对RNA中的DNA进行严格控制, 通
过GENE SPEC I及琼脂糖凝胶电泳检测, 同时进行 SRAP
扩增时用 RNA、相应的 DNA和水为模板作为对照, cDNA
与 DNA为模板均能扩出带, 但带型不同, RNA及水为模
板为空白。确保无 DNA, 避免了因痕量 DNA 引起的假
阳性。
实验中出现 2 次扩增重复率为 65.2%的现象。原因
可能: 扩增时使用的模板 cDNA 是不同批次的反转录产
物。多次反转录需反复解冻 RNA, 会导致 RNA 降解, 故
不同批次的 cDNA完整性会不同。为解决该问题, 笔者使
用反应体系大且质量好的反转录酶, 以减少反转录次数。
此外, 纯化后的 RNA 根据每批反转录所需要的量进行分
装, 保证每批都有同样质量的 RNA 模板。构建 cDNA 混
合池时, 各材料的 RNA 浓度要一致, 但试验过程中, 不
第 3期 马爱芬等: 甘蓝型油菜种皮色泽相关基因的 cDNA-SRAP差异显示 529


能完全保证 RNA 的浓度高度一致, 同样影响反转录产物
的成分。解决此问题可通过 GENE SPEC I进行粗略测量
各材料浓度, 再用 actin 内参检测各材料 RNA 浓度是否
一致。
SRAP 引物选用的是付福友[16]利用重组自交系对不
同环境下的甘蓝型油菜种皮色泽进行 QTL 定位工作中具
有多态性的引物。差异片段 Em35Me32 (205 bp)与拟南芥
的小肽转移蛋白高度同源, 小肽转移蛋白是参与二肽和
三肽的跨膜转运的蛋白, 主要存在于人、动物、细菌、真
菌以及高等植物发芽种子中[17]。片段 Em45Me11(184 bp)
与拟南芥的 NAD+ADP核糖转移酶高度同源, NAD+ADP
核糖转移酶有改变染色体结构, 并对DNA修复酶如DNA
连接酶起导向和定位的作用, 促进 DNA断裂的修复[18]。
甘蓝型油菜在开花 45 d 以后, 黑籽在糊粉层的种脐周围
产生一个暗褐色的环, 而黄籽则无此环[19]。随着种子发育,
黄黑籽之间种皮色泽出现差异, 故本研究选用花后 45 d
的未成熟种子作为材料。通过差异显示研究得出的这 2
个片段是否与甘蓝型油菜的种皮色泽表达有关, 需通过
Northern Blot或 Quantitative RT-PCR以及基因功能验证
等来进一步确定。
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