全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(9): 1605−1609 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重大科技专项(2008ZX08002-001)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 张增艳, E-mail: zhangzy@mail.caas.net.cn **共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-05-04; Accepted(接受日期): 2010-07-19.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01605
玉米 ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析
王爱云 1,2 庄洪涛 2,3,** 张增艳 2,* 张学文 3 杜丽璞 2 叶兴国 2
1 中南林业科技大学生命科学与技术学院, 湖南长沙 410004; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家
重大科学工程 /农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京 100081; 3 湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128
摘 要: 以玉米 B73 基因组 DNA 为模板, 通过特异 PCR 扩增, 克隆出玉米启动子 ZmPR4 序列。序列分析表明, 该
启动子与 AJ969166 序列同源性为 100%。构建了 ZmPR4 或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因 GUS 的
表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米 ZmPR4 启
动子的本底表达活性明显比 Ubi 启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的 GUS 基因的表达明显增
强。PCR 检测结果证实 ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动 GUS 基因的表达。因此, 玉米
ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。
关键词: 诱导型启动子; 克隆; 愈伤组织; 瞬间表达
Cloning and Activity Analysis of Zea mays ZmPR4 Promoter in Wheat Imma-
ture Embryonic Calli
WANG Ai-Yun1,2, ZHUANG Hong-Tao2,3,**, ZHANG Zeng-Yan2,*, ZHANG Xue-Wen3, DU Li-Pu2, and YE
Xing-Guo2
1 College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 2 National Key Facility for
Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
3 College of Life Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: The ZmPR4 promoter was cloned from genomic DNA of maize inbred line B37 through specific PCR amplification.
The promoter cloned had the same sequence as the fragment registered in GenBank under the accession number of AJ969166.
Expression vectors driven by ZmPR4 promoter or Ubiquitin promoter were constructed, which harbor GUS gene. The vectors
were bombarded into wheat immature embryogenic calli. Histochemical assays of GUS activity, the ZmPR4 promoter was obvi-
ously expressed in wheat immature embryonic calli, but the expression activity was lower than that of Ubi Promoter. The ZmPR4
promoter could be induced by infection of Rhizoctonia cerealis. PCR assay confirmed the expression of GUS gene driven by
ZmPR4 promoter. These results suggest that ZmPR4 promoter has a use potential in molecular breeding of resistance in wheat.
Keywords: Inducible promoter; Cloning; Calli; Transient expression
小麦纹枯病是由禾谷丝核菌 (Rhizoctonia cerealis
Vander Hoeven)或立枯丝核菌(R. solani Kuhn)引起的一种
土传真菌病害[1], 常常造成小麦严重减产。近年来, 小麦
纹枯病呈现逐年扩展、加重的趋势[2], 选育抗纹枯病的优
良小麦新品种是保证小麦稳产、高产的有效途径之一。由
于小麦纹枯病菌的寄主范围广, 难以根治。况且, 易于利
用的抗纹枯病小麦种质资源匮乏[3], 常规抗病育种难以达
到理想的效果。近年来, 随着分子生物学、植物与病原互
作研究的深入以及生物技术的发展 , 一些抗病及其相关
基因相继被克隆 , 植物抗病基因工程育种也得到迅速发
展[4-12]。因此, 运用高新技术发掘、分离抗病有效基因, 进
而通过基因工程创制抗纹枯病小麦新种质与新品种 , 对
小麦纹枯病的防治具有十分重要的意义。
在植物抗病基因工程中一般使用组成型启动子, 如
花椰菜花叶病毒 35S启动子或玉米泛素基因(Ubiquitin)启
动子。这样的启动子驱动抗病基因在转基因植物各部位和
各发育阶段持续过量表达 , 虽然可以提高转基因植株的
抗病性, 但真正应用于作物遗传改良却存在一些不足, 如
容易造成物质和能量的巨大浪费 , 甚至影响植物的生长
发育[13-16]。因此, 作为转录水平上的重要调控元件—启动
子的研究和应用日益受到重视。
玉米的一个病程相关蛋白 4 (pathogenesis-related pro-
1606 作 物 学 报 第 36卷

tein 4, PR4)基因 ZmPR4的启动子, 是一个病原诱导型启
动子, 且具有组织特异表达特性。序列分析表明, ZmPR4
启动子包含两个与激发子的应答作用相关的顺式作用元
件, 即一个 W 盒和一个 ERE 顺式作用元件, 以及一些机
械创伤诱导基因表达的调控元件[10]。在玉米和水稻中可
被真菌侵染、真菌激发子和机械损伤等逆境诱导[10]。Coca
等[10]通过农杆菌介导法将 ZmPR4启动子与报告基因 GUS
融合的表达载体转入水稻, 组织化学分析表明, GUS 基因
在转基因水稻中具有表达活性, ZmPR4 启动子可被稻瘟
病菌侵染、真菌激发子和机械损伤诱导, 而且 ZmPR4 启
动子所驱动的 afp基因在水稻根、茎、叶片中较强表达, 在
种子胚乳中几乎不表达[10]。由玉米 Ubiqiutin 基因启动子
控制的 afp基因在水稻各组织器官中均有较强表达[10]。因
此 , 从转基因作物的农艺性状和生物安全性等方面综合
考虑, ZmPR4启动子是一个有潜在应用价值的启动子。尽
管该启动子在水稻抗稻瘟病研究中已有报道[10], 但在小麦
中的应用未见报道。本文从玉米自交系 B73 中克隆出
ZmPR4 启动子序列, 并分析了其在小麦幼胚愈伤组织中
的表达活性, 以期为小麦抗病分子育种提供新的启动子。
1 材料与方法
1.1 植物材料及菌株、载体
小麦品种扬麦 12的幼胚由中国农业科学院作物科学
研究所小麦分子育种组提供, 玉米自交系 B73 种子由中
国农业科学院作物科学研究所玉米组提供。
ZmPR4 启动子是根据已知序列 AJ969166 设计引物
从玉米 B73基因组中扩增获得。pMD18-ZmPR4、感受态
大肠杆菌 Top10、克隆载体 pMD18-T、pAHC25、pUC19
均由中国农业科学院作物科学研究所小麦分子育种组提供。
1.2 ZmPR4启动子的克隆和测序
根据 GenBank 公布的 ZmPR4 基因启动子序列
(AJ969166), 设计 1对特异 PCR引物 ZmPR4P-U: 5′-ACA
CCCTTCATCCCATAC-3′和 ZmPR4P-L: 5′-AGCTGCTAC
TTGCTTCTG-3′, 以玉米 B73 基因组为模板 , 从中扩增
ZmPR4基因启动子。扩增条件为 94℃预变性 3 min; 然后
94 45 s, 50 45 s , 72 105 s, ℃ ℃ ℃ 共 33个循环; 最后 72℃
延伸 10 min。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离, 回收
扩增片段, 纯化后插入 pMD18-T 载体, 热激转化大肠杆
菌 Top10菌株感受态细胞。
由中国农业科学院作物科学研究所测定 ZmPR4启动
子序列, 利用 DNAMAN软件中的 Alignment 程序进行启
动子序列分析和比对。
1.3 表达载体构建
pAHC25(图 1)包含 pUbi::GUS 的表达盒, 作为瞬时
表达实验的对照。
根据 ZmPR4 启动子序列测定结果, 设计 1 对特异
PCR引物(P3: 5′-gcaagcttACACCCTTCATCCCATAC-3′, 下
画线部分为 Hind III 酶切位点和 P4: 5′-ttcccgggAGCTG
CTACTTGCTTCTG-3′, 下画线部分为 Sma I 酶切位点),
以质粒 pMD18-ZmPR4为模板, 扩增 ZmPR4启动子, 琼脂
糖电泳后回收并纯化扩增片段, 用 Sma I和 Hind III双酶
切扩增片段、回收 Hind III-ZmPR4-Sma I。用 Sma I和 Hind
III 部分消化单子叶表达载体质粒 pAHC25, 回收大约 7.7
kb 的载体目标片段, 然后用 T4 DNA 连接酶将其与 Hind
III-ZmPR4-Sma I 相连接, 获得 pZmPR4::GUS 表达载体
(图 1), 以研究 ZmPR4启动子在小麦中瞬时表达活性。
1.4 基因枪法转化小麦幼胚愈伤组织
将扬麦 12 幼胚愈伤组织转移到高渗透培养基(SD2
培养基附加 0.2 mol L−1甘露醇, 0.2 mol L−1山梨醇)上, 渗
透处理 4~6 h, 将愈伤组织放置在培养皿中央直径约 2.5
cm 范围内, 每盘培养皿 50 块愈伤组织。用直径 110 µm
金粉分别包裹 pZmPR4::GUS、pUbi::GUS质粒, 采用 PDS-
1000/He 基因枪(Bio-Red公司), 选择 1 100 Psi的可裂膜,
载样距靶材料 6 cm进行轰击。轰击后在高渗培养基中继
续培养约 16~18 h, 再转入 SD2培养基恢复培养 2 d。
转化 48 h后, 植物表达载体 pZmPR4::GUS转化的愈
伤组织用沾有纹枯病菌液的滤纸覆盖 24 h, 进行病原菌
侵染诱导; 另外剩余的一半愈伤组织和用植物表达载体
pUbi::GUS转化的愈伤组织则用沾有MS培养液的滤纸覆
盖相同时间 , 作为研究非诱导情况下启动子的本底表达
活性; 用未转基因扬麦 12的愈伤组织作为阴性对照。
1.5 小麦愈伤组织 GUS组织化学染色分析
参考 Jefferson 的方法[17], 将处理后的愈伤组织浸泡
在 X-GLUC染色液(0.1 mol L−1 Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液
pH 7.0, 10 mmol L−1 EDTA, 5 mmol L−1铁氰化钾和亚铁氰
化钾, 0.1 mg mL−1 X-Gluc, 0.1% TritonX-100, 20%甲醇)中,
37℃保温过夜, 次日取出, 用 70%乙醇漂洗 2 次后, 用蒸
馏水清洗, 体式显微镜(LEICA M165FC)下观察并拍照。
统计愈伤组织总数, GUS+愈伤组织数和 GUS+蓝点总数,
并计算愈伤组织瞬间表达率(GUS+愈伤组织数/观察愈伤
组织总数×100%)和平均蓝点数(GUS+蓝点总数/观察愈伤
组织总数) 。
1.6 分子检测
参照王关林等 [18]提取愈伤组织基因组 DNA 作为
GUS基因 PCR检测的模板。根据质粒中 GUS基因序列设
计引物 : Gus1: 5′-GGGATCCATCGCAGCGTAATG-3′和
Gus2: 5′-GCCGACAGCAGCAGTTTCATC-3′, 预期扩增
片段大小约为 563 bp。PCR 扩增体系为 20 μL, 扩增程序
为: 94℃预变性 5 min; 94 1 min, 61 1 min, 72 1 min, ℃ ℃ ℃
共 30个循环; 最后 72℃后延伸 10 min。用扬麦 12为阴性
对照 , 质粒 pZmPR4::GUS 作为阳性对照 , 反应结束后 ,
扩增产物在 1.0 %琼脂糖凝胶上电泳, 观察结果。
2 结果与分析
2.1 启动子 ZmPR4 的克隆
用玉米自交系 B73 基因组 DNA 为模板, 进行 PCR
第 9期 王爱云等: 玉米 ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析 1607




图 1 植物表达载体 pZmPR4∷GUS 结构
Fig. 1 Structure of plant expression vector pZmPR4∷GUS

扩增, 扩增出一条约 1.4 kb特异条带, 电泳检测目的片段,
并切胶回收, 经 pMD18-T 载体连接后转化到大肠杆菌中,
通过菌落 PCR、PCR产物电泳检测, 结果表明在阳性菌落
中扩增到与 PCR扩增产物大小相同的 DNA片段。
对 ZmPR4P 测序分析表明, 利用 ZmPR4P-U/ZmPR4P-
L引物, 从玉米品种 B73基因组 DNA中克隆到原 ZmPR4
启动子(AJ969166)的第 47 至第 1429 位核苷酸序列, 两序
列一致性达到 100% (图 2)。
2.2 瞬时表达载体的鉴定
用 Sma I和Hind III部分酶切植物表达载体 pZmPR4::
GUS, 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明, 一些阳性克隆质粒
样品中均切出 1.9 kb左右的 GUS基因片段, 说明 GUS 基
因片段已经插入并连接到载体上。测序表明, 插入片段大
小与位置完全正确。
2.3 小麦愈伤组织 GUS基因组织化学染色
用植物组成型表达载体质粒 pUbi::GUS 和诱导表达
载体质粒 pZmPR4::GUS转化的小麦愈伤组织, 分别有 36
块和 14 块显现蓝色斑点, 瞬间表达率为 70.6%和 30.4%,
平均蓝点数为 1.75和 0.80, 而未转基因扬麦 12的愈伤组
织则检测不到蓝色斑点, 说明 ZmPR4 启动子在小麦愈伤
组织中有表达活性。当用纹枯病菌处理 pZmPR4::GUS转
化的小麦愈伤组织时, 有 25 块显现蓝色斑点, 瞬间表达率
为 58.1%, 平均蓝点数为 1.30。斑点面积、斑点数和着色强
度均高于pZmPR4::GUS对应的本底表达(图3), 说明ZmPR4
启动子在小麦中受纹枯病菌诱导后表达活性增加。
2.4 转基因小麦愈伤组织的 PCR检测
转 ZmPR4::GUS基因小麦愈伤组织的 X-Gluc染色蓝
色斑点组织与 pZmPR4::GUS 阳性对照中均扩增出约 563
bp的 GUS基因特异带(图 4), 表明 ZmPR4::GUS基因的确
通过基因枪转入到扬麦 12基因组中。
3 讨论
目前报道的转基因作物中, 导入的外源基因大多数
由强表达的组成型启动子驱动高效表达, 亦即在植物的
所有部位和所有发育阶段都高效表达, 既增加了植株的
代谢负担 , 又造成了物质和能量的巨大浪费。因此 , 研
1608 作 物 学 报 第 36卷



图 2 克隆的与 GenBank中 ZmPR4启动子(AJ969166)的核苷酸序列比较
Fig. 2 Alignment of cloned and original ZmPR4 promoter sequences (AJ969166)
黑色示 100%同源性。Black boxes represent 100% identity.



图 3 转基因小麦愈伤组织 GUS的组织化学染色结果
Fig. 3 Histochemical stain of GUS in transgenic wheat calli after different treatments
A: 肉眼观察结果; B: 体式显微镜下观察结果(10×20)。1: 含质粒 pUbi::GUS的转基因小麦愈伤组织; 2: 含质粒 pZmPR4::GUS的转基因小麦
愈伤组织; 3: 含质粒 pZmPR4::GUS的转基因小麦愈伤组织经纹枯病菌液诱导 24 h。箭头示 GUS +幼胚愈伤组织。
A: normal observation; B: observation under stereoscope. 1: transgenic wheat calli with pUbi::GUS; 2: transgenic wheat calli with pZmPR4::GUS;
3: transgenic wheat calli with pZmPR4::GUS treated with Rhizoctonia cerealis after 24 h. Arrows represent GUS + immature embryonic calli.
第 9期 王爱云等: 玉米 ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析 1609




图 4 转基因小麦愈伤组织中 GUS基因的 PCR分析
Fig. 4 PCR analysis of GUS in transgenic wheat calli
M: 100 bp DNA ladder; CK: 水; P: pZmPR4::GUS; WT: 阴性对照(扬
麦 12); 1–2: 转 ZmPR4::GUS基因的小麦 X-Gluc染色蓝色斑点组织。
M: 100 bp DNA ladder; CK: H2O; P: pZmPR4::GUS; WT: negative control
(Yangmai 12); 1 and 2: ZmPR4::GUS transgenic wheat blue calli.

究组织特异性启动子和诱导型启动子具有重要的理论和
实践意义。
据 Coca等[10]报道, ZmPR4启动子是诱导型启动子。
在水稻中, 通过病原诱导, ZmPR4 启动子能驱动 GUS 报
告基因表达, 并且该启动子仅在病原侵袭部位有活性。另
外, ZmPR4 启动子也能被真菌激动子、机械创伤激活。功
能分析表明, ZmPR4 启动子在水稻和玉米中的表现一样,
均具有相当保守的病原诱导表达特征。但是, 到目前为止,
在小麦中是否也存在 ZmPR4 类似的蛋白启动子还未见报
道, ZmPR4 启动子在小麦中是否具有表达活性也还没有
见报道。
通过启动子与 GUS报告基因的融合能够快速对启动
子的活性作定性鉴定。将上述融合结构在小麦愈伤组织中
瞬间表达, 可快速进行启动子活性的研究。本研究从玉米
自交系 B73 中克隆出 ZmPR4 启动子大部分序列, 通过在
小麦幼胚愈伤组织中瞬间表达和 PCR 检测等分析, 证实
了该 ZmPR4 启动子序列在小麦中具有表达活性, 此外,
纹枯病菌处理转基因小麦愈伤组织后 , 该愈伤组织中
GUS 染色表现出蓝色斑点数增加, 且颜色加深, 说明来
自玉米基因组的 ZmPR4 启动子表达可受纹枯病菌诱导,
可以作为潜在的抗纹枯病小麦基因工程的启动子。
References
[1] Chen Y-X(陈延熙), Tang W-H(唐文华), Zhang D-H(张敦华),
Jian X-Y(简小鹰). A preliminary study on etiology of sharp eye-
spot of wheat in China. J Plant Prot (植物保护学报), 1986,
13(1): 39–44 (in Chinese with English abstract)
[2] Shi J-R(史建荣), Wang Y-Z(王裕中), Shen S-W(沈素文), Chen
H-G(陈怀谷). Pathogenicity of Rhizoctonia cerealis to wheat in
Jiangsu province. Jiangsu J Agric Sci (江苏农业学报), 1997,
13(3): 188–190 (in Chinese with English abstract)
[3] Wang Y-Z(王裕中). Occurrence of wheat sharp eyespot and its
controlling. Plant Prot Technol Extension (植保技术与推广),
2001, 21(8): 39–41 (in Chinese)
[4] Mitsuhara I, Matsufuru H, Ohshima M, Kaku H, Nakajima Y,
Murai N, Natori S, Ohashi Y. Induced expression of sarcotoxin IA
enhanced host resistance against both bacterial and fungal patho-
gens in transgenic tobacco. Mol Plant-Microbe Interact, 2000, 13:
860–868
[5] Osusky M, Zhou G, Osuska L, Hancock R E, Kay W W, Misra A.
Transgenic plants expressing cationic peptide chimeras exhibit
broad-spectrum resistance to phytopathogens. Nat Biotech, 2000,
18: 1162–1166
[6] Sharma A, Sharma R, Imamura M, Yamakawa M, Machii H.
Transgenic expression of cecropin B, an antibacterial peptide
from Bombyx mori, confers enhanced resistance to bacterial leaf
blight in rice. FEBS Lett, 2000, 484: 7–11
[7] Li Q, Lawrence C B, Xing H Y, Babbitt R A, Bass W T, Maiti I B,
Everett N P. Enhanced disease resistance conferred by expression
of an antimicrobial magainin analog in transgenic tobacco. Planta,
2001, 212: 635–639
[8] Carmona, M J, Molina A, Fernández, J A, López-Fando J J, Gar-
cía-Olmedo F. Expression of the a-thionin gene from barley in
tobacco confers enhanced resistance to bacterial pathogens. Plant
J, 1993, 3: 457–462
[9] Mourgues F, Brisset M N, Chevreau E. Strategies to improve
plant resistance to bacterial diseases through genetic engineering.
Trends Biotech, 1998, 16: 203–210
[10] Coca M, Bortolotti C, Rufat M, Peñas G, Eritja R, Tharreau D,
Martinez del Pozo A, Messeguer J, San Segundo B. Transgenic
rice plants expressing the antifungal AFP protein from Aspergil-
lus giganteus show enhanced resistance to the rice blast fungus
Magnaporthe grisea. Plant Mol Biol, 2004, 54: 245–259
[11] Iwai T, Kaku H, Honkura R, Nakamura S, Ochiai H, Sasaki T,
Ohashi Y. Enhanced resistance to seedtransmitted bacterial dis-
eases in transgenic rice plants overproducing an oat cell-wall-
bound thionin. Mol Plant-Microbe Interact, 2002, 15: 515–521
[12] Kanzaki H, Nirasawa S, Saitoh H, Ito M, Nishihara M, Terauchi
R, Nakamura I. Overexpression of the wasabi defensin gene con-
fers enhanced resistance to blast fungus (Magnaporthe grisea) in
transgenic rice. Theor Appl Genet, 2002, 105: 809–814
[13] Jia S-R(贾士荣). Environment and food biosafety assessment of
trangenic plants. Adv Bioeng (生物工程进展), 1997, 17(6):
37–42 (in Chinese with English abstract)
[14] Morris S H, Adley C C. Irish public perceptions and attitudes to
modern biotechnology: an overview with a focus on GM foods.
Trends Biotechnol, 2001, 19(2): 43–48
[15] Simth N. Seeds of opportunity an assessment of the benefits,
safety and oversight of plant genomics and agricultural biotech-
nology. Biotechnology Law Report. August 2000, 19(4): 449–536.
[16] Moreno A B, Peñas G, Rufat M, Bravo M J, Estopà M, Messeguer
J, Segundo B S. Pathogen-induced production of the antifungal
AFP protein from Aspergillus giganteus confers resistance to the
blast fungus Magnaporthe grisea in transgenic rice. Mol Plant-
Microbe Interact, 2005, 18: 960–972
[17] Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene
fusion system. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5: 387–405
[18] Wang G-L(王关林), Fang H-J(方宏筠). Plant Gene Engineering,
2nd edn (植物基因工程, 第 2版). Beijing: Science Press, 2002.
pp 744–745 (in Chinese)