全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(6): 932−939 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家食用豆产业技术体系建设项目(nycytx-18), 食用豆行业科技专项(nyhyzx07-017), 国家自然科学基金项目(30871565)和中央级科
研院所社会公益研究专项(092060302-12)和国家“十一五”科技支撑计划(2006BAD02B08, 2006BAD13B05)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 程须珍,E-mail: Chengxz@caas.net.cn, Tel: 010-62189159
第一作者联系方式: E-mail: zhaodan96069@yahoo.com.cn; Tel: 13269117545
Received(收稿日期): 2009-11-07; Accepted(接受日期): 2010-03-19.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00932
绿豆遗传连锁图谱的整合
赵 丹 程须珍* 王丽侠 王素华 马燕玲
中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 利用绿豆及其近缘种的 701 对 SSR 引物, 对现有绿豆遗传连锁图谱进行补充, 结果在高感豆象绿豆栽培种
Berken和高抗豆象绿豆野生种 ACC41两亲本间筛选到多态性 SSR引物 104对。群体分析后, 结合其他分子数据, 使
用作图软件 Mapmaker/Exp 3.0b, 获得一张含有 179个遗传标记和 12个连锁群, 总长 1 831.8 cM、平均图距 10.2 cM
的新遗传连锁图谱, 包括 97个 SSR标记, 91个来自绿豆近缘种; RFLP标记 76个; RAPD标记 4个; STS标记 2个。
对 32个绿豆、小豆共用 SSR标记在遗传连锁图谱的分布分析发现, 二个基因组间有一定程度的同源性, 共用标记在
连锁群上的排列顺序基本上一致, 只有部分标记显示绿豆和小豆基因组在进化过程中发生了染色体重排; 利用新图
谱对 ACC41的抗绿豆象主效基因重新定位, 仍定位于 I(9)连锁群, 与其相邻分子标记的距离均小于 8 cM, 其中与右
翼 SSR标记 C220的距离约 2.7 cM。与原图谱比较, 新定位的抗性基因与其相邻标记的连锁更加紧密。
关键词: 绿豆; 遗传连锁图谱; SSR标记; 图谱比较; 抗豆象基因
Integration of Mungbean (Vigna radiata) Genetic Linkage Map
ZHAO Dan, CHENG Xu-Zhen*, WANG Li-Xia, WANG Su-Hua, and MA Yan-Ling
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: A high-density genetic linkage map with informative markers is essential for plant genome analysis, including gene
mapping, identification of quantitative trait loci (QTL), map-based cloning, and physical map construction. A genetic linkage map
of mungbean (Vigna radiata, 2n = 2x = 22) was constructed using recombinant inbred line (RIL) population derived from an in-
tersubspecific cross between a highly bruchid-susceptible cultivar Berken and a highly bruchid-resistant wild type ACC41 (V.
radiata subsp. sublobata). A total of 104 pairs of polymorphic SSR primers were screened from 701 pairs of primers for den-
sity-enhancement of the previous map. In combination with data from other markers, a new genetic linkage map with 179 markers
was obtained using Mapmaker/Exp 3.0b software, including 97 SSR markers (91 markers from mungbean close relatives), 76
RFLP markers, four RAPD markers, and two STS markers. All of these marker loci were assigned to 12 linkage groups with total
length of 1 831.8 cM and an average marker interval of 10.2 cM. The transferability of SSR markers from the relatives of mung-
bean was also evaluated in mungbean, including adzuki bean (V. angularis L.), black gram (V. mungo L.), common bean (Phaseo-
lus vulgaris), and cowpea (V. unguiculata). In the 597 pairs of SSR primers, approximately 65% form adzuki bean, 72% from
black gram, 42% from common bean, and 30% from cowpea could be effectively amplified in mungbean genome, indicating dif-
ferent levels of genomic homology between mungbean and these four relative species. A total of 98 pairs of polymorphic SSR
primers from the relative species were effective in genetic analysis of mungbean. The new linkage map of mungbean was com-
pared with a published linkage map of Azuki bean (V. angularis, 2n = 2x = 22, n = 11) on the basis of 32 common SSR markers.
Most of markers distributed on both maps in similar sequences, except that a few markers rearranged on chromosomes during
evolution. In the new map of mungbean, the major gene resistant to bruchid was located on LG I(9) as earlier reported. The dis-
tances between this gene and its flanking markers C78 (left) and C220 (right) were 8.0 cM and 2.7 cM, respectively. Consequently,
the marker interval containing this target gene has shortened compared with the previous map and the accuracy has also been im-
proved.
Keywords: Mungbean; SSR; Genetic linkage map; Comparative mapping: Bruchid resistant gene
第 6期 赵 丹等: 绿豆遗传连锁图谱的整合 933
绿豆 (Vigna radiata)属于豆科 (Leguminosae)蝶
形花亚科 (Papilionaceae)菜豆族 (Phaseoleae)豇豆属
(Vigna), 染色体组为 2n=22。由于其具有耐瘠、固氮
养地等特性, 目前已成为中国农业种植结构调整、
西部开发及经济欠发达地区农民脱贫致富的重要作
物[1]。同时绿豆富含蛋白质、维生素、矿质元素等
营养物质, 且具有药用价值, 是广受欢迎的医食两
用作物[2], 也是中国传统出口商品。然而, 与大宗作
物如玉米、水稻相比, 国内外对绿豆的遗传研究还
相对滞后, 现代分子生物学技术在其基因发掘、基
因标记、标记辅助育种等方面还鲜有应用。
遗传连锁图是基因标记、克隆、标记辅助育种
的重要基础。目前国外先后发表了 5 张绿豆遗传连
锁图 [3-7], 但标记密度较低 , 且所用标记大多为
RAPD 和 RFLP, 在图谱构建及标记辅助育种中存在
不利因素。SSR 分子标记因具有共显性、多态性丰
富、重复性好、实验周期短、在植物基因组中分布
广等众多优点, 已成为构建作物遗传图谱的首选分
子标记[8]。目前公开发表的绿豆 SSR 标记数目非常
有限 [9-12], 且多态性较低 , 其进一步的利用受到限
制 [11], 而小豆 (Vigna angularis)、菜豆 (Phaseolus
vulgaris)等绿豆近缘植物的分子生物学研究比较深
入, 已有大量 SSR 标记定位在遗传图谱上。因 SSR
标记在近缘植物基因组间有一定的通用性[13-15], 且
从基因组文库开发绿豆 SSR 标记相对耗时耗力, 所
以本研究对绿豆近缘种小豆、黑吉豆、菜豆和豇豆
的 SSR引物进行了多态性筛选, 将近缘种 SSR标记
整合到 Humphry 等[5]已构建的绿豆 RFLP 遗传连锁
图中。一方面, 为绿豆开发重复性好且试验周期短
的 PCR 标记和构建高密度绿豆遗传图谱奠定基础;
另一方面, 为绿豆与其近缘种间的比较基因组学研
究提供一定的信息。本研究结果将为 ACC41中抗绿
豆象基因的定位分析提供信息, 进一步辅助该基因
的精细定位研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
作图群体是以野生绿豆 ACC41 和栽培绿豆
Berken为亲本构建的 202个 F9代重组自交系群体(引
自澳大利亚)。母本 Berken (Vigna radiata ssp. radiata)
由美国俄克拉荷马州立大学 James Kirby 博士培育,
高感豆象(100%感)[16]; 父本 ACC41 (Vigna radiata
ssp. sublobata)是 1984年澳大利亚 Lawn博士在昆士
兰州的萨默塞特奥马镇(经度 152°33′, 纬度 27°7′)发
现的 1个野生绿豆材料, 为蔓生类型, 茎秆纤细, 农
艺性状与栽培绿豆有很大差异 [17], 高抗豆象(100%
抗)[18]。
1.2 引物与 SSR标记方法
SSR引物 701对, 其中小豆引物 197对, 黑吉豆
引物 61对, 菜豆引物 293对, 豇豆引物 46对, 绿豆
引物 104 对, 另外还有 RAPD 引物 8 个, 绿豆 STS
引物 2 对。引物均由北京赛百盛基因技术有限公司
合成。
参照 Ji等[19]发表的 SSR标记方法, 于苗期取亲
本及各株系叶片, 用简化 CTAB法提取总 DNA进行
PCR扩增, 用 5%的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离扩
增产物。
1.3 遗传标记多态数据
澳大利亚联邦科学与工业研究院(CSIRO)提供
的Humphry等[5]图谱, 包含78个RFLP分子标记数据。
1.4 绿豆抗感豆象鉴定数据
重组自交系 RIL 群体在 4 个环境下的绿豆象抗
感统计数据[20], 均由本实验室提供。RIL 群体种子
受害率为 0~100%, 根据种子受害率评价其抗性, 本
研究以 80%为界, 将 RIL 群体抗豆象性状值分为抗
(在 4 个环境下受害率均≤20%)和感(在 4 个环境下
受害率均>20%)两组。
1.5 连锁图谱的构建与整合
连锁分析软件为 Mapmaker/Exp3.0b。按软件要
求录入家系数据较完全的 SSR 标记新数据, 加上来
自 Humphry等[5] 78个 RFLP分子标记图谱数据, 同
父本的记作 a, 同母本的记作 b, 带型不清或数据缺
失者记作“−”。调用转换的数据文件, 设定 LOD≥3.0,
最大遗传图距 50 cM, 使用 group 命令推测可能的
连锁群, 然后利用 3 点和多点分析构建连锁群, 采用
compare和 order命令对连锁群的标记排序, ripple命
令进行反复梳理 , map 命令计算标记间遗传距离
(cM), 使用软件 MapChart绘制遗传图谱。作图后以
error detection 命令检测误差 , 设错误检测水平为
1%。以 Humphry等[5]绿豆图谱上的 RFLP标记为锚
定标记确定相应连锁群。绿豆抗豆象主效基因定位
和作图一并进行。最后, 利用共有的 SSR 标记对绿
豆和小豆两个近缘种基因组进行比较作图分析。
2 结果与分析
2.1 近缘种 SSR标记在绿豆中的分析
从 597对小豆、黑吉豆、菜豆和豇豆 SSR引物
934 作 物 学 报 第 36卷
中筛选出在野生绿豆 ACC41 和栽培绿豆 Berken 之
间的多态性引物 98对, 其中小豆引物 37对, 黑吉豆
引物 16对, 菜豆引物 41对, 豇豆引物 4对, 它们的
有效扩增率分别为 65%、72%、42%和 30%, 以来自
黑吉豆的引物在绿豆中有效扩增率最高, 来自豇豆
的引物有效扩增率最低; 另外, 筛选了 104 对绿豆
SSR引物, 但有效扩增率仅为 42%, 得到 6对多态性
引物, 再一次表明目前发表的绿豆 SSR 引物在绿豆
基因组中的多态性较低, 扩增效果也有待进一步提
高。用双亲间多态性好且产物稳定的 104 对引物对
作图群体进行分析, 共扩增出 107 个标记位点, 其
中 SSR引物 J5和 C14分别扩增出 2 个和 3个位点,
其余引物均扩增出一个位点。
作图群体双亲之间多态性标记的 2 种基因型在
RIL 群体中的比例应符合 1∶1, 对 107 个新增标记
的两种基因型在作图群体中的分布进行卡方测验表
明, 在 0.05概率水平和 0.01概率水平上分别有 9个和
32 个新增标记表现为偏分离, 占总标记位点的 38%。
在 41 个偏分离标记位点中, 37 个偏向母本 Berken
(绿豆栽培种), 占偏分离标记位点数的 90%, 仅有 4
个偏向父本 ACC41(绿豆野生种), 占偏分离标记位
点数的 10%。图谱整合后总的偏分离率为 32.2%, 较
之原连锁图谱[5]的 30.8%略高。
2.2 遗传连锁图谱的整合
在 Humphry 等[5]图谱基础上, 加上家系数据较
完全的 SSR 标记新数据, 使用 Mapmaker/Exp3.0 软
件作图。得到一张包含 12 个连锁群, 179 个分子标
记的遗传连锁图谱, 其中 SSR 标记 97 个:91 个来
自绿豆近缘种, RFLP 标记 76 个, RAPD 标记 4 个,
STS标记 2个, 图谱总遗传距离为 1 831.8 cM。各
连锁群标记数在 8~40 个之间, 连锁群长度在 51.2~
483.9 cM之间, 标记间平均距离 10.2 cM。
新增多态性位点中 103 个标记定位到图谱中,
其中 95个标记定位到Humphry等[5]构建的绿豆图谱
中 13个连锁群上, 形成了 11个连锁群, 剩余 8个标
记又另外形成了 1个连锁群 N (图 1)。新增标记中有
10个未能在连锁群上定位, 作图位点率 91.2%。
2.3 整合前后绿豆遗传连锁图对比分析
Humphry等[5]原图谱含 13个连锁群, 78个RFLP
标记位点, 总长 737.9 cM。新图谱有 12 个连锁群,
总长 1831.8 cM, 整合后图谱的长度显著增加了。原
图谱标记间平均距离 9.5 cM[5], 新图谱标记间平均
距离 10.2 cM, 标记间平均距离有所增大, 是由于新
图谱 A(1)’和 D(4)两个连锁群中存在两个大于 35 cM
的空隙, 其他连锁群密度均有所减小。整合后图谱
的标记分布更加均匀, 对绿豆基因组的覆盖率也极
大增加。
新图谱与原图谱连锁群间发生一些变化, 原图
谱中连锁群 A、B和 M因新加入 8个标记而连在一
起, 形成一个大的连锁群A(1)’(图 1), 说明原图谱中
这 3个连锁群可能是绿豆同一条染色体上的不同区域,
加密前被分成 3个连锁群, 可能是由于连锁群位点密
度不够高或者一些与三者关系紧密的位点还没有被
定位。绿豆完整的基因组应包括 11个连锁群, 本研
究得到了 12个连锁群, 表明至少有 1条染色体中存
在频繁交换或标记空缺区段。随着新位点数的不断
加入、连锁群密度的加大, 连锁群的数目一定会减
少, 直到与绿豆染色体一一对应。
2.4 小豆与绿豆的比较连锁图
绿豆新图谱含有 32 个小豆 SSR 引物定位标记,
这些引物在小豆遗传图谱[21]中已有确定位点, 并且
32对引物在两连锁图中均扩增出单个位点。利用这
些共有标记对绿豆和小豆图谱做简单的绘图比较
(图 2), 大多数标记被定位到所期望的位置, 并且通
过与其周围标记(两物种连锁群共有)的连锁关系进
一步证实两物种基因组间同源性的存在, 例如整合
后在绿豆连锁群 D(4)上定位的 5个 SSR标记均已定
位于小豆连锁图[21]的第 8 连锁群且顺序完全一致,
由此推断进化过程中绿豆连锁群 D(4)可能与小豆的
第 8 连锁群存在同源关系, 两连锁群间很可能有相
同或相似的保守序列。
2.5 绿豆抗豆象基因定位
原图谱的绿豆抗豆象主效基因 Br1 位于 I(9)连
锁群 RFLP 标记 pM213~VrCS16 之间, 距离左翼标
记 pM213 为 5.0~8.0 cM, 间距较大。图谱整合后,
该主效基因依然定位于原 RFLP 标记之间, 但此目
标范围内新增加了 5个 SSR标记 C370、C220、C352、
C273和 C151, 和 1个 RAPD标记, 各位点排列顺序
见图 1。抗性基因位点与相邻分子标记间的连锁关
系更加紧密, 其中与右翼 SSR 标记 C220 的距离约
为 2.7 cM。另外, STS标记 L11与 L12及已知与野
生绿豆 TC1966 抗豆象基因连锁的 RAPD 标记
C49-2、C78 在此连锁群中亦表现出与 ACC41 的抗
绿豆象基因 Br1有连锁关系(图 1, I(9)连锁群)。引物
第 6期 赵 丹等: 绿豆遗传连锁图谱的整合 935
图 1 整合后遗传连锁图
Fig. 1 Integrated genetic linkage map of mungbean
SSR引物以其来源的植物名称拼音的第一个字母再加本实验室编号来命名, 如引物 X109、H57、C239、J22、L83分别来自小豆、黑
吉豆、菜豆、豇豆和绿豆。*和** 表示显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)偏分离位点。新加引物以粗黑体示。
Primers were named as the first letters of the species’ names and followed by the number of our laboratory, such as the primer X109 (azuki
bean-Xiaodou in Chinese). * and **: significant segregation distortion loci at P<0.05 and P<0.01, respectively. New markers are shown in bold.
C220在绿豆基因组中的扩增情况如图 3。
3 讨论
3.1 近缘种 SSR标记在绿豆基因组中的转移性
本研究中绿豆 SSR引物在绿豆基因组中的扩增
效果与多态性仍不理想; 分析的绿豆近缘种 SSR 引
物在绿豆基因组中的有效扩增率为 30%~70%, 筛选
到的 98 对多态性 SSR 引物可以有效用于绿豆分子
遗传学研究, 说明在绿豆遗传研究比较落后的情况
下, 利用近缘种 SSR 标记对绿豆进行分子研究是便
捷可行的方法。
3.2 图谱整合前后标记位置的变化
整合后遗传连锁图与 Humphry 等[5]原图谱基本
一致, 但也有一些标记位置随着连锁图谱整合发生
936 作 物 学 报 第 36卷
图 2 绿豆与小豆的遗传连锁图比较
Fig. 2 Comparison of linkage maps of the mungbean (V. radiata) and azuki bean (Vigna angularis) genomes
黑色竖线为绿豆连锁群, 标以字母和数字, 除 N和 L外; 灰色竖线为小豆连锁群, 标以数字。
Mungbean linkage groups are shown as black vertical lines noted by letters and numbers, except N and L groups, azuki bean linkage groups as
grey vertical lines capped by numbers.
图 3 C220在 ACC41、Berken和 RIL部分家系上的扩增产物
Fig. 3 Amplification products of C220 among ACC41, Berken and parts of RIL lines
M: marker; P1: Berken; P2: ACC41; 3~6: RIL家系中高感材料; 7~10: RIL家系中高抗材料; 其余: 部分 RIL家系。
M: marker; P1: Berken; P2: ACC41; 3–6: Bruchid highly-susceptible lines of RIL; 7–10: Bruchid highly-resistant lines of RIL;
others: parts of RIL lines.
变动 , 4 个位点在连锁群上的位置发生颠倒(图 4),
这可能是因标记偏分离现象的影响, 宋宪亮等[22]认
为偏分离可以影响标记间的重组距离, 也会影响到
连锁群上标记的顺序。本研究中源于重组自交系的
偏分离位点较多, 约占位点总数的 32%, 可能与 RIL
群体的野生亲本携带不利位点较多或在重组自交系
群体构建过程中人为抽样造成的偏差等原因有关。
此外, 不同的研究者采用不同的分子标记和作图软件,
也可能导致不同遗传连锁图间标记顺序的差异[23-24]。
3.3 绿豆与小豆连锁图间的比较分析
本研究通过共有标记对绿豆 12 个连锁群和小
豆 11个连锁群的比较认为, 绿豆连锁图谱中 A(1)’、
第 6期 赵 丹等: 绿豆遗传连锁图谱的整合 937
图 4 整合后 B(2)和 H(8)连锁群上分子标记的位置变化
Fig. 4 Loci alternation of group B(2) and group H(8) after integration
A和 C分别为整合前的 B(2)和 H(8)连锁群; B和 D分别为整合后的 B(2)和 H(8)连锁群。
A and C are parts of linkage groups of B(2) and H(8) before integration; B and D are parts of linkage groups of B(2) and H(8) after integration.
C(3)、D(4)、E(5)、F(6)、H(8)、I(9)、K(11)、L 连
锁群可能分别与小豆连锁图谱中的第 4、10、8、7、
3、2、2、9、6连锁群相对应, 对应连锁群间可能存
在同源区域。由于两基因组对应连锁群间共有标记
数目较少, 如绿豆 C、F连锁群与小豆第 10、3连锁
群间仅有两个共有标记, 不能通过与周围共有标记
的连锁关系证实标记间的顺序性 ,所以结果还需更
多的共有标记验证。在以上对应连锁群中, 除绿豆
K(11)连锁群与小豆的第 9 连锁群中标记 X165 与
X170 位置颠倒外, 其余共有标记的顺序完全一致,
说明绿豆与小豆基因组间存在一定的保守性, 且保
守区域内很少发生重排。但标记 X126、X46、X40
与其周围的标记不同, 定位到了两个基因组间明显
不同的区域, 反映出绿豆与小豆基因组间关系的复
杂性。
另外, 基于比较图中绿豆连锁群 H 和 I 与小豆
连锁群 2的关系(图 4)推断, 该绿豆连锁图中连锁群
H和 I可能来自绿豆同一条染色体的不同区域, 或是
在绿豆进化过程中有密切联系。同样, Humphry等[5]
在利用共有标记对绿豆和扁豆连锁群进行比较时
(图 4)发现了类似的现象并也提出了以上观点。
豆科比较基因组学的研究结果认为豆科植物中
亲缘关系较近的物种间染色体同线性广泛存在, 而
图 5 绿豆连锁群H和 I与小豆连锁群 2(A)及与扁豆连锁群 2(B)
关系比较
Fig. 5 Comparisons of H and I linkage groups from mungbean
with the linkage group 2 of azuki bean (A) and with the linkage
group 2 of lablab (B)
938 作 物 学 报 第 36卷
且基因在染色体上具有相似的排列顺序[25-30], 本研
究通过利用共有标记对绿豆和小豆遗传图谱进行比
较, 所得结果进一步为该观点补充了论据, 并且获
得了一些绿豆和小豆基因组间的同源性信息, 期望
对它们在遗传衍化中关系的推测提供一些基本资
料。另外, 本研究所获得 SSR 标记的利用不仅会对
绿豆与其近缘种的比较基因组学研究提供信息, 对
于基因发掘、鉴定、标记辅助选择育种、绿豆种质资
源遗传多样性分析等研究也能起一定的促进作用。
3.4 抗豆象基因定位分析
新图谱中抗豆象基因与相邻分子标记连锁更加
紧密, 与右翼标记 C220遗传距离约为 2.7 cM, 精确
度较原图谱有所提高, 为该主效基因的精细定位奠
定了基础。本研究中目标区间内新增的 5个 SSR标
记(包括C220)均来自于菜豆, 虽然只有标记C151已
定位于菜豆遗传连锁图第 9 连锁群, 其他 4 个还尚
未定位 , 但以上结果还是可以表明利用近缘种的
SSR 标记开展绿豆抗豆象基因定位工作是可行的。
当然, 精细定位工作还受作图群体、标记数量和种
类等方面的影响, 所以今后应在尝试利用更多种类
标记的同时, 继续借助比较基因组作图, 获得近缘
种中抗豆象基因的同源片段, 首先筛选目标区段的
SSR 标记; 同时, 建立近等基因系或较大的作图群
体 F2:3, 完成对该抗绿豆象基因的精细定位工作, 进
而克隆、转化该抗性基因, 并用于抗豆象育种的分
子标记辅助选择, 以期选育出抗豆象的绿豆优良品
种, 从而解决豆象危害问题。
4 结论
通过对 597对绿豆近缘种的 SSR引物在绿豆基
因组中的可转移性分析, 约 65%小豆、72%黑吉豆、
42%菜豆、30%豇豆 SSR 引物可在绿豆中有效扩增,
共筛选到的 98 对多态性 SSR 引物可以有效用于绿
豆分子遗传学研究; 最终将 103个新标记位点整合至
Humphry等[5]图谱中, 其中 SSR标记 97个, 整合后
的图谱共有179个遗传标记, 12个连锁群, 总长 1831.8
cM, 平均图距 10.2 cM; 绿豆和小豆遗传连锁图中
共有 SSR标记及标记间的顺序反映二基因组间同源
性较高; 来自菜豆的 SSR标记C220与绿豆抗豆象主
效基因 Br1紧密连锁, 遗传距离约为 2.7 cM。
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