全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(6): 982990 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08002-002), 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2008AA10Z124)，国
家自然科学基金项目(30700504, 30700508)，北京市科技新星项目(2007B056, 2008B035)，北京农林科学院院青年基金项目和北京市自
然基金项目(5102016)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 赵昌平, E-mail: cp_zhao@sohu.com; 马有志, E-mail: mayzh@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: gshiq@126.com
Received(收稿日期): 2010-11-12; Accepted(接受日期): 2011-03-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00982
转 GmAREB基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性
高世庆 1 陈 明 2 徐兆师 2 唐益苗 1 李连城 2 马有志 2,* 赵昌平 1,*
1 北京市农林科学院北京杂交小麦工程技术研究中心, 北京 100097; 2中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良
国家重大科学工程 / 农业部作物遗传改良与育种重点开放实验室, 北京 100081
摘 要: 以耐盐性较强的大豆(Glycine max L.)品种铁丰 8号为试验材料, 克隆到 1个A亚族 bZIP类转录因子基因, 命
名为 GmAREB (Glycine max ABA responsive element binding protein)。该基因由 1 317个核苷酸组成, 编码 439个氨基
酸残基, 包括 4个保守的磷酸化位点区域(C1、C2、C3和 C4)、1个核定位信号区(KVVE)和 1个 bZIP转录因子保守
域。聚类分析显示 GmAREB 蛋白与拟南芥 ABF2、水稻 OsTRAB1 具有较高的同源性, 并存在较近的亲缘关系。采
用凝胶阻滞实验方法证明 GmAREB蛋白与 ABRE顺式元件具有体外结合特异性。功能分析结果表明, 在干旱胁迫条
件下, GmAREB 转基因拟南芥的存活率(50%)显著高于野生型(5%); 气孔统计分析显示转基因植株的气孔开度(0.8 μm)
明显比对照开度小(2.6 μm)。氧化胁迫结果显示 GmAREB转基因拟南芥在甲基紫精溶液中叶绿素含量比野生型高(7.3
mg g–1 FW)。转基因拟南芥 RT-PCR分析表明, GmAREB基因过表达能够增强下游胁迫相关基因 ABI1、ABI2的表达, 抑
制气孔开闭相关基因 KAT1、KAT2 的表达。综上所述, GmAREB 基因过表达有效调控了转基因拟南芥下游靶基因表
达, 加速了气孔关闭, 减少了水分蒸发和叶绿素降解, 从而提高了转基因拟南芥对干旱、氧化胁迫耐性。
关键词: ABA; bZIP转录因子; 拟南芥; 胁迫耐性
GmAREB Gene Improves Tolerances to Drought and Oxidation in Transgenic
Arabidopsis
GAO Shi-Qing1, CHEN Ming2, XU Zhao-Shi2, TANG Yi-Miao1, LI Lian-Cheng2, MA You-Zhi2,*, and
ZHAO Chang-Ping1,*
1 Beijing Engineering and Technical Research Center for Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097,
China; 2 National Key Facility for Crop Genetic Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of
Agriculture / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Abiotic stresses such as drought, high-salt and low temperature severely affect the yield and quality of crops. It is re-
ported that subfamily A of alkalescence leucine zipper transcription factors (basic leucine zipper, bZIP) mainly participated in
response to ABA, drought, high salt and oxidative stresses, plays vital roles in stress signal transduction, downstream gene ex-
pression regulation and improvement of anti-adversity in plants. In this study, soybean (Glycine max) cv. Tiefeng 8 with salt tol-
erance was used to isolate and obtain a bZIP transcription factor gene by electronic assembly methods, which was named as
GmAREB (Glycine max ABA responsive element binding protein). This gene was composed of 1 317 nucleotides and encoded 439
amino acids. Sequence analysis showed that there were four putative phosphorylation sites (C1, C2, C3, C4), a nuclear localiza-
tion signal region (KVVE) and a conservative bZIP domain. Homology and phylogenetic trees displayed that GmAREB had the
higher homology and more close relationships with Arabidopsis ABF2 and rice TRAB1. To study the combining characteristics of
transcription factors and DNA, we carried out electrophoretic mobility shift assay (EMSA) experiment and the results displayed
that GmAREB could specifically bind the ABRE cis-element in vivo. Functional identification of stress treatments showed that
the survival rate of 35S::GmAREB transgenic plants treated by drought was higher (50%) than that (5%) of wild type. Stomatal
observation displayed that the stomatal aperture of transgenic Arabidopsis (0.8 μm) was less than that of control (2.6 μm) under
第 6期 高世庆等: 转 GmAREB基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性 983


the drought stress for 2 h. The 35S::GmAREB transgenic plants were treated with methyl viologen (MV) to identify the oxidative
stress tolerance of the GmAREB gene. Statistical analysis showed that transgenic Arabidopsis maintained higher chlorophyl con-
tent (7.3 mg g–1 FW) than that of the wild-type. RT-PCR analysis of transgenic Arabidopsis showed that GmAREB overexpression
enhanced the expression of downstream stress-related target genes (ABI1, ABI2) and suppressed the stomatal opening-related tar-
get genes (KAT1, KAT2). Therefore, GmAREB overexpression effectively regulated the expression of downstream target genes,
accelerated the stomatal closure, reduced the moisture to evaporate, decreased chlorophyll degradation, and enhanced the toler-
ance to drought and oxidative stresses in transgenic Arabidopsis.
Keywords: ABA; bZIP transcription factor; Arabidopsis; Stress tolerance
干旱、盐碱等非生物逆境胁迫是植物生长发育
主要限制因子, 严重影响着作物产量及品质。转录
因子在植物抵抗非生物逆境胁迫的基因表达调控及
提高植物的抗逆性中发挥着重要作用[1-2]。
碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)蛋白
是真核生物转录因子中分布最广泛、最保守的一类
蛋白。它不仅参与种子贮藏基因的表达、光形态的
发生以及器官建成的控制, 而且还参与植物对脱落
酸、光和发育中各种信号的反应[3-5]。bZIP类转录因
子识别核心序列为 ACGT 的顺式作用元件 , 如
CACGTG(G 盒)、GACGTC(C 盒)和 TACGTA(A 盒)
等。其中, G 盒元件普遍存在于受 ABA、生长素、
茉莉酸、水杨酸诱导表达基因的调控区中, 还是光
诱导基因中最常见的顺式作用元件之一 , 拟南芥
HY5、GBF2等 bZIP类转录因子都能与 G盒元件特
异结合, 激活光诱导基因的转录[6]。
许多干旱胁迫应答基因的表达受 ABA的诱导。
在植物种子发育或水分亏缺等逆境过程中, 其内源
ABA的含量大量增加[7]。分析发现, 在 ICK1、rd29B、
rab18、KIN2、KAT2、ADH1、CHS、racS 和 SUS1
等抗逆应答基因的启动子区域发现了保守的 ABRE
顺式作用元件(ABRE, CACGTG)[8-9]。ABRE作为顺
式作用元件参与 ABA调节的基因表达, 与 ABRE元
件作用的 bZIP 转录因子结构中含有保守的亮氨酸
拉链结构, 在亮氨酸拉链的邻近区域具有一个碱性
区域[10-11]。研究发现, bZIP 类转录因子 ABF/AREB
能够激活含有 ABRE 元件的基因的表达[12-13]。在烟
草[14]、水稻[15-18]、大豆[19-20]、玉米[21]、大麦[22]、番
茄[23]等植物中, 与ABRE互作的 bZIP转录因子已被
分离。
根据拟南芥 bZIP转录因子的结构差异, 可将其
划分为 A、B、C、D、E、F、G、H、I和 S 10个亚
族。其中, A亚族包括 13个成员, 如 ABF1、ABF2/
AREB1、ABF3、ABF4/AREB2、GBF4、ABI5、AREB3、
DPBF2等[5,24]。其中, ABF1主要参与低温、ABA胁
迫应答反应, ABF3主要参与 ABA、高盐、低温、热、
氧化胁迫应答反应, ABF2/AREB1、ABF4/AREB2 主
要参与 ABA、干旱、高盐、热、氧化胁迫应答反应[5,25]。
转 ABF3基因的拟南芥, 对低温、热、氧化胁迫的耐
性比野生型拟南芥明显增强。ABF2/AREB1 过表达
的转基因拟南芥, 比野生型增强了干旱胁迫耐性[9,26]。
综上所述, bZIP 转录因子在调节植物的逆境应答,
提高植物的抗逆性中起着至关重要的作用[16-18,23]。
目前, 利用抗逆相关的转录因子基因能够有效
提高拟南芥、烟草、水稻等植物的抗逆性。然而, 迄
今为止利用大豆材料分离、克隆抗逆相关 bZIP转录
因子基因改良植物的抗逆性研究报道较少。本研究
以耐盐大豆(Glycine max L.)品种铁丰 8号为试验材
料, 利用比较基因组学和生物信息学相结合, 分离、
克隆一个 A亚家族 bZIP转录因子基因 GmAREB, 将
其导入拟南芥并对转基因植株进行抗逆性鉴定, 以
期明确该基因的功能, 为培育抗逆转基因小麦提供
重要的基因源。
1 材料与方法
1.1 材料处理
将室温 25℃条件下光照培养 2~3周左右的大豆
幼苗植株从花盆中移出干旱胁迫处理, 用蒸馏水将
根部泥土冲洗干净, 置滤纸上吸干水分, 分别处理
0、1、2、5、10和 24 h后取样, 迅速置液氮速冻后,
于–80℃保存备用。
1.2 GmAREB基因的克隆
提取干旱处理 2 h 的大豆品种铁丰 8 号幼苗总
RNA, 根据 TaKaRa 公司试剂盒进行操作, 以 AP
(5-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTT
TTTTTTT-3)序列为引物, 采用 Revere Transcriptase
(M-MLV)进行反转录。同时, 以拟南芥、大麦 bZIP
家族基因为参照序列进行 NCBI数据库 BLAST搜索,
获得大量的大豆 EST 序列。通过 CAP3 网站(http://
pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)进行电子拼接克隆。利用
DNAMAN软件设计引物 GmAREB-F: 5′-ATGAACT
TCAGGAACTTTGGTGTTG-3′; GmAREB-R: 5′-CC
ATGGTCCAGTAAGTGTCCTTCTC-3′。以干旱处理
984 作 物 学 报 第 37卷

2 h的 cDNA为模板, 进行 RT-PCR, 扩增程序为 94℃
预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 62℃退火 45 s, 72℃延
伸 1 min, 35个循环; 72℃ 10 min, 4℃保存。对 PCR
产物进行电泳、回收、连接、测序 BLAST分析。
1.3 融合蛋白的诱导表达及检测
在 GmAREB 基因的 bZIP 保守域两侧设计含有
EcoR I和 Xho I酶切位点的引物(5′-GCTAGAATCCG
GAGGGTTGATTGGAGTTGCTGCTG-3′和 5′-CAGT
GCTCGAGCCATGGTCCAGTAAGTGTCCT-3′), 扩
增 bZIP保守域序列; 将 bZIP保守域序列 PCR扩增
产物用 EcoR I和 Xho I酶切, 电泳检测、回收。将
回收的 bZIP保守域片段连接至 pGEX 4T-1载体(上
海西匹吉生物公司, Epgbiotech), 转化到 BL21DE3
大肠杆菌, 进一步 PCR、酶切、测序鉴定阳性克隆,
构建 pGEX4T-GmAREB融合表达载体。
挑含有融合表达载体的单菌落在 LB 液体培养
基中 37℃过夜培养; 次日转接培养 2~3 h 至 OD600
值在 0.6~0.8 之间, 加 IPTG 进行诱导融合蛋白的表
达。然后, 2 933×g离心(Sigma 3K15 水平转头, Sigma
公司)收集菌体, 加入 1×PBS溶液悬浮细胞, 同时加
入裂解酶混匀室温放置 5 min 后放入液氮中速冻 1
min, 再放入 60℃温水中反复冻融 10次, 4 400× g离心
10 min, 进行 SDS-PAGE 分析, 具体操作步骤按照
MicroSpin GST Purification Module protocol (Amer-
sham) 蛋白纯化回收试剂盒进行。
1.4 GmAREB蛋白的体外特异性结合检测
根据ABRE顺式元件序列设计正常探针(ABRE)
及突变探针(mABRE), ABRE(+)为 5-GAAGTCCAC
GTGGAGGTGG-3, ABRE(–)为 5-TCCCACCTCCA
CGTGGACT-3; mABRE(+)为 5-GAAGTAACATGT
TCGGTGG-3; mABRE(–)为 5-TCCCACCGAACAT
GTTACT-3, 2条探针单链加入 10×PCR buffer, 100℃
变性 10 min, 自然冷却形成双链 DNA。将正常 ABRE
探针及突变mABRE探针分别与GmAREB蛋白混合进
行非变性凝胶电泳, 170 V电压电泳 1~2 h, 最后将凝
胶进行 EB染色 5~10 min, 凝胶成像系统照相。
1.5 转基因拟南芥干旱胁迫处理及气孔观察
将 pBI121 用 Sma I、Spe I 进行酶切消化去除
GUS基因, 插入两端引入 Sma I、Spe I酶切位点的
GmAREB基因, 获得 pBI-35S::GmAREB植物表达载
体, 所含元件有 35S组成型启动子、GmAREB基因。
用构建好的载体转化农杆菌 C58C1 菌株, 获得转化
所用菌株。后者在 28℃培养至 OD600约 0.6~0.8, 通
过花蕾浸泡法转化拟南芥。对获得的 T3代转基因株
系进行功能分析。
将生长 2周左右的转基因拟南芥与野生型 25℃
光照条件下干旱胁迫处理 30 d, 统计存活率; 此外,
在离体条件下, 将转基因植株与野生型(Col-4)叶片
剪下置于滤纸上, 25℃光照条件下干旱处理 0、10、
30、60、90和 120 min分别撕取下表皮, 切成约 10
mm 的表皮条固定在载玻片上, 盖上盖玻片并迅速
转移到荧光显微镜(Spex F212 Fluorolog) 下观察统
计表皮保卫细胞的气孔开度, 设定自然光源 6 倍相
差, 在明场条件下 20倍镜观察(重复 3次)。
1.6 转 GmAREB基因拟南芥氧化胁迫处理
将生长 2 周左右的转基因拟南芥株系与野生型
植株叶片离体浸泡于 6 μmol L–1 MV (甲基紫精, 一
种具有强氧化性的除草剂)溶液中 25℃光照培养 24
h (以MS营养液浸泡的叶片为对照)进行氧化胁迫处
理, 3次重复。采用 SPAD-502便携式叶绿素测定仪
(上海鑫态国际贸易有限公司)测定叶绿素含量。
1.7 转基因拟南芥下游基因的表达检测
通过半定量 RT-PCR 进行转基因拟南芥的下游
基因 ABI1、ABI2、KAT1、KAT2 (表 1)的表达分析, 采
用 TaKaRa公司的反转录试剂盒进行 ABA及干旱处
理的 RNA 提取、cDNA 合成。RT-PCR 扩增程序为
94℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 60℃退火 45 s,
72℃延伸 45 s, 28个循环; 72℃ 10 min, 4℃保存。

表 1 拟南芥下游基因引物序列
Table 1 Primer sequences of downstream genes of Arabidopsis
基因名称
Gene name
登录号
Accession number
引物序列
Primer sequence
ABI1 At4g26080 F: 5′-TCAAGATTCCGAGAACGGAGATC-3′; R: 5′-GAGGATCAAACCGACCATCTAAC-3′
ABI2 At5g57050 F: 5′-GTTCTTGTTCTGGCGACGGAGC-3′; R: 5′-CCATTAGTGACTCGACCATCAAG-3′
KAT1 At5g46240 F: 5′-TTCTGCGTCGAGGAATACAATATAG-3′; R: 5′-CTTAGGGTCAACTAGAAGATAG-3′
KAT2 At4g18290 F: 5′-ACACAAGACCAATGTCAATCTCTTG-3′; R: 5′-GTCGACTAGAAGATATGAGTGGC-3′

第 6期 高世庆等: 转 GmAREB基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性 985


2 结果与分析
2.1 GmAREB转录因子基因序列分析
GmAREB 基因编码区序列由 1 317 个核苷酸组
成, 编码 439个氨基酸残基, 包括 1个核定位信号区
NLS(KVVE)和 1个 bZIP转录因子保守域, 此外还含
有 4 个保守的磷酸化位点(C1、C2、C3 和 C4)。其
中, C1磷酸化位点区从第 31个氨基酸到 51个氨基
酸(TLLRQPSTIYSLTFDEFQST); C2 磷酸化位点区
从第 107个氨基酸到 126个氨基酸(GLQRQGSLTLP
RTLSQKTVE); C3磷酸化位点区从第 153个氨基酸
到 172个氨基酸(NPQMQATLGEMTLEEFLVRA); C4
磷酸化位点区从第 427个氨基酸到 439个氨基酸(KI
QCLRRTLTGPW); bZIP保守区从第 355个氨基酸到
414 个氨基酸, 以 QAY 三个氨基酸为中心, 将左侧
26 个氨基酸组成的区域称作碱性 DNA 结合区(IEK
VVERRQRRMIKNRESAARSRARK), 右侧 31 个氨
基酸组成的区域称为亮氨酸拉链结构域 (TFELE
AEVAKLKELNRELQRKQEEIMEMKKNK), 并存在 3
个亮氨酸重复结构, 即每隔 6个氨基酸就会出现一个
亮氨酸(L)(图 1)。



图 1 GmAREB转录因子基因序列分析
Fig. 1 Sequence analysis of GmAREB transcription factor gene
GmAREB基因推测的磷酸化位点及保守域氨基酸序列分析。磷酸化位点区域 1用蓝色标记; 磷酸化位点区 2用粉红色标记; 磷酸化位
点区 3用紫色标记; 磷酸化位点区 4用绿色标记; bZIP保守域用红色标记。
Amino acid sequence analysis of putative phosphorylation sites and conservative domain. Phosphorylation site 1 was tagged with blue;
Phosphorylation site 2 was tagged with pink; Phosphorylation site 3 was tagged with purple; phosphorylation site 4 was tagged with green;
bZIP conservative domain was tagged with red.

986 作 物 学 报 第 37卷

2.2 同源树及系统进化树分析
利用 NCBI网站对 GmAREB基因的氨基酸序列
进行 Blastp 比对发现, GmAREB 基因保守域氨基酸
序列与拟南芥 (A. thaliana)的 ABF1(AtABF1, NP_
564551) 、 ABF2(AtABF2, NP_849777), 大 麦 (H.
vulgare) ABI5(HvABI5, AAO06115)、烟草 (N. ta-
bacum) bZIP(NtbZIP, AAY82589)、水稻(O. sativa)
ABI5(OsABI5, ABM90394)、BZ8(OSBZ8, AAB40291)
等存在较高的同源性。其中, 与拟南芥 ABF2、ABF3
和水稻的 TRAB1 同源性分别达到 88.1%、81.4%和
88.1% (图 2-A)。进化树分析显示, GmAREB与拟南
芥的 ABF2、OsTRAB1 存在较近的亲缘关系, 其次
与大麦的 ABI5 亲缘关系也较近, 而与其他 bZIP 类
转录因子(AtABF3、AtABF4、AtDBPF2、AtDBPF3、
AtGBF4和 OsABI5)亲缘关系相对较远(图 2-B)。
2.3 GmAREB蛋白的凝胶阻滞分析
以大豆 cDNA 为模板 , 用带酶切位点 EcoR
I/Xho I 的引物扩增 500 bp 的 bZIP 保守区片段, 用
EcoR I/Xho I消化后与 pGEX 4T-1载体进行连接、转
化到大肠杆菌 BL21DE3中, 阳性克隆测序分析表明,
bZIP 保守区开放阅读框 (ORF)与表达载体 pGEX
4T-1 的 ORF 阅读框一致, 重组融合表达载体如图 3
所示。将融合表达载体在大肠杆菌 BL21DE3中诱导
表达 , 采用低温裂解法进行裂解、纯化 , 获得了
GmAREB融合蛋白(图 4)。
将 GmAREB蛋白、GST蛋白分别与正常 ABRE
元件、突变的 mABRE元件混合进行凝胶电泳, 研究
GmAREB蛋白与 ABRE顺式元件的结合特异性。结
果显示, 含有GmAREB融合蛋白与正常的ABRE顺
式元件互作形成了清晰的滞后带(图 5, 泳道 4), 而
GmAREB蛋白与 mABRE不能形成滞后带(图 5, 泳
道 3); GST蛋白与 ABRE 顺式元件没有形成滞后带
(图 5, 泳道 2), 说明 GST 蛋白对融合蛋白结合特异
性没有影响。上述结果证明 GmAREB蛋白在体外与
ABRE元件具有结合特异性。
2.4 转基因拟南芥耐旱性鉴定
用带有 Sma I、Spe I酶切位点引物以大豆 cDNA
为模板扩增 1.3 kb的 GmAREB基因全长, 采用 Sma
I、Spe I限制性内切酶分别对 GmAREB基因扩增产
物、pBI121 载体进行双酶切、连接、转化, 分别构
建获得 pBI-35SGmAREB植物表达载体(图 6)。
将培养 2周左右的 35S::GmAREB转基因拟南芥
植株进行干旱胁迫处理 30 d, 发现野生型Col-4和转
基因植株几乎全部萎蔫。复水 12 d后, 表型观察发
现转基因植株能够恢复生长, 而对照几乎全部死亡
(图 7)。存活率统计显示, 35S::GmAREB转基因拟南



图 2 GmAREB蛋白的同源进化树分析
Fig. 2 Homology and phylogenetic tree analysis of GmAREB proteins
A: GmAREB蛋白与其他 bZIP转录因子同源树分析; B: GmAREB蛋白与其他 bZIP转录因子进化树分析(数据分析由 DNAMAN Version
6.0软件完成)。
A: homology tree analysis of GmAREB protein with other bZIP proteins; B: phylogenetic tree analysis of GmAREB protein and other bZIP
transcription factors (data were analyzed using DNAMAN version 6.0 software).
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图 3 GmAREB蛋白融合表达载体图
Fig. 3 Sketch map of GmAREB fusion protein expression
vector



图 4 GmAREB融合蛋白纯化
Fig. 4 Purification of GmAREB fusion protein
1: 纯化的 GmAREB蛋白; 2: 大肠杆菌总蛋白; 3: 蛋白 Marker。
1: purified GmAREB protein; 2: total proteins of E. coli;
3: protein marker.



图 5 GmAREB蛋白的凝胶阻滞分析
Fig. 5 EMSA of GmAREB fusion protein
1: 自由探针(ABRE); 2: ABRE元件与 GST蛋白的混合物;
3: 突变探针 mABRE与 GmAREB融合蛋白的混合物;
4: ABRE元件与 GmAREB融合蛋白的混合物。
1: free probe (ABRE); 2: mixture of ABRE element and GST pro-
tein; 3: mixture of mutant ABRE element and GmAREB protein;
4: mixture of ABRE element and GmAREB protein.
芥植株存活率分别为 50%; 而野生型植株存活率仅
为 5% (图 8)。在干旱胁迫 30 min后, 对照 Col-4的
气孔开度为 8 μm 左右 , 明显处于张开状态 , 而
35S::GmAREB转基因植株的气孔开度为 5.6 μm, 趋
于关闭过程中; 在干旱胁迫 120 min 后, 对照 Col-4
的气孔开度为 2.6 μm左右; 35S::GmAREB转基因植
株的气孔趋于关闭状态, 气孔开度为 0.8 μm (图 9和图
10)。上述结果表明, 干旱胁迫条件下, 35S::GmAREB
转基因植株气孔关闭较野生型 Col-4 快, 减少了水
分的蒸发, 降低了蒸腾作用, 从而增强了转基因植
株耐旱性。
2.5 转基因拟南芥抗氧化胁迫分析
将 35S::GmAREB 转基因拟南芥和野生型叶片
剪下, 离体浸泡于 6 μmol L–1 MV溶液中, 22℃光照



图 6 pBI-35SGmAREB植物表达载体构建图
Fig. 6 Map of pBI-35SGmAREB plant expression vector



图 7 转基因拟南芥及野生型干旱处理
Fig. 7 Drought treatment of transgenic plants and wild type



图 8 转基因拟南芥干旱处理存活率
Fig. 8 Survival rates of transgenic plants treated by drought stress

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图 9 干旱胁迫下转基因拟南芥的气孔
Fig. 9 Stomata of transgenic Arabidopsis under drought stress



图 10 干旱胁迫下转基因拟南芥的气孔开度
Fig. 10 Stomatal aperture of transgenic Arabidopsis under
drought stress

培养进行氧化胁迫处理。结果显示 , 将野生型和
35S::GmAREB转基因叶片浸泡在MS液体培养基中,
处理 24 h后对照和转基因植株叶片颜色、叶绿素含
量没有变化(21~24 mg g–1 FW); 然而将野生型和
35S::GmAREB转基因叶片浸泡在 6 μmol L–1 MV溶
液中, 处理 24 h 后对照叶片全部变白(图 11), 叶绿
素几乎全部被降解; 35S::GmAREB 转基因植株叶片
部分失绿, 叶绿素部分降解, 叶绿素含量为 7.3 mg
g–1 FW (图 12)。上述结果表明, 与对照植株 Col-4相
比, 35S::GmAREB 转基因拟南芥植株增强了氧化胁
迫耐性, 证明 GmAREB 基因具有一定的抗氧化胁迫
功能。
2.6 转基因拟南芥下游基因的表达分析
将 ABA 及干旱胁迫处理后的 35S::GmAREB 转
基因拟南芥进行下游靶基因(KAT1、KAT2、ABI1 和
ABI2)的表达分析。其中, KAT1、KAT2基因编码保卫
细胞钾离子通道蛋白, 在正常条件下介导 K+内流,
能够使保卫细胞张开 , ABA 及非生物逆境胁迫对
KAT1、KAT2 的表达起负调控作用[8]。ABI1、ABI2
基因编码磷酸化酶 2C的同源蛋白, 它的突变导致一
个有缺陷的气孔关闭, ABA 及干旱胁迫能够增强其
表达[2]。转基因拟南芥 RT-PCR结果显示, 在正常条
件下, KAT1 和 KAT2 在野生型中表达量较高, 而在
35S::GmAREB 转基因植株中表达量很低; 在 ABA
及干旱胁迫(Dr)条件下, KAT1和KAT2基因在野生型
植株中表达量明显降低。然而, 在正常条件下, ABI1
和ABI2表达量极低或不表达, 由于GmAREB基因的
过表达, 这些基因在 35S::GmAREB 转基因植株中表
达量明显增强。因此, GmAREB基因的过表达能够有
效增强 ABI1和 ABI2基因的表达, 抑制 KAT1和 KAT2
基因表达, 导致转基因拟南芥比野生型气孔关闭较
明显(图 13)。



图 11 转基因拟南芥氧化胁迫处理
Fig. 11 Oxidative stress treatment of transgenic Arabidopsis plants



图 12 转基因植株的叶绿素含量
Fig. 12 Chlorophyll content in the leaves of transgenic plants
3 讨论
研究证实, AREB1 基因的过表达不能充分激活
含有 ABRE 元件的下游基因的表达[27]。对 AREB1


第 6期 高世庆等: 转 GmAREB基因提高拟南芥的干旱、氧化胁迫耐性 989




图 13 干旱(Dr)和脱落酸(ABA)胁迫条件下转基因拟南芥下游
靶基因的 RT-PCR分析
Fig. 13 RT-PCR analysis of downstream targeted-genes in
transgenic Arabidopsis under drought (Dr) and abscisic acid
(ABA) stress conditions

蛋白的氨基酸序列分析发现存在 1个受ABA激活的
42 kD 的 SnRK2 激酶磷酸化 Ser/Thr 位点区域
(R-X-X-S/T)[25]。在本研究中 , 转录激活结果显示 ,
将含有 GmAREB 基因的融合表达载体转入酵母
EGY48菌株中, 在双缺陷型(SD/His–/Leu–)培养基平板
不能够生长, 说明 GmAREB蛋白在酵母体内可能不
能调控其下游基因的表达(结果未显示)。对 GmAREB
蛋白氨基酸序列分析发现了 4 个保守的磷酸化位点
区域(C1、C2、C3 和 C4)(图 1), 因此, 我们推测该
蛋白可能需要磷酸化或去磷酸化等蛋白修饰[13]。转
基因拟南芥下游靶基因表达分析显示, 在 ABA及干
旱胁迫条件下 , GmAREB 基因的过表达导致了
35S::GmAREB转基因植株中下游靶基因的表达趋势
发生明显变化(图 13)。说明 GmAREB蛋白在拟南芥
中可能被磷酸化修饰后产生了蛋白活性, 从而在转
基因拟南芥中能够调控下游基因表达, 具有了转录
激活功能。
在逆境胁迫条件下, 气孔的开闭是植物细胞对
逆境做出的直接反应, 不仅通过调节气孔的大小来
减少水分蒸发、降低蒸腾作用; 同时还能保持较高
的光合效率, 去适应各种不良环境而得以生存。因
此, 气孔开度可以作为用来反映和研究植物抗逆性
的重要参数之一[8]。Kim等[9]、Fujita等[13]和 Yoshida
等[28]对干旱胁迫处理的 AREB1 转基因拟南芥气孔
观察发现大部分处于关闭状态, 而野生型植株气孔
大部分仍处于张开状态。对控制气孔开闭的关键基
因的表达检测发现, KAT1和 KAT2的表达受到抑制,
由此推测可能是由于 AREB1 基因的过表达抑制了
KAT1 和 KAT2 的表达, 从而加速了气孔的关闭, 减
少水分蒸发, 增强转基因拟南芥的抗逆性。本研究
对 ABA 及干旱胁迫处理下的转基因拟南芥保卫细
胞气孔研究发现, GmAREB 基因过表达有效抑制了
转基因拟南芥植株中 KAT1 和 KAT2 基因的表达量,
从而导致 K+通道关闭, 加快了气孔的关闭。GmAREB
过表达转基因拟南芥保卫细胞气孔关闭速度均明显
快于野生型植株, 从而减少了水分的蒸发, 提高了
转基因拟南芥对干旱的胁迫耐性。因此 , 推测
GmAREB 基因的表达可能参与了转基因拟南芥保卫
细胞的信号传导途径, 从而有效调节了气孔保卫细
胞关闭, 增强了转基因拟南芥的耐旱性。
在干旱等逆境胁迫下, 植物体内会产生大量的
活性氧(reactive oxygen species, ROS)。这些活性氧会
对植物细胞产生毒害作用, 从而影响植物的生长发
育, 甚至导致植物死亡[29]。因此, 如何快速、有效地
清除体内产生的各种活性氧产物, 减少其对植物细
胞的毒害作用是植物抗氧化胁迫研究的热点。研究
表明, 除了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶之外, 植物
体还存在许多能够清除植物体内积累的活性氧的内
氧化还原酶系统[30]。在本研究中, 转基因植株与对
照植株的叶片离体浸泡于甲基紫精溶液中, 转基因
植株的叶绿素含量较对照高 , 受氧化胁迫伤害程
度较轻 (图 12)。因此 , 我们初步推测可能是由于
GmAREB基因的表达参与了转基因拟南芥ROS信号
传导途径, 调控了活性氧的内氧化还原酶系统, 从
而有效清除了转基因拟南芥细胞中活性氧的积累 ,
增强了转基因拟南芥的氧化胁迫耐性。
4 结论
从大豆中克隆到 1 个 A 亚族 bZIP 类转录因子
GmAREB基因。该基因编码蛋白与拟南芥 AtABF2、
水稻的 OsTRAB1具有 88.1%的同源性, 并存在较近
的亲缘关系。GmAREB蛋白与 ABRE顺式元件具有
体外结合特异性。在拟南芥中的过表达 GmAREB基
因, 有效调控下游靶基因的表达, 调节了气孔保卫
细胞关闭, 提高了转基因拟南芥对干旱、氧化胁迫
耐性。
References
[1] Liu Q(刘强), Zhao N-M(赵南明), Yamaguchi-Shinozaki K, Shi-
nozaki K. DREB transcription factors to improve plant resistance
in the role. Sci Bull (科学通报), 2000, 45(1): 11–16 (in Chinese)
[2] Yamaguchi-Shinozaki K, Kasuga M, Liu Q, Nakashima K, Sa-
kuma Y, Abe H, Shinwari Z K, Seki M, Shinozaki K. Biological
mechanisms of drought stress response. JIRCAS Work Rep, 2002,
990 作 物 学 报 第 37卷

9: 1–8
[3] Finkelstein R R, Lynch T J. The Arabidopsis abscisic acid re-
sponse gene ABI5 encodes a basic leucine zipper transcription
factor. Plant Cell, 2000, 12: 599–609
[4] Finkelstein R R, Gampala S S, Rock C D. Abscisic acid signaling
in seeds and seedlings. Plant Cell, 2002, 14(suppl): 15–45
[5] Jakoby M, Weisshaar B, Droge-Laser W, Vicente-Carbajosa J,
Tiedemann J, Kroj T, Parcy F. bZIP transcription factors in Arabi-
dopsis. Trends Plant Sci, 2002, 7: 106–111
[6] Foster R, Izawa T, Chua N H. Plant bZIP proteins gather at
ACGT elements. FASEB J, 1994, 8: 192–200
[7] Bray E A. Plant responses to water deficit. Trends Plant Sci, 1997,
2: 48–54
[8] Kang J, Choi H, Kim S Y. Arabidopsis basic leucine zipper pro-
teins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling. Plant
Cell, 2002, 14: 343–357
[9] Kim J B, Kang J Y, Kim S Y. Over-expression of a transcription
factor regulating ABA-responsive gene expression confers multi-
ple stress tolerance. Plant Biotechnol J, 2004, 2: 459–466
[10] Guiltinan M J, Marcotte W R Jr, Quatrano R S. A plant leucine
zipper protein that recognizes an abscisic and response element.
Science, 1990, 250: 267–270
[11] Hobo T, Asada M, Kowyama Y, Hattori T. A bZIP factor, TRAB1,
interacts with VP1 and mediates abscisic acid-induced transcrip-
tion. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 26: 15348–15353
[12] Choi H, Hong J, Kang J, Kim S Y. ABFs, a family of ABA-
responsive element binding factors. J Biol Chem, 2000, 21:
1723–1730
[13] Fujita Y, Fujita M, Satoh R, Maruyama K, Parvez Mohammad M,
Seki M, Keiichiro H, Masaru O T, Shinozaki K, Yamagu-
chi-Shinozaki K. AREB1 is a transcription activator of novel
ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress
tolerance in Arabidopsis. Plant Cell, 2005, 17: 3470–3488
[14] Oeda K, Salinas J, Chua N H. A tobacco bZIP transcription acti-
vator (TAF-1) binds to G-BOX-like motif conserved in plant
genes. EMBO J, 1991, 10: 1793–1802
[15] Kagaya Y, Hobo T, Murata M, Ban A, Hattori T. Abscisic acid—
induced transcription is mediated by phosphorylation of an ab-
scisic acid response element binding factor, TRAB1. Plant Cell,
2002, 14: 3177–3189
[16] Xiang Y, Tang N, Du H, Ye H Y, Xiong L Z H. Characterization
of OsbZIP23 as a key player of the basic leucine zipper transcrip-
tion factor family for conferring abscisic acid sensitivity and sa-
linity and drought tolerance in rice. Plant Physiol, 2008, 148:
1938–1952
[17] Lu G J, Gao C X, Zheng X N, Han B. Identification of OsbZIP72
as a positive regulator of ABA response and drought tolerance in
rice. Planta, 2009, 229: 605–615
[18] Jin X F, Xiong A S, Peng R H, Liu J G, Gao F, Chen J M, Yao Q
H. OsAREB1, an ABRE-binding protein responding to ABA and
glucose, has multiple functions in Arabidopsis. Biochem Mol Biol
Rep, 2010, 43: 34–39
[19] Liao Y, Zou H F, Wei W, Hao Y J, Tian A G, Huang J, Liu Y F,
Zhang J S, Chen S Y. Soybean GmbZIP44, GmbZIP62 and
GmbZIP78 genes function as negative regulator of ABA signal-
ing and confer salt and freezing tolerance in transgenic Arabidop-
sis. Planta, 2008, 228: 225–240
[20] Liao Y, Zhang J S, Chen S Y, Zhang W K. Role of soybean
GmbZIP132 under abscisic acid and salt stresses. J Integr Plant
Biol, 2008, 50: 221–230
[21] Wang L(王磊), Zhao J(赵军), Fan Y-L(范云六). Corn Cat1 gene
the cis-regulatory elements ABRE2 binding protein ABP9 gene
clone and functional analysis. Sci Bull (科学通报), 2002, 15:
1167–1171 (in Chinese)
[22] Casaretto J, Ho T H. The transcription factors HvABI5 and
HvVP1 are require for the abscisic acid induction of gene expres-
sion in barley Aleurone cells. Plant Cell, 2003, 15: 271–284
[23] Hsieh T H, Li C W, Su R C, Cheng C P, Sanjaya, Tsai Y C, Chan
M T. A tomato bZIP transcription factor, SlAREB, is involved in
water deficit and salt stress response. Planta, 2010, 231: 1459–
1473
[24] Satoh R, Fujita Y, Nakashima K, Shinozaki K, Yamaguchi-Shi-
nozaki K. A novel subgroup of bZIP proteins functions as tran-
scriptional activators in hypoosmolarity-responsive expression of
the ProDH gene in Arabidopsis. Plant Cell Physiol, 2004, 45:
309–317
[25] Uno Y, Furihata T, Abe H, Yoshida R, Shinozaki K, Yamaguchi-
Shinozaki K. Arabidopsis basic leucine zipper transcription fac-
tors involved in an abscisic acid-dependent signal transduction
pathway under drought and high-salinity conditions. Proc Natl
Acad Sci USA, 2000, 97: 11632–11637
[26] Kim S, Kang J Y, Cho D I, Park J H, Kim S Y. ABF2, an
ABRE-binding bZIP factor, is an essential component of glucose
signaling and its overexpression affects multiple stress tolerance.
Plant J, 2004, 40: 75–87
[27] Furihata T, Maruyama K, Fujita Y, Umezawa T, Yoshida R,
Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Abscisic acid-dependent
multisite phosphorylation regulates the activity of a transcription
activator AREB1. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 1988–
1993
[28] Yoshida T, Fujita Y, Sayama H, Kidokoro S, Maruyama K, Mizoi
J, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. AREB1, AREB2, and
ABF3 are master transcription factors that cooperatively regulate
ABRE-dependent ABA signaling involved in drought stress
tolerance and require ABA for full activation. Plant J, 2010, 61:
672–685
[29] Maxwell D P, Wang Y, McIntosh L. The alternative oxidase
lowers mitochondrial reactive oxygen production in plant cells.
Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 8271–8276
[30] Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, Van Breusegem F. Reac-
tive oxygen gene network of plants. Trends Plant Sci, 2004, 9:
490–498