全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(8): 1475−1479 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A111); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项; 国家自然科学基金项目
(30700508)
作者简介: 孙啸(1980–), 女, 硕士研究生, 作物分子遗传育种专业。
*
通讯作者(Corresponding authors): 陈明, E-mail: chenming@mail.caas.net.cn; 马有志, E-mail: mayzh@mail.caas.net.cn
Received(收稿日期): 2007-12-21; Accepted(接受日期): 2008-03-27.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01475
大豆抗逆基因 GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析
孙 啸1,2 董建辉3 陈 明1,* 徐兆师1 叶兴国1 李连城1 曲延英2
马有志1,*
(1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京
100081; 2新疆农业大学农学院, 新疆乌鲁木齐 830052; 3西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100)
摘 要: GmDREB3基因能提高转基因烟草和拟南芥的抗逆性。利用 SiteFinding-PCR技术, 从大豆品种铁丰 8号基因
组中分离到大豆抗逆基因 GmDREB3启动子片段, 长度 1 648 bp。该片段富含 A/T碱基, 还含有 TATA-box、低温响
应元件 MYC及其他顺式元件 MYB、CAAT-box等。将该启动子分区段与 GUS报告基因连接构建表达载体, 利用基
因枪法转化小麦愈伤组织, 并进行干旱、高盐、低温等处理, 通过组织化学染色和 GUS 荧光定量测定分析各区段调
控元件的活性。结果表明, 在干旱和低温的诱导下, 该启动子能激活下游 GUS基因的表达, 在–285 ~ –1 117区域存
在与低温和干旱应答有关的重要调控元件, 在–1 464 ~ –1 648区域内存在抑制启动子活性的调控元件。由此推断, 在
逆境条件下通过启动子区域正、负调控元件的共同作用, 使 GmDREB3基因的表达维持在一个恰当的水平。
关键词: 干旱应答元件结合蛋白质; 启动子; 顺式作用元件; 瞬时表达
Isolation and Regulative Region Analysis of Promoter of Stress-Related
Gene GmDREB3 from Soybean
SUN Xiao1,2, DONG Jian-Hu3, CHEN Ming1,*, XU Zhao-Shi1, YE Xing-Guo1, LI Lian-Cheng1,
QU Yan-Ying2, and MA You-Zhi1,*
(1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Genetic and Breeding, Ministry of Agriculture
/ Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University,
Urumqi 830052, Xinjiang; 3 College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China)
Abstract: In order to analyze transcriptional regulative mechanism of GmDREB3 gene, the GmDREB3 promoter (1 648 bp) was
isolated from soybean genome using SiteFinding-PCR method. The sequences is abundant in A/T base and predicted to contain a
lot of putative cis-element, such as low-temperature responsive element (MYC), dehydration responsive element (MYB), ABA
responsive element (ABRE), and so on, as well as TATA-box in biological database. To identify the key promoter regulative re-
gion controlling gene expression, GmDREB3 promoter was truncated according to the prediction of putative cis-element and in-
serted into the site upstream of GUS reporter gene. Then, vectors containing different length GmDREB3 promoters were trans-
ferred into wheat callus by particle bombardment, and after different stress treatments, function of these putative cis-elements was
analyzed by identifying activation of GUS using histochemistry staining and GUS fluorescence intensity analysis. The results
indicated that the promoters between –285 and –1 648 bp (relative to the translational start site) activated expression of GUS re-
port gene under drought and low temperature stresses. But only the promoter region between –285 and –1 117 bp could activate
expression of maximal GUS gene in wheat callus. Another promoter region between –1 117 and –1 464 bp weakened the ability
for activating expression of GUS gene under drought and low-temperature stress conditions. Thus, it was suggested that there are
some positive regulating motif between –285 and –1 117 bp and negative regulating motif between –1 117 and –1 464 bp of
GmDREB3 promoter. As a result, the expression of GmDREB3 gene can be kept in an appropriate level response to various
stresses through the regulation of both positive and negative regulating motifs.
1476 作 物 学 报 第 34卷

Keywords: Dehydration responsive element binding protein; Promoter; Cis–element; Transient expression
干旱、低温和高盐等非生物胁迫是影响植物生长和
发育的主要限制因素。在长期的进化过程中, 植物体内形
成了一系列逆境应答机制。干旱应答元件结合蛋白质
(dehydration responsive element binding protein, DREB)是
一类重要的信号转导转录因子 , 能特异性结合启动子中
的DRE/CRT顺式作用元件, 激活相关逆境诱导基因的表
达, 提高作物的抗逆性[1-2]。自Liu等[1]首次从拟南芥中克
隆到DREB基因, 并发现该类基因的过表达可以有效提高
转基因植物的抗逆性以来, DREB基因的克隆、功能鉴定
及其作用机制等已经成为目前植物抗逆基因工程的研究
热点。
启动子序列位于基因的上游, 决定转录起始位点和
频率。大部分启动子不仅含有TATA-box, 还存在一些特异
性的顺式作用元件。这些顺式元件与调节蛋白质的协同作
用, 对于调控下游基因的表达具有重要的意义[3]。研究启
动子的调控分子机制有助于理解复杂的基因调控网络。目
前 , 关于启动子的研究主要集中在其克隆及关键顺式作
用元件的鉴定, 而对于DREB基因表达调控特征的报道不
多。
我们从大豆品种铁丰 8号中分离到编码转录因子基因
GmDREB3(DQ208969), 其过量表达可以显著提高转基因
烟草或拟南芥对干旱和高盐胁迫的抗性(另文报道)。本研
究根据GmDREB3 基因的DNA序列 , 利用 SiteFinding-
PCR技术[4-6]从铁丰 8 号基因组中分离到该基因的启动子
片段GmDp3。为了研究其功能, 将获得的全长片段及其 5′
端连续缺失片段与GUS报告基因相连 , 构建植物表达载
体并转化小麦愈伤组织 , 分析启动子不同区段对低温和
干旱等逆境胁迫的应答反应。研究发现, 在启动子–285 ~
–1 117 bp区域可能存在与低温和干旱应答有关的正调控
元件, 在–1 464 ~ –1 648 bp区域内可能存在抑制启动子活
性的负调控元件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 大肠杆菌 DH5α, 植物表达载体
pBI121 和小麦品种兰考 906 由本实验室保存。大豆品种
铁丰 8 号由中国农业科学院作物科学研究所大豆资源与
分子遗传实验室提供。
1.1.2 试验试剂及 PCR 限制性内切酶和 Taq DNA聚
合酶购自 Promega公司, DNA片段凝胶回收试剂盒和测序
载体 pMD18-T购自TaKaRa公司, 质粒提取试剂盒购自法
特捷生物技术公司。PCR 引物由上海生物工程公司合成,
在 PTC-200型 PCR仪上进行扩增反应。PCR产物测序工
作由本所测序部完成。
1.2 大豆总基因组 DNA的提取
取大豆品种铁丰 8 号叶和茎, 采用CTAB法提取总
DNA[7]作为克隆GmDREB3启动子片段的模板。
1.3 启动子 GmDp3的克隆
采用Tan等[4]的SiteFinding-PCR扩增方法, 用 3 轮嵌
套反应程序。在第一轮反应中, 利用一个单一循环反应使
SiteFinder-1 (SF1)和SiteFinder-2(SF2)与模板DNA退火 ,
反应程序为 92℃ 2 min, 95℃ 1 min, 25℃梯度增加到 68℃
3 min以上, 68℃ 10 min; 在随后的第二、三轮反应中, 采
用 3′端基因组特异引物DWp1 和DWp2 与 5′端引物SFP1
和SFP2, 完成目标DNA序列的扩增, 反应程序为 94℃ 1
min; (95℃ 10 s, 65℃ 6 min, 30个循环; 72℃ 5 min。为了
排除单引物扩增产物的干扰, 在第三轮反应中, 除了使用
双向引物进行反应 , 同时增加了单引物扩增单元作为比
较。反应产物连接到pMD18-T载体上进行测序。3′端特异
引 物 DWp1 为 5′-CCACGTAAGCAGAACATTGCCGC
GCGTCGAA-3′, DWp2 为 5′-GATCCCAACCAAATCCTC
TGACGGCTGTT-3′; 5′端引物SF1、SF2、SFP1和SFP2信
息参考Tan等[4]的报道。
1.4 GmDp3启动子 5′端连续缺失植物表达载体构建
启动子片段从 5′端开始截取, 利用 PCR 技术分别得
到 1 648、1 464、1 117和 285 bp 4个片段。将这 4个片
段替换植物特异性表达载体 pBI121 中的 35S 启动子, 使
每个片段分别与载体中 GUS 报告基因相连以构建载体,
由于 pBI121载体上只有 Hind III和 Sma I两个酶切位点可
用, 而 GmDp3启动子–1 117 ~ –285 bp区段含有 1个 Hind
III 位点, 因此我们通过设计–285 启动子 5′端引物引入
Bam H I位点, 这样–285 bp启动子区段用 Hind III和 Sma
I 位点替换 35S 启动子, 然后扩增其他启动子区段采用 Bam
H I和 Sma I位点替换–285启动子区段, 从而构建各启动子
缺失载体。Dp1648::GUS、Dp1464::GUS、Dp1117::GUS 和
Dp285::GUS 4个植物表达载体结构见图 1。
1.5 小麦成熟胚愈伤组织的培养及基因枪转化
将小麦成熟种子消毒后 , 接种于SD2愈伤组织诱导
培养基上。25℃培养 1~2周后, 将愈伤组织移至高渗培养
基(SD2培养基添加 0.2 mmol L−1甘露醇和 0.2 mmol L−1的
山梨醇)处理 4~8 h, 分别用上述不同的植物表达载体及
pBI121 载体质粒DNA包裹直径 1.0 μmol L−1金粉, 采用
PDS-1000/He基因枪(Bio-Red公司生产), 轰击愈伤组织[8]。
1.6 GUS基因表达检测
将转化后的小麦愈伤组织分别转移到普通SD2培养
基上, 或分别含有 100 μmol L−1 ABA、2% PEG、200 mmol
L−1 NaCl SD2培养基上。将接种在普通SD2培养基上的转
基因愈伤组织置 4℃冰箱中, 其他愈伤组织置于 25℃培养
第 8期 孙 啸等: 大豆抗逆基因 GmDREB3启动子的克隆及调控区段分析 1477




图 1 GmDp3启动子 5′端连续缺失片段融合 GUS报告基因表达载体 GmDp3::GUS示意图
Fig. 1 Map of GmDp3 promoter 5′successive promoter truncations fragment fused to GUS reporter:GmDp3::GUS

箱内, 处理后恢复培养 4 d。然后, 进行组织化学染色和荧
光定量分析。取出部分愈伤组织于离心管中, 加入X-Gluc
染色液 37℃保温过夜, 次日观察愈伤组织中蓝色区域的
分布情况[9]。将剩余愈伤组织在研钵中用液氮研磨成粉末
状, 加入提取缓冲液(含 50 mmol L–1 磷酸钠, 10 mmol L−1
EDTA, 0.1% TritonX-100, 1% Sarcosyl, 10 mmol L−1 β-巯
基乙醇), 混匀, 300 × g离心 10 min后取上清液得到GUS蛋
白粗提液。取出部分加 5 mmol L−1的GUS反应底物 4-MUG,
37℃保温 30 min后, 加 0.2 mmol L−1 Na2CO3反应终止液
终止反应。利用日立 850 型荧光分光光度计测定荧光值,
激发光 365 nm, 发射光 455 nm。用Perkin Elmer Lambda
35 UV/VIS分光光度计测定GUS蛋白含量 , 激发光 595
nm。以 1 min水解 4-MUG生成 1 nmol L−1 4-MU的所需酶
量为一个酶活力单位 , 以每毫克蛋白的酶活力表示GUS
活性[10]。各启动子在各种处理条件下的活性用相应条件
下测定的GUS活性与相应条件下阳性对照(pBI121)测定
的GUS活性的比值来表示(相对GUS活性)。
2 结果与分析
2.1 GmDp3启动子片段的获得
利用上述 PCR方法, 经过两轮扩增, 获得长约 1.9 kb
的 DNA 片段。在第三轮反应中设计的仅由单引物 SFP2
或 DWp2 进行的 PCR 反应则没有相同或者类似的结果,
说明该片段为双引物扩增产物 , 排除了单引物扩增的可
能性(图 2)。将得到的大片段回收、测序, 结果显示, 该
DNA片段长 1 921 bp, 排除与已知 GmD32基因序列重叠
部分, 实际获得启动子区域片段 1 648 bp。该序列富含
A/T(含量 70.7%), 是植物启动子序列的主要特征之一。



图 2 SiteFinding-PCR方法在第三轮反应中扩增出 GmDp3片段
Fig.2 GmDp3 fragment amplified in third reaction cycle of the
SiteFinding-PCR
2.2 序列分析
通过生物数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)
等对获得的启动子序列进行分析, 结果表明, GmDp3启动
子含有 6 种元件(图 3), 分别是TATA-box(RNA聚合酶II结
合的位点[11])、CAAT-box(可能与转录起始频率有关, 是真
核生物基因启动子典型元件之一[12])、MYC元件(参与低温
和脱水反应, 是与低温调节有关的转录因子ICE1 等的识
别位点[13-14])、ABRE元件(与ABA应答有关[15])、MYB元
件 (在拟南芥基因中发现的与脱水应答有关的顺



图 3 GmDp3启动子 DNA序列及分析
Fig. 3 Sequence analysis of soybean DREB promoter GmDp3
1478 作 物 学 报 第 34卷

式作用元件[13-14])、其他与光、热应答有关的顺式作用元
件, 以及GARE等功能未知的元件。
2.3 瞬时表达结果
图 4表明, 转化植物表达载体pBI121的愈伤组织在 4
种处理条件下都可以被X-Gluc溶液染成蓝色 , 说明该载
体中的GUS报告基因能够被CaMV35S组成型启动子激活
表达。在 2%PEG的诱导下 , 转化了Dp1648::GUS、
Dp1464::GUS和Dp1117::GUS的愈伤组织呈现蓝色, 且转
化有Dp1117::GUS载体的愈伤组织染色程度较深。在 4℃
低温条件处理下, 只有转化Dp1117::GUS的愈伤组织显蓝,
其他愈伤组织没有变化。100 μmol L−1ABA、200 mmol L−1
NaCl 的处理不能诱导GmDp3::GUS任何转化载体中GUS
基因的表达。



图 4 小麦愈伤组织转化 GmDp3 启动子 5′端连续缺失片段表达载
体的 GUS组织染色结果
Fig. 4 GUS histochemistry staining of wheat callus transformed by
the plant vector of GmDp3 promoter successive deletion fragment
fused to GUS reporter gene

图 5表明, 在 100 μmol L−1 ABA 和 200 mmol L−1
NaCl 处理下, 相对GUS活性没有变化。在 4℃处理下, 转
化Dp285::GUS的愈伤组织没有反应 , 转化Dp1117::GUS
的愈伤组织相对GUS活性显著上升 , 随着启动子片段延
长 , 转化Dp1464::GUS和Dp1648:: GUS载体的愈伤组织
相对GUS活性逐渐下降。在 2% PEG条件下, 只有转化
Dp1117::GUS的愈伤组织相对GUS活性上升, 其他片段没
有反应。



图 5 小麦愈伤组织转化 GmDp3 启动子 5′端连续缺失片段表达载
体 4 d后相对 GUS活性
Fig. 5 Relative GUS activity analysis of wheat callus transformed
by the plant vector with GmDp3 promoter successive deletion frag-
ment fused to GUS reporter gene
根据 GUS 染色及荧光定量分析结果, 可以推测在启
动子的–285 ~ –1 117 bp区域内存在着在低温和干旱条件
下能增强启动子活性的重要顺式元件 , 它们与某些蛋白
质的结合能够提高 GUS报告基因的表达活性; 在–1 117 ~
–1 464 bp区域内可能存在对启动子活性起负调控的顺式
元件 , 由于这些元件的参与 , 使得启动子的激活作用减
弱。尽管启动子区域也存在 ABRE 元件, 但 GUS 染色及
荧光定量分析结果均表明该启动子对 ABA 没有应答
反应。.
3 讨论
GmDREB3是我们从大豆品种铁丰 8号基因组中分离
到的编码DREB转录因子的基因, 能够被低温和干旱胁迫
诱导表达, 其过表达增强植物对干旱、高盐、低温等胁迫
的抗性(另文发表)。长度为 1 648 bp的GmDREB3基因启
动子片段能被干旱和低温诱导, 激活GUS基因的表达。该
启动子存在 9个MYC元件(CANNTG), 该元件是与低温应
答有关的MYC-like bHLH蛋白的潜在结合位点[16]。Daniel
等 [17]对拟南芥应答低温胁迫的CBF2/DREBC基因启动子
的研究 , 发现了能与MYC-like bHLH蛋白结合的顺式作
用元件 ICEr1 和 ICEr2, 其中 ICEr1 的核心序列为
CACATG。Imura等[16]又进一步根据这个核心序列, 利用
酵母单杂技术筛选出能与之特异性结合的MYC–like
bHLH蛋白。我们推测, GmDp3 启动子片段携带的MYC
元件可能对低温应答具有重要作用, 但是, MYC-box具有
多种形式, 哪一种更为关键, 尚需要进一步的研究。
序列分析发现, 顺式元件如MYC元件等主要集中在
–285 ~ –1 117 bp和–1 464 ~ –1 648 bp两个区域内。–285 ~
–1 117 bp启动子片段在低温和干旱的诱导下激活作用最
强。当启动子缺失片段延伸至–1 464 bp和–1 648 bp时, 其
表达量开始降低 , 甚至其表达量不足使细胞在染色液中
呈蓝色。推测在–285 ~ –1 117 bp区域内可能存在着能大幅
度提高基因的表达量的调控元件; 在–1 117 ~ –1 464 bp区
域内, 可能存在负调控元件, 与上调控元件具有竞争性作
用 , 共同调控下游基因的表达。在番茄多聚半乳糖醛酸
(PG)基因 1.4 kb启动子的研究中也发现类似现象, 在该启
动子的–806 ~ –443 bp区域内有一个正调控区, 负责PG基
因在果皮细胞中的表达; 而–1 411 ~ –1 150 bp区段存在一
个负调控区, 负责对基因在内果皮中转录的抑制。因此,
认为PG基因表达调控可能是通过–806 ~ –443 bp内的正
调控区与–1 411 ~ –1 150 bp内的负调控区的相互作用完
成的[18]。说明在一个启动子中可能同时存在正、负两种
调控机制 , 使其下游基因能在恰当的时期得到恰当的表
达, 启动子GmDp3 也可能具有这样的分子机制, 但仍需
其他相关研究的进一步证实。
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