全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(8): 1468−1473 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由农业公益性行业科研专项(nyhyzx07-018-03)和中国农业科学院杰出人才科研启动经费资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈信波, E-mail: chenxinbo@hotmail.com; Tel: 0731-8998533
第一作者联系方式: E-mail: winner188397@163.com
Received(收稿日期): 2008-11-13; Accepted(接受日期): 2009-03-20.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01468
亚麻木质素合成关键酶基因表达分析
王 进 1 陈信波 1,2,* 高 原 2 张彦红 1 龙松华 1 邓 欣 1 何东锋 2
王玉富 1
1 中国农业科学院麻类研究所 / 农业部麻类遗传改良与工程微生物重点实验室, 湖南长沙 410205; 2 湖南农业大学作物基因工程湖南
省重点实验室, 湖南长沙 410128
摘 要: 以亚麻(Linum usitatissimum)栽培品种白花为材料, 采用半定量 RT-PCR 方法对亚麻木质素合成关键酶基因
CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、F5H2 和 F5H3 在不同组织及不同时期木质部、韧皮部的表达规律进行
了研究。结果显示, 除 F5H1在根部未表达外, 其他基因在幼苗、根、花期木质部、花期韧皮部、叶、花和幼果中均
有不同程度表达。CCoAOMT1在各部位都有较高的表达。2个 4CL之间和 3个 F5H基因之间的部位表达的差异存在
一定互补性。在韧皮部中, 各基因均在幼嫩(30 d)阶段表达量最低; 除 4CL2在花期(60 d)达到表达高峰外, 其他基因
均在花后(70 d)表达量最高; 4CL1在各时期均有较强表达, 而 F5H3在各时期弱表达。在木质部中, 除 4CL1在各时期
均表达弱和 F5H1在花前期为表达高峰外, 其余基因均在幼嫩阶段表达量最高; 随后逐渐降低, 在花期后表达量大幅
降低; 4CL1的表达量明显区别于其他基因, 其各时期韧皮部的表达量明显高于木质部。
关键词: 亚麻; 木质素; 基因表达; 半定量 RT-PCR
Expression of Critical Lignin Metabolism Genes in Flax (Linum usitatissimum)
WANG Jin1, CHEN Xin-Bo1,2,*, GAO Yuan2, ZHANG Yan-Hong1, LONG Song-Hua1, DENG Xin1, HE
Dong-Feng2, and WANG Yu-Fu1
1 Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic Improvement & Engineering Microbiology for
Bast Fiber Crops, Ministry of Agriculture, Changsha 410205, China; 2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Hunan Agricul-
tural University, Changsha 410128, China
Abstract: Flax (Linum usitatissimum) is an important bast fiber crop. High lignin content in the flax fiber greatly affects the per-
formance and quality in the flax textile industry. CCoAOMT1, 4CL1, 4CL2, COMT, F5H1, F5H2, and F5H3 are putative genes
coding the key enzymes involved in lignin accumulation. The expression patterns of these genes were analyzed by
semi-quantitative RT-PCR in different flax tissues and in xylem and phloem (bark) at different development stages of the variety
Baihua. The results revealed that all genes were detected to express in seedlings, roots, florescent xylem, florescent phloem, leaves,
flowers, and young fruits excluding F5H1 in roots. Expression of CCoAOMT1 was consistently high in all the tissues detected.
There existed complementary expression between two 4CL genes and among the three F5H genes in various tissues. In the
phloem, all genes lowly expressed except for 4CL2 at florescence and highly expressed after flowering. The expression of 4CL1
was high, and that of F5H3 was low in the phloem at all stages compared with that of other genes. In the xylem, expression of
4CL1 gene was low at all the developing stages, that of F5H1 reached a peak before flowering and that of the other genes in the
xylem reached the highest at 30 d after emergence of seedlings and gradually declined at late growing stages, with a sharp de-
crease to very lower level after flowering. The expression of 4CL1compared with other genes was significantly higher in phloem
than in xylem.
Keywords: Flax; Lignin; Gene expression; Semi-quantitative RT-PCR
亚麻是一种重要的纤维作物, 亚麻纤维具有拉 力强、柔软、细度好等特点, 成为优良的纺织原料。
第 8期 王 进等: 亚麻木质素合成关键酶基因表达分析

1469


木质素是植物体内重要的大分子物质, 是由苯丙烷
衍生物经羟基化、甲基化形成的单体聚合起来的酚
类多聚体, 广泛存在于维管植物中[1]。在纺织业、造
纸业等工业生产中, 木质素是造成纤维加工废弃物
污染, 影响纤维品质的重要因素。因此阐明木质素
代谢过程中各功能基因的表达及调控规律, 利用基
因工程手段培育低木质素、环保型纤维作物和造纸
用木材已经成为当前的研究热点。
木质素合成途径中由十余种酶催化 [2]。
CCoAOMT (咖啡酰辅酶 A-O-甲基转移酶)是一类 S-
腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)甲基转移酶, 以咖啡酰辅酶
A为底物将 S-腺苷-L-甲硫氨酸上的甲基基团转移到
木质素单体的苯环碳 3 位置上 , 形成阿魏酰辅酶
A[3]。F5H (阿魏酸-5-羟基化酶)是与细胞色素 P450
相连的单氧酶 [4], 优先催化的底物是松柏醛和松柏
醇生成 5-羟基松柏醛和 5-羟基松柏醇[5]。COMT(咖
啡酸-3-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶)优先催化 5-羟基
松柏醛和 5-羟基松柏醇生成芥子醛和芥子醇 [6]。
4CL(4-香豆酸辅酶 A 连接酶)催化肉桂酸生成相应
CoA 酯, 实际是对将被还原的基团进行活化[2]。近
年来, 通过基因工程手段调控 CCoAOMT、F5H、
COMT及 4CL活性降低木质素含量、改变木质素组
分取得了可喜的成果。关于木质素代谢关键酶基因
的研究以模式植物水稻、拟南芥和以木质部为主的
木本植物杨树的研究为多, 针对以韧皮收获部位的
植物的研究较少。目前, CCoAOMT、4CL、F5H 和
COMT的表达规律在烟草[7]、水稻[8]、拟南芥[9-10]等
植物中已有报道。亚麻生长周期短, 木质部、韧皮
部易分离, 因此亚麻适合作为木质素代谢、调控以
及木质素合成相关功能基因研究的模式植物, 并且
对木质素代谢关键酶的研究能为创造适合我国国情
的环保型低木质素亚麻奠定基础。
本实验在已有亚麻木质素合成途径中关键酶基
因片段克隆基础上[11], 利用半定量 PCR 方法, 分析
CCoAOMT1、F5H1、F5H2、F5H3、COMT、4CL1
及 4CL2 基因在亚麻不同组织部位及不同时期木质
部和韧皮部的表达规律, 为进一步探索其在亚麻木
质素生物合成中的功能与表达调控, 通过基因工程
手段创造环保型低木质素亚麻品种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其处理方法
亚麻品种白花由农业部麻类资源沅江野外科学
观察实验站提供, 春季(3月上旬)播种试验品种, 生
育期间实施正常水肥管理。以幼苗(出苗10 d完整植
株, 包括根、茎和叶)、花期(出苗60 d左右)根、花期
叶、花(整个花器官)、幼果及60 d (花期)韧皮部和木
质部作为不同部位的分析材料; 以出苗30 d (幼嫩)、
50 d (花前)、60 d (花期)、70 d (花后)韧皮部(包括表
皮、韧皮层、以及纤维束)和木质部(剥取韧皮部后
部分)作为不同发育时期的分析材料。在这些时期取
距离基部2 cm和距离顶端2 cm之间的主干中部约为
10 cm区段的幼嫩木质部以及韧皮部, 其他时期取
距离基部10 cm和距离顶端10 cm之间的主干中部为
50~60 cm区段的木质部和韧皮部。将取回样品放在
−80℃备用。
1.2 总 RNA提取、定量与完整性检测
取从5个完整植株剥离的冻存样品进行研磨 ,
用TRNzo l (TIANGEN)试剂提取全部研磨样品的总
RNA以减少取样误差。用核酸分析仪(BECKMAN
COULTER: DU800)测260 nm和280 nm处的吸光值,
以A260/A280比值估计总RNA的纯度, 以A260的值进行
总RNA定量。以1.2%普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA
完整性。
1.3 第一链 cDNA的合成
取等量不同器官的总RNA, 用MMLV Reverse
Transcriptase RNase H-(TOYOBO)合成第一链。反转
录体系为5×buffer 4 μL, dNTP 2 μL, Oligo(dT) 1 μL,
RNase inhibor 0.5 μL, Total RNA 2 µL, Reversrace 1
μL, DEPC水9.5 μL。42℃保温20 min后99℃失活5
min, 4℃ 5 min后瞬时离心。
1.4 引物设计
根据公布的亚麻基因 4CL1、4CL2、COMT、
F5H1、F5H2、F5H3 片段及 CCoAOMT1 全长片段
和内参亚麻 Actin序列利用 primer3设计引物(表 1)。
1.5 RT-PCR扩增及数据分析
合适的循环数不仅能使扩增产物在琼脂糖凝胶
上清晰可见和定量, 也可使扩增在到达平台期前的
线形范围内进行。试验中从 28个循环开始, 依次设
定 28、31、34个循环进行扩增反应。PCR 产物在
1.5%琼脂糖凝胶中电泳后 , 鉴定其亮度和特异性 ,
确定适宜的循环次数。PCR程序为 95℃预变性 5 min;
94℃变性 1 min, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 循
环次数 28~34; 最后 72℃延伸 5 min。取等体积的
PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳后 EB 染色, 紫外
灯观察照相, 并进行 3 次重复。以凝胶定量分析软
1470 作 物 学 报 第 35卷

表1 引物序列及PCR扩增基因片段
Table 1 Primer sequences and the amplified fragments
基因名称
Gene name
登录号
Accession No.
引物序列
Primer sequences (5–3)
扩增产物长度
Fragment size (bp)
CCoAOMT1

EU926495

F: TCGGCGTCTACACGGGTTACTCC
R: TGTTGTCGTACCCGATCACTC
315

4CL1

EF214737

F: CCGTTGGGGAAGGAACTCGAAGAC
R: CCACCCTTGCTGGTCTATCGTTCTT
315

4CL2

EF214738

F: GGGATACGGAATGACAGAGG
R: CGGTGTGTAACCACCCTTGTTTGTC
263

COMT

EF214736

F: TATCCAAGCACCCTTCCATT
R: GTTCCTCGTCGCCAGGCTCGTGT
281

F5H1

EF214745

F: CGTCGGAGAGCTTATTTTCA
R: AGCTTTGATGTTGTCCTTGG
400

F5H2

EF214746

F: CCACCAAGATGAATGACCAG
R: TGTAGTGGTGGTGGAGTCAGCTGC
320

F5H3

EF214747

F: CGCTGGCCGGGCGTTGAACG
R: ATGTCGGAGATAGGATCGTC
321

Actin AY857865

F: CGACTGCTGAAGGGAAATTGT
R: CTGCTGGAAGGTGCTGAGGGAA
458
F表示上游引物, R表示下游引物。F and R stand for forward primer and reverse primer.

件Bandscan对电泳图进行条带密度扫描, 分别获得
不同部位以及茎不同时期各基因的条带整合光密度
值(integrated optical density, IOD)。并计算其平均相
对光密度值。计算各目的基因的相对表达量, 目的
条带IOD/同组actin IOD即为目的基因的相对表达
量。计算3次重复的平均值及标准偏差。
2 结果与分析
2.1 RNA纯度鉴定及循环数的确定
不同组织以及茎木质部、韧皮部不同时期的总
RNA琼脂糖凝胶电泳表明, 28S和18S条带清晰可见,
无明显降解; A260/A280比值皆在1.8~2.2之间, 可用于
下一步实验。
利用相应引物对亚麻7个木质素合成关键酶基
因以及内参基因进行不同循环数的扩增, 结果表明,
各目的基因在25、28和31个循环的基因产量呈线性
增加, 未到反应平台期, 并且28个循环扩增条带清
晰可见, 差异明显。因此本实验采用28个循环。
2.2 CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、
F5H2和 F5H3在不同组织中的表达
半定量RT-PCR结果显示(图1和图2), CCoAOMT1
在各部位均有较高水平的表达。4CL1和 4CL2在不
同组织表达规律不同, 除花期韧皮部和叶之外, 其
他组织只有一个 4CL 高表达, 另一个表达量极低,
例如, 在幼苗中 4CL1 表达量远高于 4CL2, 在根中
4CL2 表达量远高于 4CL1, 表明 2 个基因的表达有
部位特异性。COMT 在根、花期木质部和叶中表达
量最高, 在幼苗中表达量极低。F5H基因家族中的 3
个成员表达也较低 , 且表现出部位特异性 , F5H1
在花期韧皮部高表达, 在根部未表达, F5H2 在根部
和花期木质部高表达, F5H3在各组织的表达水平均
较低。

图1 亚麻不同组织中CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、
F5H2和F5H3基因RT-PCR产物电泳图
Fig. 1 Gel electrophoresis result of CCoAOMT1, 4CL1, 4CL2,
COMT, F5H1, F5H2, and F5H3 genes RT-PCR products
from different flax tissues
1: 幼苗; 2; 根; 3: 花期韧皮部; 4: 花期木质部; 5: 叶; 6: 花;
7: 幼果。
1: seedling; 2: root; 3: phloem at florescence; 4: xylem at flores-
cence; 5: leaf; 6: flower; 7: young fruit.

2.3 CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、
F5H2 和 F5H3 在韧皮部和木质部不同时期的表
达
选择 4 个发育时期对亚麻韧皮部和木质部
CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、F5H2
和 F5H3 基因的表达特征进行分析。大约在亚麻出
苗后 30 d的幼嫩时期, 木质部以及韧皮部发育成型
恰好能分离, 茎开始加速伸长生长; 大约在出现花
蕾前 1~2 d的花前期, 即出苗后 50 d左右, 植株由营
养生长开始转为生殖生长; 大约在出苗后 60 d左右
的花期, 植株完全转为生殖生长; 大约在亚麻出苗
第 8期 王 进等: 亚麻木质素合成关键酶基因表达分析

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图 2 亚麻不同组织 CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、F5H2和 F5H3基因相对表达量
Fig. 2 Relative gene expression level of CCoAOMT1, 4CL1, 4CL2, COMT, F5H1, F5H2, and F5H in different tissues of flax
S: 幼苗; R: 根; FP: 花期韧皮部; FX: 花期木质部; L: 叶; F: 花; YF: 幼果。
S: seedling; R: root; FP: phloem at florescence; FX: xylem at florescence; L: leaf; F: flower; YF: young fruit.

后 70 d 左右的花后期, 亚麻开始进入衰老期, 随后
茎开始变黄。(图 3和图 4)表明各基因在韧皮部和木
质部不同时期的表达量高低不同。在韧皮部中, 各
基因均在幼嫩(30 d)阶段表达量最低; 除 4CL2在花
期(60 d)出现表达高峰外, 其他基因均在花后(70 d)
表达量最高; 其他时期表达量较低, 有随着发育进
程表达逐步增强的趋势; 4CL1 和 CCoAOMT1 在韧
皮部各时期表达量均较高, F5H3在韧皮部各个时期
均低表达。在木质部中, 除 4CL1在各时期均表达弱
和 F5H1 在花前期为表达高峰外, 各基因均在幼嫩
阶段表达量最高; 随后逐渐降低, 在花后(70 d)时期

图 3 亚麻韧皮部及木质部不同时期 CCoAOMT1、4CL1、4CL2、
COMT、F5H1、F5H2和 F5H3基因 RT-PCR产物电泳图
Fig. 3 Gel electrophoresis result of CCoAOMT1, 4CL1, 4CL2,
COMT, F5H1, F5H2, and F5H3 gene RT-PCR products
from flax phloem and xylem at different stages
1: 出苗后 30 d韧皮部 ; 2: 出苗后 50 d韧皮部 ; 3: 出苗后 60 d
韧皮部 ; 4: 出苗后 70 d 韧皮部 ; 5: 出苗后 30 d 木质部 ; 6: 出
苗后 50 d木质部 ; 7: 出苗后 60 d木质部 ; 8: 出苗后 70 d木质
部。
1: 30 d phloem; 2: 50 d phloem; 3: 60 d phloem; 4: 70 d phloem;
5: 3 0 d xylem; 6: 50 d xylem; 7: 60 d xylem; 8: 70 d xylem.

表达量大幅降低; 与其他基因的明显区别在于各时期
4CL1韧皮部的表达量明显高于木质部。F5H3在韧皮
部各时期以及花期和花后木质部表达量极其微弱, 因
此推测 F5H3主要参与木质部早期木质素合成。
3 讨论
CCoAOMT、F5H、COMT 以及 4CL 是调控木
质素合成的关键酶 [2], 在多数植物中均存在多基因
现象, 并且在不同植物中基因成员数及各部位表达
量也有所不同 [9-13]。Fellenberg 等 [9]利用实时定量
PCR 对拟南芥 At1g67990、At4g34050、At4g24735
和 At1g67980 四个 CCoAOMT 编码基因表达分析表
明, 除 At1g67990外其他基因均在花序、花芽、花、
果实、叶、茎、根和种子中表达且表达量不同 ,
At1g67990只在花序、花芽和花中表达。Martz等[7]
对烟草的 4种 CCoAOMT进行半定量表达分析发现,
正常的叶只有一种 CCoAOMT 表达, 用烟草花叶病
毒(TMV)侵染后 4种基因均在叶中表达 ; 微管组织
中 4 种基因的表达量高于茎尖以及茎基部。Kumar
等[12]研究表明, 树莓(Rubus idaeus) 3个 4CL编码基
因在根、叶、芽、花和果实中均表达, 并且表达量
各不同, 并且三者在花和果实不同时期表达量均有
所变化。Ma 等[13]检测到 COMT 在小麦的根、茎、
叶中都表达。Ruegger 等[10]发现在拟南芥中 F5H 在
根、茎、叶、花、果和种子中均表达, 并且在叶和
种子不同时期表达量不同。
1472 作 物 学 报 第 35卷


图 4 不同时期亚麻韧皮部和木质部 CCoAOMT1、4CL1、4CL2、COMT、F5H1、F5H2和 F5H3基因相对表达量
Fig. 4 Relative gene expression level of CCoAOMT1, 4CL1, 4CL2, COMT, F5H1, F5H2,
and F5H3 gene at different stages in phloem and xylem of flax
图中±后数据为 3次重复之间标准偏差。Data in the figure after ± are the standard deviation of three repeats.

本实验发现, 7个基因中除 F5H1外均在亚麻各
部位表达。2个 4CL和 3个 F5H基因的表达规律表
明亚麻中同一基因家族不同成员之间在不同组织也
存在与其他植物类似的表达差异[7,9,12]。鉴于木质素
代谢在病害防卫和植株支撑方面的作用, 选择对韧
皮部特异或强表达的基因家族成员进行抑制调控 ,
可能达到既特异降低韧皮部木质素含量不明显影响
正常植株生长的效果。
在韧皮部发育早期, 各基因表达量较低随着植
株发育表达量逐渐升高。在木质部多数基因在幼嫩
时期表达量最高随后逐渐降低, F5H1在花前期表达
量达到高峰, 4CL1在木质部不同时期表达量变化不
大。因而我们推测韧皮部木质素积累主要集中于后
期, 而木质部木质素主要在早期积累。Day 等[14]也
证实亚麻从开花期到种子成熟期, 顶端茎以及基部
韧皮部木质素都有较高增长, 其中基部种子成熟期
木质素含量大约为开花期的 2 倍; 木质部从开花期
到种子成熟期木质素增长量较少, 在顶端木质部木
质素含量甚至有所下降。
纤维中木质素的含量极为重要, 木质素含量高
纤维偏硬脆, 可纺性和服用性能差。因此, 纺织化学
加工处理要尽可能地去除木质素, 而由于木质素的
去除难度较其他成分大, 导致脱胶成本高和污染大,
因此利用基因工程手段抑制木质素合成关键酶有广
第 8期 王 进等: 亚麻木质素合成关键酶基因表达分析

1473


阔的应用前景。然而亚麻易倒伏, 同时降低木质部
韧皮部木质素含量可能大大影响其抗倒性。本实验
发现 4CL1 在韧皮部各时期表达量均较高, 并且在
木质部各时期低表达, 因此理论上抑制 4CL1 不仅
能大大减少韧皮部中木质素含量, 而且不至于过分
影响亚麻的抗倒性。目前研究表明, 抑制 4CL 不仅
能大大降低木质素含量[15-18], 还能造成纤维素含量
上升[15], 4CL被抑制的转基因植株木质素易脱去。因
此, 利用 4CL1 调控亚麻木质素含量将有广阔的应
用前景。
4 结论
除 F5H1外, CCoAOMT1、F5H2、F5H3、COMT、
4CL1及 4CL2在幼苗、根、花期木质部、花期韧皮
部、叶、花和幼果中均有表达但存在明显表达量差
异。同一基因家族不同成员之间在不同组织的存在
一定表达特异性和互补性。亚麻的木质素合成关键
酶基因表达量在韧皮部多数在幼嫩阶段最低, 随着
植株发育逐渐增长在花后阶段最高; 而在木质部多
数在幼嫩阶段最高, 花后阶段最低。4CL1各个时期
的表达量均以韧皮部高于木质部。
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