全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(9): 1563−1568 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973计划): 油菜籽油脂形成的分子生物学机制及其代谢调控(2006CB101600)
作者简介: 肖钢(1978−), 男, 博士研究生, 从事油菜遗传育种研究。0731-4617941, E-mail: sanjian123@tom.com
*
通讯作者(Corresponding author): 官春云(1938–), 男, 教授, 主要从事油菜遗传育种研究。E-mail:guancy2000@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2007-12-04; Accepted(接受日期): 2008-02-10.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01563
甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析
肖 钢 1,2 张宏军 1,2 彭 琪 1 官春云 1,2,*
(1 湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室, 湖南长沙 410128; 2 湖南农业大学油料作物研究所 / 国家油料作物改良中心湖南
分中心, 湖南长沙 410128)
摘 要: 以甘蓝型油菜湘油 15为材料, 随机挑选 56个来自基因组的 fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的 fad2基因
cDNA 克隆和 9 个授粉 27 d 后种子中 fad2 cDNA 克隆进行双向测序。基因组中 56 个 fad2 序列的碱基同源性为
91.0%~99.9%, 从中得到 11 个差异序列, 即 11 个不同的 fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编
码区中出现多个终止密码子, 另外 5个的同源性为 90.60%~99.74%, 与 47个来自幼苗整株的 fad2基因 cDNA序列进
行比较, 发现 fad2基因没有内含子。从种子中的 9个 fad2 cDNA克隆序列中找到 2个有差异的 cDNA, 它们的编码
区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个 fad2 基因表达。基因组中的 11 个拷贝根据同源性可分成两组, 命名为
fad2I和 fad2II。RT-PCR分析发现在授粉 27 d的种子中 fad2I有较强表达, fad2II没有表达; 但在叶片中两者都有表达。
关键词: 甘蓝型油菜; 油酸脱氢酶基因; 基因拷贝数; 序列差异引物
Screening and Analysis of Mutiple Copy of Oleate Desaturase Gene (fad2)
in Brassica napus
XIAO Gang1,2, ZHANG Hong-Jun1,2, PENG Qi1, and GUAN Chun-Yun1,2,*
(1 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan; 2 Oil Crops Research Insti-
tute, Hunan Agricultural University / Hunan Branch of National Oil Crops Improvement Center, Changsha 410128, Hunan, China)
Abstract: Rapeseed oil is primarily composed of palmitic, stearic, oleic, linoleic and linolenic fatty acids. Delta-12 desaturase
(FAD2) in plants converts oleic acid (18:1) to linoleic acid (18:2) by inserting a double bond at the delta-12 position. Fatty acid
desaturase-2 gene (fad2) encodes delta-12 desaturase that functions in the endoplasmic reticulum. Fifty-six fad2 DNA clones and
nine fad2 seed cDNA clones of B. napus cv. Xiangyou 15 were randomly selected and sequenced in this study. These 56 DNA
sequences share 91.0−99.9% identity in nucleotides. Through combination of identical sequences, 11 different sequences were
found, of which each represented various copy of fad2 gene. Deduced amino acid sequences revealed that many stop codons oc-
curred in the coding region of six copies, the other five copies shared 90.60−99.74% amino-acid identity. Two differential cDNA
were found from nine fad2 seed cDNA sequence, no stop codons in the coding region, revealing that more than one fad2 gene
express in developing seeds, and oleic acid content is controlled by multigene. The eleven copies in genome could be divided into
two groups based on their homology, and designated as fad2I and fad2II, respectively. RT-PCR analysis in seeds at twenty-seven
days after pollination showed that fad2I expressed strongly in seeds, and no expression of fad2II was found, but both of them ex-
pressed in leaves.
Keywords: Brassica napus; Oleate desaturase; Gene copy number; Sequence-specific primer
油酸因其具有高营养和保健价值而备受育种家
们的关注[1], 20多年来, 对油酸含量调控机理进行了
大量研究, 发现 fad2基因是控制植物种子油酸含量
的关键基因[2-4]。在一些作物中, fad2 基因是以多拷
贝形式存在的, 而且不同的 fad2 基因拷贝具有不同
的表达模式, 如向日葵的基因组中存在 3 个 fad2 基
因拷贝, 其中 1个特异的在种子中高表达, 而另外 2
个在不同组织中都有表达, Martinez-Rivas等[5]认为前
1564 作 物 学 报 第 34卷

者可能控制存储脂脱饱和, 与种子油酸含量直接相关,
而后两者与膜脂脱饱和有关。Mikkilineni 等[6]研究表
明, 在玉米植株中存在 3 个 fad2 功能基因, 其中 2
个在胚中表达, 另 1个在其他组织中表达, Northern
杂交发现胚中的 fad2基因在授粉后 14 d 时表达量
最高。在大豆和橄榄等的基因组中也发现不同的
fad2基因拷贝具有不同的表达模式[7-9]。
甘蓝型油菜(B. napus)是异源四倍体, 是白菜(B.
rapa, A基因组)与甘蓝(B. oleracea, C基因组)通过自
然杂交和染色体组自然加倍后形成的[10], 其染色体
组型为 AACC。Scheffler 等[11]通过 Southern 杂交方
法证明甘蓝型油菜基因组中存在 8~12 个 fad2 基因
拷贝。本研究以我国广泛栽培的甘蓝型油菜湘油 15
为材料, 采用 PCR 克隆产物测序方法在全基因组中
和种子反转录产物中研究了 fad2 基因多拷贝情况,
并进行了分类和 RT-PCR分析, 以期进一步了解 fad2
基因的调控机理, 为油菜高油酸育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
甘蓝型油菜品种湘油 15 的自交种由湖南农业
大学油料作物研究所提供, 种植在湖南农业大学油
料作物研究所的试验田。湘油 15的脂肪酸组成为棕
榈酸(C16:0)4.2%, 硬脂酸(C18:0)1.6%, 油酸(C18:1)
62.1%, 亚油酸 (C18:2)21.1%, 亚麻酸 (C18:3)8.4%,
芥酸(C20:1)0.2%(数据由湖南农业大学油料作物研
究所提供)。
1.2 方法
1.2.1 DNA、RNA的提取及 cDNA的合成 采用
CTAB 法(参照文献[12], 稍作修改)提取发芽 7 d 的
单株小苗总 DNA, 用普通琼脂糖电泳检测质量。以
授粉后 27 d、剥去种皮的种子和发芽 7 d的单株小
苗为材料, 参照 Plant total RNA试剂盒(安比奥公司)
说明书, 提取总 RNA。用普通琼脂糖电泳检测完整
性, 核酸蛋白分析仪测定总 RNA浓度。参照 cDNA
synthesis 试剂盒 (东洋纺公司 )说明书 , 取 600 ng
RNA进行 cDNA的合成, 反应总体积为 20 μL。
1.2.2 fad2基因的克隆 根据 GenBank公布的甘
蓝型油菜 fad2基因mRNA序列, 设计 fad2基因特异
引物, 正向引物 P1为 5′-ATGGGTGCAGGTGGAAG
AATGCAAG-3′, 反向引物 P2为 5′-ACTTATTGTTG
TACCAGAACACACC-3′。利用 P1、P2从总 DNA、
种子和叶子RNA反转录产物中扩增 fad2基因, 反应
体系含 cDNA模板 5 μL或 DNA模板 1 μL、引物 0.2
mmol L−1、pfu DNA聚合酶(北京鼎国) 2 U, 总体积
50 μL。反应程序为 94℃预变性 4 min, 94℃变性 40 s,
57℃退火 40 s, 72℃延伸 2 min, 共 31个循环。PCR
产物经纯化试剂盒(长沙安比奥)纯化后与 pGM-T平
末端 DNA 片段加 A 克隆载体 (QiaGen 公司)连接,
转化大肠杆菌菌株 DH5α。经阳性鉴定后随机挑选
56 个基因组 fad2 克隆和 47 个幼苗整株、9 个种子
fad2 cDNA 克隆送往上海英骏生物技术公司和上海
博亚生物技术公司进行双向测序。
1.2.3 fad2 基因碱基序列的分析 通过 DNAStar
软件拼接测序结果。运用 DNAMAN6.0 软件对 56
个基因组 fad2 序列进行比对分析 , 同时通过
http://us.expasy.org/tools/dna.html 的 DNA 序列翻译
工具, 将这些拷贝的核苷酸序列翻译成氨基酸序列
进行分析。
1.2.4 设计序列差异引物进行 RT-PCR 分析 基
因组 fad2 基因序列可被分成差异明显的两组, 分别
命名为 fad2I 和 fad2II, 这两组在第 40 bp 处有一连
续 6 bp 的明显差异, 根据这一差异, 设计了序列差
异引物, P5 为 5′-AAGTGTCTCCTCCCTCCAAGAA
G-3′; P6 为 5′-AAGTGTCTCCTCCCTCCAGCTC-3′
和共同的下游引物 P2。序列差异引物对保存有不同
fad2拷贝的细菌质粒进行 PCR扩增, 检测它们能否
区分这两组拷贝。以 β-actin基因为内参基因(其正向
引物为 5-GACATTCAACCTCTTGTTTGCG-3, 反
向引物为 5-CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3,
产物长度 580 bp), 利用序列差异引物对授粉后 27 d
的种子及成熟植株叶片进行 RT-PCR 检测, 以检测
这两组拷贝在种子及叶片中是否具有不同的表达模
式。上述 PCR反应体系含 cDNA模板 5 μL、引物 0.2
mmol L−1、Taq DNA聚合酶(长沙安比奥) 2.5 U, 总体
积 50 μL。反应程序为 94℃预变性 4 min, 94℃变性
40 s, 57℃退火 40 s, 72℃延伸 80 s, 共 31个循环。
2 结果与分析
2.1 fad2基因克隆序列的分析
fad2 引物 P1 从起始密码子 ATG 开始, 考虑到
所设计的两条引物的 Tm值应接近, P2从终止密码子
倒数第 6 个碱基开始 , 其扩增产物理论上是不含
5UTR和 3UTR fad2较完整的ORF。克隆得到的 fad2
序列长度在 1 150 bp左右, 与NCBI上公布的甘蓝型
油菜 fad2基因序列(AF243045, AY5777313, AY592975)
第 9期 肖 钢等: 甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析 1565


的同源性大于 90%, 说明克隆得到了湘油 15的 fad2
基因。
比较 47个 fad2 cDNA序列和 56个基因组 fad2
序列, 发现除有个别的碱基差异外, fad2 cDNA序列
与基因组 fad2序列一致, 说明甘蓝型油菜 fad2基因
不存在内含子, 这与熊兴华[13]的研究结论相同。56
个基因组 fad2序列同源性为 91.0%~99.9%。对这些
序列进一步分析表明, 在这 56个序列中存在两类碱
基差异。⑴ 随机差异, 即那些只在一个序列中出现
的碱基差异, 如图 1中第 1行第 952 bp的 T, 第 2行
第 961 bp处的 C碱基。PCR和测序过程中都可能产
生随机错误, 在进行序列合并时, 随机错误参照其
他序列在该处的碱基进行纠正, 如第 952 bp 处的 T
纠正为 C; 961 bp处的 C纠正为 T。⑵ 固定差异, 即
那些在多个序列同一位置上固定、重复出现的碱基
差异, 如图 2中第 940、943、964、973、977、989、
991、1 003、1 006和 1 027 bp处的碱基差异。这些
固定差异反映的是 fad2基因不同拷贝之间的真实差
异。另外, 在测序过程中存在出错热点, 如 DNA 序
列存在复杂二级结构、GC含量高和存在 A、T连续
结构等地方。经分析这 56个序列出现固定差异的位
置都不是上述出错热点。

图 1 差异碱基
Fig. 1 Differential base pairs
第 952 bp处除了第 1个序列是 T外, 其他所有序列都是 C。第 962 bp处第 2个序列是 C, 其他序列该处都是 T;
其他位置的碱基差异则是重复、固定地在不同序列中出现。
At the position 949 bp, the first sequence is T, other sequences are C, and at the position 958 bp, the sceond sequence is C, other sequences
are T. Differential nucleotides at other position are consistently present in all sequences.

除去随机误差后, 得到了 11类有明显碱基差异
的序列。同一类序列中, 最多的有 9个完全相同的克
隆序列, 最少的也有 3个。合并完全相同的序列, 得
到 11个差异序列(图 2)。将这 11个序列按 6种读码
框进行翻译, 发现其中 6 个序列不论以何种读码框进
行翻译, 在其编码区中都存在多个终止密码子, 导
致翻译提前终止。这 6个序列可能无生物学功能。而
另外 5个序列则在编码区中没有终止密码子。6个提
前终止翻译的拷贝的氨基酸序列如图 3 所示, 终止
密码子出现的地方用“Z”表示。
对这 11个 DNA序列和 5个在编码区中没有终止
密码子的氨基酸序列进行进一步的分析, 从它们的
同源树状图(图4, 图5)上发现, 这些序列被分成两组,
命名为 fad2I和 fad2II。fad2I组内有 fad2I-1、fad2I-2、
fad2I-3、fad2I-4 和 fad2I-5 共 5 个拷贝, fad2II 组内
有 fad2II-1、fad2II-2、fad2II-3、fad2II-4、fad2II-5
和 fad2II-6共6个拷贝。两组之间的碱基同源性为 90%,
氨基酸序列同源性为 91%, 但在同组内部序列碱基
同源性高达 96%以上。在 fad2I组拷贝的氨基酸序列
同源性为 99.74%, 它们之间只有 3处差异, 其中 fad2I-1
与 fad2I-5氨基酸序列一致。这 3处差异分别是第 19
残基处苏氨酸和天冬酰氨的互换, 第240残基处酪氨
酸与苯丙氨酸的互换, 第 245残基处丙氨酸与缬氨酸
的互换。
DNAMAN6.0 将来自种子的 9 个 fad2 cDNA 克
隆序列分成两类, 一类中有 5 个完全相同的克隆序列,
1566 作 物 学 报 第 34卷


图 2 11个 fad2拷贝
Fig. 2 Eleven copies of fad2
在第 40 bp处的连续 6个碱基的差异可以将这 11个拷贝分为明显的两组。
A continuous six-base-difference starting at the nucleotide forty divides these eleven copies into two groups clearly.

图 3 6个提前终止翻译的 fad2拷贝的氨基酸序列比较
Fig. 3 Comparison of the deduced amino acid sequences of six fad2 copies which will preterminate translation
圆点表示该处氨基酸残基缺失; 序列中存在的多个翻译终止处, 以“Z”表示; 黑色区域氨基酸残基完全一致, 灰色区域表示同源性较高。
Dots mean absences of residual. Stopping translation points are represented by “Z”. Identical and similar residues are shown on a background of black and grey.

另一类中有 4个, 合并相同序列得到 2个差异序列。
按前面的分类标准, 它们都属于 fad2I 组, 其编码区
都没有终止密码子。一个序列与 fad2I-2 在 DNA 序
列上只有一个碱基的差异, 氨基酸序列一致。另一
个与 fad2I-1同源性最高, DNA序列同源性为 99.30%,
氨基酸序列同源性为 98.43%。该结果证明甘蓝型油
菜油酸性状受多基因控制。
2.2 fad2基因的 RT-PCR分析
图 6显示序列差异引物对 P5、P2和 P6、P2能
够特异性地区分 fad2I和 fad2II。对湘油 15授粉 27 d
后的种子和成熟叶片进行RT-PCR分析(图7)表明, fad2I

图 4 5个油酸脱氢酶的氨基酸序列同源性比较
Fig. 4 Homology analysis of five FAD2s
第 9期 肖 钢等: 甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析 1567



图 5 fad2基因 11个拷贝碱基序列同源性比较
Fig. 5 Homology analysis of eleven fad2s
和 fad2II 具有不同表达模式 , 结果显示在种子中
fad2I 有表达, 而 fad2II 没有表达, 但在叶片中两者
都有较强的表达。说明 fad2基因在种子和叶片组织
中的调控模式不同, fad2I 和 fad2II 在叶片中都参与
油酸脱饱和, 而在种子中只有 fad2I参与。
3 讨论
3.1 以 PCR 产物测序发现基因多拷贝差异的可
行性
物种在进化过程中由于基因的扩增、染色体的
重复经常导致某些基因多拷贝现象[14], 这些拷贝之
间可能序列完全一致, 也可能有差异。利用 Southern
杂交和荧光定量 PCR可以估计某个基因在基因组中
的拷贝数目[15], 而大规模对该基因 PCR产物克隆进
行测序, 则可以发现这些拷贝之间的序列差异。
PCR 扩增和测序过程中会随机产生碱基错误
(pfu DNA聚合酶在每个 PCR循环中有 2.2×10−8错
配率, DNA测序准确率为 98.5%)。要得到一个基因
(或 DNA片段)准确的碱基信息, 首先要排除这些随

图 6 序列差异引物对 11个 fad2拷贝的特异性扩增
Fig. 6 Specific amplification of eleven fad2 gene copies using sequence-specific primers
1−6: fad2II; 7−11: fad2I; M: 100 bp DNA ladder.


图 7 fad2I和 fad2II在种子和叶片中的 RT-PCR分析
Fig. 7 RT-PCR analysis of fad2I and fad2II in seeds and leaves
1, 3: fad2II; 2, 4: fad2I.

机误差。挑选 PCR 产物的多个克隆进行重复测序,
综合比较测序结果可以得到该基因较真实的序列信
息。如果该基因在基因组内是以多个拷贝存在的(拷
贝之间有一定的碱基差异), 在利用保守区设计的引
物进行 PCR扩增时, 其 PCR产物和克隆产物将会是
这些多个拷贝的混合。挑选一定数量的克隆进行测
序, 保证每个拷贝被多次测序, 综合比较测序结果,
消除随机误差, 可以发现不同拷贝之间的碱基差异,
合并相同序列后得到的就是该基因不同拷贝的真实
序列信息。本研究对湘油 15的 56个 fad2克隆进行
测序发现了 11个不同的拷贝, 进行更大规模的测序
可能会发现更多的拷贝。
3.2 fad2I组与 fad2II组
RT-PCR分析证明 fad2I和 fad2II在甘蓝型油菜
中具有不同的表达模式。Schierholt等[16]报道, 有两
个基因位点影响甘蓝型油菜种子油酸含量, HO1 主
要在种子中表达; 另一个位点 HO2不仅在种子中影
响油酸含量, 同时也在叶片和根系中表达。本研究
中的 fad2I 可能与其 HO2 相对应, 而 fad2II 只在叶
子中表达与其 HO1主要在种子中表达则不同。fad2I
组与 fad2II 组与甘蓝型油菜的 A、C 基因组是否对
应, 是否在芸薹属其他种中也有不同表达模式, 有
待深入研究。为了深入了解其内在关系, 我们正在
1568 作 物 学 报 第 34卷

进行 A、C基因组 fad2基因的克隆测序和表达模式
分析。
3.2 fad2基因多拷贝在油菜高油酸育种中的意义
本实验室多年进行甘蓝型油菜田间试验发现 ,
如果种子油酸含量达到 85%左右, 控制油酸的基因
除了 1 个主基因外, 还有 3 个或更多的微效多基因
(尚未发表)。本研究中发现的这些 fad2 基因在调控
油酸脱氢过程中是否具有等同的效应, 还是有主效
基因和微效基因之分, 仍有待进一步研究。禹山林
等 [17]在花生中研究发现种子高油酸(80%左右)性状
由两对隐性基因(ol1ol1ol2ol2)控制。多基因控制的性
状比单基因控制的性状遗传规律更复杂, 这可能是
多年来甘蓝型油菜高油酸育种进展缓慢的原因。
根据 fad2 基因家族各拷贝间的序列保守区, 采
用 RNAi 技术, 特异地在种子里抑制所有 fad2 基因
的表达, 这样可避开多拷贝难题。Stoutjesdijk 等[18]
和陈苇等[19]利用 RNAi技术成功地抑制了 fad2基因
的表达, 得到油酸含量显著提高且能稳定遗传的后
代材料。这些成功的实例为高油酸油菜育种提供了
新的思路。
4 结论
甘蓝型油菜基因组中 fad2基因是以多拷贝形式
存在的, 且不含内含子。不同拷贝之间在碱基序列、
氨基酸序列上有一定的差异。根据其碱基序列上的
差异, 这些拷贝可被分成 fad2I和 fad2II两类。fad2I
和 fad2II 在不同组织中具有不同的表达模式。甘蓝
型油菜种子中存在多个 fad2 基因的表达, 说明其油
酸性状受多基因控制。

致谢: 栒感谢李 教授、刘忠松教授、邬贤梦教授和
张振乾博士对本文的修改提出的宝贵意见。
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