全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(11): 21172121 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08012-001)和山东省农业科学院博士科研启动基金项目资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 路兴波, E-mail: luxb99@sina.com, Tel: 0531-83179095; 赵蕾, E-mail: zhaolei@sdu.edu.cn, Tel:
0531-88177190
第一作者联系方式: E-mail: yuanlei428@126.com, Tel: 0535-6925066
Received(收稿日期): 2011-04-01; Accepted(接受日期): 2011-07-15; Published online(网络出版日期): 2011-09-06.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110906.1105.019.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.02117
以实时荧光定量 PCR技术检测转基因玉米MON88017
袁 磊 1,2 孙红炜 1 李 凡 1 李 宁 1,3 赵 蕾 3,* 路兴波 1,*
1 山东省农业科学院植物保护研究所 / 山东省植物病毒学重点实验室, 山东济南 250100; 2山东商务职业学院食品工程系, 山东烟台
264670; 3山东师范大学生命科学学院, 山东济南 250014
摘 要: 根据转基因玉米 MON88017 的左侧侧翼序列和玉米内标基因(zSSIIb)分别设计特异性引物及 Taqman 探针,
通过实时荧光 PCR技术建立 MON88017的定量特异性检测方法。利用含有内标基因和侧翼序列的标准质粒分子, 建
立了玉米内标基因和侧翼序列的标准曲线。检测了 5个已知 MON88017含量(0.01%、0.05%、0.10%、0.50%和 1.00%)
的混合样品中的转基因含量, 结果表明检测底限可以达到 19~30个阳性拷贝。该研究建立的实时荧光定量 PCR技术
灵敏度高、特异性强。
关键词: 转基因生物; 实时荧光定量 PCR; MON88017; 标准分子
Detection of Genetically Modified Maize MON88017 by Quantitative Real-
time PCR
YUAN Lei1,2, SUN Hong-Wei1, LI Fan1, LI Ning1,3, ZHAO Lei3,*, and LU Xing-Bo1,*
1 Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Ji’nan 250100, China; 2 Department of Food Engineering, Shandong
Business Institute, Yantai 264670, China; 3 College of Life Science, Shandong Normal University, Ji’nan 250014, China
Abstract: Transgenic event-specific primers and Taqman probes based on the left-flanking sequence of MON88017 and endoge-
nous gene (zSSIIb) were designed, and a real-time PCR method was developed to quantitatively detect the event-specific geneti-
cally modified maize. The reference molecule composed of endogenous gene and flanking sequence of MON88017 was con-
structed artificially. Two standard curves of the reference gene sequence and the 5 flanking sequence were established. We de-
tected five mixed samples, and their genetically modified contents of MON88017 were 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, and 1%, re-
spectively. The lowest detection limit was 19–30 copies. This study indicated that the Taqman probes real-time PCR is highly
specific and sensitive.
Keywords: Genetically modified organism; Real-time PCR; MON88017 event; Reference molecule
近年来, 大量的转基因作物相继在美国、欧盟、加拿
大、日本等国家和地区被批准, 种植面积迅速扩大, 转基
因产品的生物安全性以及转基因生物对人类健康和生态
环境可能的潜在危害已引起各国政府和民众的普遍关注,
出现了一系列涉及转基因生物及其产品的案件和纠纷。各
国相继出台了相关的转基因标识管理法规[1-3]。我国也加
强了对转基因商品的管理措施, 并在 2002 年开始实施了
转基因产品的标识制度[4]。因此, 作为转基因产品实施标
签制度的重要技术支持的检测技术显得尤为重要。实时荧
光定量 PCR 技术, 通过对 PCR反应过程中荧光信号的积
累进行实时检测, 能很好地测得反应初始 DNA 的含量。
另外该技术无需对 PCR 产物进行后期处理, 避免了交叉
污染, 克服了以往 PCR 技术中存在的假阳性污染和不能
准确定量的缺点 , 提高了检测速度以及检测的准确性和
灵敏度, 在转基因检测领域的应用越来越广泛[5]。
美国 Monsanto 公司通过农杆菌介导转化方法, 将质
粒载体 PV-ZMIR39上的目的基因转到玉米Hi-II细胞中获
得转基因玉米 MON88017。质粒载体 PV-ZMIR39 含有
cry3Bb1和 cp4 epsps两个基因表达盒。cry3Bb1基因来源
于 Bacillus thuringiensis subsp. kumamotoensis strain
EG4691, 编码 Cry3Bb1 蛋白, 具有抗玉米切根叶甲的功
能[6]; cp4 epsps基因来源于农杆菌 CP4菌株, 其表达产物
2118 作 物 学 报 第 37卷

为 CP4 EPSPS 蛋白(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶),
由于 CP4 EPSPS 对草甘膦不敏感, 可以完成植物所需的
芳香族氨基酸的新陈代谢 , 因此具有抗草甘膦类除草剂
的功能[7]。对 MON88017的分子生物学分析表明, 只有单
一拷贝的 cp4 epsps 和 cry3Bb1 基因表达盒被整合到
MON88017 的基因组中的单一位点上; 各种表达元素完
好无损; 没有任何细菌质粒骨架序列插入 MON88017 基
因组[8]。
本研究根据基因组步移法和巢式 PCR 方法 , 在
MON88017插入位点的 5端得到 504 bp的旁侧序列[9], 以
此设计转化体特异性定量引物和探针 , 并将转化体特异
性片段序列(87 bp)和玉米内标准基因(zSSIIb)特异性序列
(88 bp)通过人工合成, 构建到质粒 pUC57 中作为标准分
子。通过实时定量 PCR 制作内标基因和 5端侧翼序列标
准曲线, 以此为基础检测玉米混合样品中 MON88017 成
分的含量。
1 材料与方法
1.1 试验材料
MON88017转基因成分含量分别为 1%、0.5%、0.1%、
0.05%、0.01% (W/W)的混合玉米由农业部提供, 非转基因
对照玉米为郑单 958。含有 MON88017转化体特异性片段
序列(87 bp)和玉米内标准基因(zSSII)特异性序列(88 bp)
的 pUC57质粒由上海生工生物工程有限公司构建。
1.2 试剂及仪器设备
蛋白胨、酵母粉等培养基试剂购自济南普朗特生物
公司; DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自杭州博日科
技有限公司。Premix Ex Taq (Perfect Real Time) 购自大连
宝生物工程有限公司。引物及探针由上海尚博生物公司合
成。选用 ABI Prism 7000定量 PCR仪(美国 ABI公司); 紫
外分光光度计、台式冷冻离心机(美国 Beckman 公司);
BIO-RAD PCR扩增仪(美国伯乐公司); GDS800凝胶成像
系统(美国 UVP公司); 生物安全柜(新加坡 ESCO公司)。
1.3 基因组 DNA及质粒的提取
称取 100 mg研磨后的样品, 按照试剂盒说明书提取
基因组 DNA。以电泳及紫外分光光度计检测 DNA溶液浓
度及纯度。质粒参考试剂盒说明书提取。用紫外分光光度
计测定其 OD值, 计算拷贝数。
1.4 标准曲线制作
将已知浓度的标准分子经系列稀释, 制备成不同浓
度的标准品, 稀释液为 TaKaRa 公司的 TB 溶液。首先将
已知浓度的标准分子溶液稀释成 1.0×1013 拷贝 μL1, 取
100 μL上述标准分子溶液加入 900 μL TB溶液稀释, 充分
混匀, 再次取其混合液 100 μL加入 900 μL TB溶液稀释,
充分混匀, 其他浓度依次等比稀释。稀释后的标准分子浓
度分别为 1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102 拷
贝 μL1, 每个浓度重复 4次, 分别以内标准基因和特异性
序列引物及探针进行实时定量 PCR 反应, 以拷贝数的自
然对数值为横坐标, 以 Ct 值(荧光值达到指定阈值时的循
环次数)为纵坐标, 绘制内标准基因和特异性序列标准曲
线, 并求解回归方程。实时荧光定量 PCR 所用的内标准
基因及特异性序列引物及探针见表 1。
反应体系(50 μL)含 2×Premix Ex Taq 25 μL, forward
primer (10 μmol L1) 2 μL, reverse primer (10 μmol L1) 2
μL, TaqMan probe (10 μmol L1) 2 μL, 50×ROX Reference
Dye 1 μL, DNA模板 2 μL, ddH2O 16 μL。扩增反应条件为
95℃预变性 30 s; 95℃变性 5 s, 60℃退火/延伸 30 s; 共计
40个循环。
1.5 待测样品 MON88017转基因成分含量测定
分别以内标准基因和特异性序列进行 5 个待测样品
实时荧光定量 PCR 反应, 根据标准曲线检测得到 5 个含
量不同的待测样品 Ct 值, 分别计算出内标准基因和侧翼序
列的拷贝数, 根据以下公式计算出待测样品中 MON88017
成分含量。
转基因成分含量计算公式为转基因 Mon88017含量=
外源期刊拷贝数/内标准基因拷贝数×100%。
2 结果与分析
2.1 DNA提取质量
电泳检测及紫外分光光度计测定结果表明, 提取的
DNA完整性很好, OD260/OD280接近 1.8, 符合定量 PCR检
测要求。
2.2 标准曲线的建立
2.2.1 内标准基因 zSSIIb的定量标准曲线 图 1是不同
稀释度下的标准分子中玉米内标准基因 zSSIIb 的扩增曲
线, 扩增效率为 108%, 图 2 是玉米内标准基因 zSSIIb

表 1 实时荧光定量 PCR扩增所用引物和探针
Table 1 Primer pairs and TaqMan probes used in real-time quantitative PCR
名称
Name
引物⁄探针序列
Primer/probe sequence (5–3)
扩增片段长度
Fragment size (bp)
Forward: CGGTGGATGCTAAGGCTGATG
Reverse: AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC
内参照基因
zSSIIb
Probe: FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA
88
Reverse: GCTCTCCTCCAACACATCAT
Forward: GGACATGAAGCCATTTACAATTGA
MON88017转化体特异性序列
MON88017 event specific sequence
Probe: FAM-ATATCGTCACCGTCATACTCCGGCAA–TAMRA
87

第 11期 袁 磊等: 以实时荧光定量 PCR技术检测转基因玉米 MON88017 2119




图 1 标准分子 zSSIIb基因扩增曲线
Fig. 1 Amplification curve of zSSIIb gene by standard molecule



图 2 zSSIIb基因标准曲线
Fig. 2 Quantitative standard curve of zSSIIb gene
的标准曲线, 平均 Ct 值的变化范围在 21.95~34.53 之间,
标准偏差在 0.15~0.44 之间, 变异系数在 0.51%~1.39%之
间。该标准曲线的回归方程为 y = 3.150x + 41.6166, R2 =
0.9976, 式中 x为质粒标准品拷贝数的以 10为底的对数值,
y为 Ct值, R2为线性相关系数。
2.2.2 MON88017 5′端侧翼序列标准曲线 图 3 是不
同稀释度下的标准分子中 MON88017 特异性序列的扩增
曲线, 扩增效率为 108%, 图 4 是 MON88017 特异性序列
的标准曲线, 平均 Ct 值的变化范围在 22.44~35.31 之间,
标准偏差在 0.01~0.19 之间, 变异系数在 0.02%~0.74%。
该标准曲线的回归方程为 y = 3.1499x+41.9555, R2=
0.9991。
由此可见以上两条标准曲线斜率相近, 扩增效率良
好, 标准偏差和相对标准偏差都在可接受范围之内, 且回



图 3 标准分子 MON88017特异性序列扩增曲线
Fig. 3 Amplification curve of MON88017 specific sequence by standard molecule
2120 作 物 学 报 第 37卷



图 4 MON88017特异性序列标准曲线
Fig. 4 Standard curve of MON88017 specific sequence

归方程的相关系数均达到 0.999 以上, 适合用作定量检测
标准曲线。
2.3 混合样品中转基因玉米 MON88017含量测定
本实验检测了 5 个已知不同转基因含量(0.01%、
0.05%、0.1%、0.5%、1%)的玉米混合样品中 MON88017
的含量。根据建立的标准曲线, 计算混合样品中转基因玉
米的含量(表 2)。由表 2可见, 本实验建立起的MON88017
的 TaqMan 荧光实时定量 PCR 检测体系能有效检测不同
含量的转基因玉米, 标准偏差在 0.01~0.11 之间, 变异系
数在 7.27%~16.67%之间, 能较好地满足对转基因作物的
检测要求。同时由表 2可以看出根据标准分子建立的标准
曲线, 最少可以检测到 19~30个拷贝的特异性序列。
3 讨论
本实验采用质粒标准分子进行定量 PCR 检测, 与应
用标准物质进行定量分析相比更方便、准确。目前实时荧
光定量 PCR 均采用外标定量, 需要已知浓度的检测物作
为参照样品, 例如, 欧盟参考物和测量研究所(IRMM)核
准的参照标准(CRMs)。现在已有 CRMs 的转基因作物还
不多, 参照标准品的制备费时、费力、成本高, 由于基质
效应和加工过程中完整 DNA分子的缺失等使得 CRMs作
为定量标准品应用时具有很大的局限性[10]。而质粒标准
分子可以通过微生物进行大量培养, DNA易于扩增, 因此
可提供无限稳定量的标准物质, 并且纯度较高; 易于操作,
稳定性高 , 同一个标准分子可以同时包含多个外源目的
基因, 经济又高效。在转基因定量 PCR检测过程中, 根据
分子量大小与植物基因组 DNA 分子换算阳性质粒分子,
取代植物 DNA作为定量分析的标准。
从本实验可以看出, 通过定量 PCR 反应得到的转基
因成分含量的数值与平均数差别较小, 表现卓越, 但与玉
米混合时所确定的含量(期望值)差异偏大, 其原因可能是:
(1)在玉米混合样品粉碎混匀的过程中有基质效应及仪器
操作等误差; (2)在 DNA 提取过程中, 不同样品之间有提
取效率的差异; (3)质粒分子与植物 DNA的 PCR反应效率
不同。

表 2 定量检测混合样品中 MON88017含量
Table 2 Quantitative detection results of the content of MON88017 in mixed samples
转基因样品含量
Genetically modified
content of the sample
(%)
重复次数
Replicate
内标准基因
拷贝数
Copies of en-
dogenous gene
(zSSIIb)
侧翼序列拷贝数
Copies of
left-flanking
sequences of
MON88017
实测转基因含量
Measured
content of
MON88017 (%)
平均含量
Average content
of the measured
(%)
标准偏差
SD
变异系数
CV
(%)
1 382074 5396 1.41
2 389301 5739 1.47 1.50 0.11 7.33
1.00
3 303554 4960 1.63
1 379739 1935 0.51
2 397132 2319 0.58 0.55 0.04 7.27
0.50
3 423705 2334 0.55
1 357821 552 0.15
2 347674 613 0.18 0.17 0.02 11.77
0.10
3 365544 704 0.19
1 204652 130 0.06
2 192304 126 0.07 0.06 0.01 16.67
0.05
3 230510 114 0.05
1 331779 20 —
2 314426 30 — — — —
0.01
3 297640 19 —
— 测定数值逸出于标准曲线之外, 未计算含量。
— The content was not calculated because the measured values was out of the standard curve.
第 11期 袁 磊等: 以实时荧光定量 PCR技术检测转基因玉米 MON88017 2121


本实验通过测定 5 种已知转基因含量的玉米混合样
品中 MON88017 的含量, 能得到扩增的含转基因成分的
最低百分含量, 定位本方法的检测底限, 虽然 0.01%的检
测量溢出了标准曲线检测特异性拷贝的数量 , 但本实验
表明实时荧光定量 PCR 的检测底限达 19~30 个阳性拷贝
数。检测准确度和灵敏度都相对较高, 可以满足国际上对
转基因食品 1%检测底限的要求。
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