全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(11): 1958−1963 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
基金项目: 国家烟草专卖局资助项目(国烟科[2005])
作者简介: 马红勃(1983–), 男, 河北邢台人, 福建农林大学作物科学学院硕士研究生, 从事烟草分子生物学研究。
*
通讯作者(Corresponding author): 祁建民, 男, 研究员, 博士生导师, 福建农林大学生命科学学院。E-mail: Qijm863@163.com; Tel &
Fax: 0591-87644898
Received(收稿日期): 2008-03-23; Accepted(接受日期): 2008-05-16.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01958
烟草 SRAP和 ISSR分子遗传连锁图谱构建
马红勃 1 祁建民 1,* 李延坤 1 梁景霞 1 王 涛 2 兰 涛 1 陈顺辉 3
陶爱芬 1 林荔辉 1 吴建梅 1
(1 福建农林大学作物科学学院/生命科学学院, 福建福州 350002; 2 福建省顺昌烟草公司, 福建顺昌 353200; 3福建省烟草公司, 福建福
州 350003)
摘 要: 采用烤烟品种台烟 7号与白肋烟品种白肋 21杂交, 构建了 187个单株的 F2遗传作图群体, 利用所筛选的 68
个能扩增出多态性条带的 SRAP 和 ISSR 引物, 对 F2作图群体进行 PCR 扩增和遗传连锁分析, 初步构建了一张包含
26个连锁群、112个(92个 SRAP和 20个 ISSR)标记位点的烟草遗传连锁图谱。该图谱覆盖长度为 1 560.2 cM, 平均
图距 18.1 cM。有 16个标记未进入连锁群。26个连锁群包含 2~20标记不等, 连锁群遗传距离 0~291.0 cM。连锁群
上有 24.1%的标记出现偏分离, 主要集中在 LG1 和 LG4连锁群上, 其余分散在不同连锁群。该图谱为烟草重要农艺
性状的基因定位、以及分子标记辅助选择等研究奠定基础。
关键词: 烟草; SRAP; ISSR; 遗传连锁图谱
Construction of A Molecular Genetic Linkage Map of Tobacco Based on
SRAP and ISSR Markers
MA Hong-Bo1, QI Jian-Min1,*, LI Yan-Kun1, LIANG Jing-Xia1, WANG Tao2, LAN Tao1,
CHEN Shun-Hui3, TAO Ai-Fen1, LIN Li-Hui1, and WU Jian-Mei1
(1 College of Crop or Life science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian; 2Fujian Shunchang Tobacco Company, Shun-
chang 353200, Fujian; 3Fujian Tobacco Company, Fuzhou 350003, Fujian, China)
Abstract: High-density genetic linkage maps are useful tools for studying genome, phylogeny and evolution, and for mapping
and Cloning genes of interest. In this study, a molecular genetic map was constructed with F2 population consisting of 187 indi-
viduals from a cross of flue-cured tobacco cultivar Taiyan 7 and burley tobacco cultivar Bailei 21 by using a total of 513 SRAP
primers and 42 ISSR primers. Approximately 58 out of 513 and 10 out of 42 primers, respectively, showed polymorphisms. Each
of this polymorphic primers produced at least one scorable polymorphic DNA band which was visible enough for detection and
scoring. The map consisted of 26 linkage groups which included 112 (92 SRAP and 10 ISSR) markers, and covered 1 560.2 cM
with an average distance of 18.1 cM. Sixteen markers were still unlinked. All 26 linkage groups consisted of 2–20 markers rang-
ing in length from 0–291.0 cM. A total of 24.1% distorted markers distributed in the map, mainly concentrated in the LG1 and
LG4 linkage groups, and the others were mapped on diverse linkage groups respectively. This map will provide the basis for gene
mapping and marker-assisted selection of important agronomic traits in tobacco.
Keywords: Tobacco; SRAP; ISSR; Genetic linkage map
DNA 分子标记已广泛应用于植物遗传连锁图
谱构建 , 烟草分子标记遗传连锁图谱的构建始于
2001年, Lin等[1]利用 RFLP和 RAPD标记对来自烟
草野生种间杂交(N. plumbaginifolia / N. longiflora)
第 11期 马红勃等: 烟草 SRAP和 ISSR分子遗传连锁图谱构建 1959
的 99个 F2植株进行遗传连锁分析, 构建了第一张烟
草种间杂交的分子标记遗传连锁图; Nishi 等[2]利用
来自白肋烟品种间杂交 (W6×Michinoku)所产生的
125 个株系的 DH 群体, 构建了第一张白肋烟 AFLP
分子遗传连锁图; 肖炳光等[3]利用烤烟品种 Speight
G-28 和 NC2326 杂交得到的 137 个株系的 DH 群体
为作图材料, 利用 ISSR与 RAPD标记, 构建了第一
张烤烟遗传连锁图; Bindler 等[4]利用 SSR 标记对烤
烟品种 Hicks Broad Leaf和 Red Russian杂交产生的
186个 F2植株进行遗传连锁分析, 构建了第一张 SSR
分子标记遗传连锁图。较高密度的分子图谱能有效
地应用于烟草不同栽培类型若干数量性状的基因定
位、基因图位克隆、比较基因组学和分子标记辅助
育种等研究[5]。因此, 进一步构建烟草不同栽培类型
高密度的遗传连锁图具有重要意义。
迄今, 国内外尚未见烤烟与白肋烟品种间杂交
构建(栽培类型间)的遗传连锁图谱的报道。就分子标
记而言, 烟草种内杂交遗传多态性相对较低, 而种
间杂交则存在 F1代不育或者 F2代发生严重的偏分离
现象, 因此烟草遗传作图有较大难度和局限性。现
有的烟草分子连锁图谱的位点密度和分布均匀度还
远不够。SRAP 标记是 Li 和 Quiros[6]发展起来的新
型标记, 该标记通过独特的引物设计, 通过上游和
下游引物的自由组合, 大大降低引物合成成本, 近
年来在众多作物上成功应用, 非常适合遗传图谱的
构建。本研究采用 SRAP和 ISSR标记, 在烟草种质
资源分子标记分析的工作基础上, 选用遗传距离较
大、亲缘关系较远、相对性状有明显差异的烤烟与
白肋烟不同栽培类型品种(台烟 7号和白肋 21)进行亚
远缘杂交, 建立了 F2 作图群体, 初步建成烤烟与白
肋烟(栽培类型间)的分子标记遗传连锁图。
1 材料与方法
1.1 群体构建
在百份烟草遗传多样性与亲缘关系 SRAP 和
ISSR 分子标记分析的工作基础上 [7-9], 选用不同栽
培类型的烤烟品种台烟 7号与白肋烟品种白肋 21杂
交, F1套袋自交建立了 187个单株 F2代作图群体, 并
构建 F2:3群体。台烟 7 号与其他栽培品种的遗传距
离接近于野生种与栽培种的遗传距离, 是遗传作图
的较理想品种[7]。
1.2 基因组 DNA提取
供试亲本及 F2群体均在温室漂浮育苗, 在 5∼6
叶期, 每份材料取幼嫩叶片 5 g, 利用本研究室改良
的 CTAB 法[7]提取基因组 DNA, 即采集足量的烟草
嫩叶、抽提时加入 β-巯基乙醇、抽提过程中使用 2.5%
CTAB、最后用预冷的无水乙醇沉淀 DNA。
1.3 SRAP分析
SRAP-PCR 扩增总体积 20 μL, 其中包括 1×
buffer [10 mmol L−1 Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol L−1
KCl, 2.3 mmol L−1 MgCl2, 0.08% Nonidet P40], dNTP
(各 200 μmol L−1), 上下引物各 33 ng, DNA模板 20
ng, Taq 酶 1.5 U (Taq 酶、1×buffer、SRAP 引物和
dNTP 均购自上海生工生物工程技术服务有限公
司)。扩增条件为 94℃预变性 5 min, 反应前 5 个循
环在 94℃ 1 min, 33℃ 1 min, 72℃ 1 min; 随后的
30 个循环复性温度提高到 53℃, 最后 72℃延伸 5
min, 4℃保存[9]。PCR在 PTC-100多功能 PCR仪中
进行。
采用北京六一仪器厂生产的DYY-5型稳压稳流
电泳仪, 用 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 PCR产物。
电泳缓冲液为 1×TBE, 电泳电压 300 V, 时间 2.5 h,
银染检测。
1.4 ISSR分析
ISSR-PCR 扩增总体积 25 μL, 其中包括 1×
buffer, (10 mmol L−1 Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol L−1
KCl, 1.5 mmol L−1 MgCl2, 0.08% Nonidet P40), DNA
模板 20 ng, Taq酶 1.5 U, 引物 0.18 μmol L−1, dNTP
150 μmol L−1(Taq酶、1×buffer、ISSR引物和 dNTP
均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)。ISSR
反应条件为 94℃预变性 5 min; 94℃变性 45 s, 54℃
退火 1.5 min, 72℃延伸 1.5 min, 41个循环; 72℃延伸
7 min; 4℃保存。PCR在 PTC-100多功能 PCR仪中
进行。扩增产物的检测同 SRAP分析。
1.5 标记命名及连锁分析
采用“引物组合+标记片段长度”的方法对标记
进行命名, 如 M9E9-540指用 SRAP引物组合 M9E9
扩增出的大小为 540 bp 的扩增带, U826-860 指用
ISSR引物 UBC826扩增出的大小为 860 bp的扩增带,
其近似分子量用 100 bp DNA ladder marker (100∼
5 000 bp)估计。如果该条带白肋 21对台烟 7号为显
性, 则 F2代中显性的计为D, 隐性的计为 B; 如果该
条带白肋 21对台烟 7号为隐性, 则 F2代中显性的计为
C, 隐性的计为 A。由此得到分子标记的分离数据, 通
过卡方测验(χ2)检验标记是否符合 3∶1的分离比例。
应用软件 Mapmaker/Exp Version 3.0b 在 PC计
算机上进行连锁图谱的构建。对于符合 3∶1分离比
1960 作 物 学 报 第 34卷
例的标记 , 先用 Group 命令进行标记间连锁分组
(LOD=3.0, 最大距离 37.2 cM); 然后在每个连锁群
内使用 Order 和 Compare 命令进行排序。用 Try 命
令插入不符合 3∶1 分离比例的标记; 后用 Kosambi
函数将重组率转换成图距单位(cM), 用 Map 命令建
立连锁图, 最后用 MapDraw V2.1[10]画出连锁图。
2 结果与分析
2.1 分子标记的多态性
首先以亲本白肋 21和台烟 7号为材料进行引物
筛选, 然后利用筛选出的多态性引物对 187 个 F2代
作图群体单株进行分子标记分型分析。在 SRAP 分
析中, 513个引物组合中能在亲本间扩增出多态性的
引物组合有 108 个, 利用这些引物对 F2 群体进行
SRAP 分析, 其中 58 个能在群体中扩增出多态性条
带 105 个, 每个引物组合扩增的多态性条带数 1∼6 个
不等, 平均为 1.8个。引物M13E7的扩增结果见图 1。
图 1 引物组合 M13E7的部分扩增结果
Fig. 1 Parts of amplifications using primer M13E7
M: marker; P1: 白肋 21; P2: 台烟 7号; 1~19: F2群体单株 1~19。
箭头表示多态性片段。
P1: Bailei 21; P2: Taiyan 7; 1–19: F2 plants 1–19.
Polymorphic fragments are indicated by arrows.
在 ISSR分析中, 42 条引物中有 10 条能在亲本
间表现多态性 , 利用这 10 条引物对 F2 群体进行
ISSR分析, 共产生多态性标记 23个, 每条引物扩增
出多态性条带数 1∼4 个不等, 平均为 2.3 个。引物
UBC835的扩增结果见图 2。
图 2 引物 UBC835的部分扩增结果
Fig. 2 Parts of amplifications using primer UBC835
M: marker; P1: 白肋 21; P2: 台烟 7号; 1~19: F2群体单株 1~19。
箭头表示多态性片段。
P1: Bailei 21; P2: Taiyan 7; 1–19: F2 plants 1–19.
Polymorphic fragments are indicated by arrows.
2.2 分子标记的分离分析
在 P=0.05 水平上的卡平方测验结果表明, 128
个分子标记中(23个 ISSR标记, 105个 SRAP标记),
有 31 个标记分离不符合孟德尔比例(3∶1), 即表现
偏分离(表 1), 占标记总数的 24.3%, 其中 SRAP 标
记 25个占 SRAP总标记的 23.8%, ISSR标记 6个占
ISSR 总标记的 26.1%。这些偏分离的标记中有 23
个偏向纯隐性带型(74.2%), 其余 8个偏向显性(包括
纯显性和杂合型)带型(25.8%)。另外还有 50 对在亲
本间表现多态性而在 F2群体中不分离并完全偏向某
一亲本的引物组合。
表 1 构建遗传图谱所用的分子标记
Table 1 The molecular markers used for genetic map construction
分子标记
Molecular
markers
引物(对)数
Number of
primers or primer
combinations
多态性标记数
Number of poly-
morphic markers
偏分离标记数
Number of dis-
torted markers
连锁标记数
Number of linked
markers
未连锁标记数
Number of
unlinked
markers
ISSR 10 23 6 20 3
SRAP 58 105 25 92 13
Total 68 128 31 112 16
第 11期 马红勃等: 烟草 SRAP和 ISSR分子遗传连锁图谱构建 1961
2.3 遗传连锁图谱的构建
利用 Mapmaker/Exp Version 3.0b 和 MapDraw
V2.1 软件, 将 128 标记中的 112 个标记位点定位在
26 个连锁群上, 覆盖长度为 1 560.2 cM, 平均标记
数为 4.3个, 两个标记间平均图距为 18.1 cM, 另有 3
个 ISSR标记和 13个 SRAP标记未与这 26个连锁群
连锁。标记位点较多的连锁群为 LG1、LG2、LG3
和 LG4, 分别包含 20、10、12和 10个标记, 标记数
最少的连锁群只有 2个。连锁群 LG1遗传距离最长,
为 291.0 cM, 遗传距离最短的为 0 cM, 平均图距最
大的连锁群为 LG10, 间距为 48.6 cM, 平均图距最
小的连锁群为 LG23 和 LG26, 间距为 0 cM。在 31
个偏分离的标记中有 27个表现出连锁遗传关系, 分
布于 9个不同的连锁群上, 每个连锁群各包含有 1∼8
个偏分离标记, LG12 和 LG20 群中仅有的两个标记
全是偏分离的, 分布在 LG4和 LG1的偏分离标记明
显偏多, 达到 6个和 8个, 形成了十分明显的偏分离
标记密集区。表 2和图 3显示 ISSR标记和 SRAP标
记在各连锁群中的分布情况 , 连锁图中标有*的为
偏分离标记。
表 2 ISSR和 SRAP标记在遗传连锁图上的分布
Table 2 Distribution of ISSR and SRAP markers on genetic linkage map
连锁群
Linkage
group
长度
Length
(cM)
标记数
Number of
markers
平均图距
Average
distance
(cM)
偏分离标记数
Number of
distorted markers
连锁群
Linkage
group
长度
Length
(cM)
标记数
Number of
markers
平均图距
Average
distance
(cM)
偏分离标记数
Number of
distorted markers
LG1 291.0 20 15.3 8 LG15 28.8 2 28.8 0
LG2 209.0 10 23.2 3 LG16 27.7 2 27.7 0
LG3 192.0 12 17.5 2 LG17 23.3 2 23.2 0
LG4 254.0 10 28.2 6 LG18 18.2 2 18.2 0
LG5 74.9 5 18.7 1 LG19 22.2 2 22.2 0
LG6 73.1 7 12.2 2 LG20 6.8 2 6.8 2
LG7 82.0 3 41.0 0 LG21 8.0 2 8.0 0
LG8 25.0 8 3.6 0 LG22 5.0 2 5.0 0
LG9 20.7 2 20.7 0 LG23 0 2 0 0
LG10 48.6 2 48.6 0 LG24 5.0 2 5.0 1
LG11 41.7 2 41.7 0 LG25 2.7 2 2.7 0
LG12 37.0 2 37.0 2 LG26 0 2 0 0
LG13 35.2 2 35.2 0 Total 1560.2 112 18.1 27
LG14 28.6 3 14.3 0 amounts
3 讨论
3.1 关于烟草遗传连锁图
分子标记遗传连锁图谱构建的理论基础是交换
和重组, 分子连锁群的数目应该同相应物种的染色
体数目一致[3]。烟草栽培品种有 24 对染色体, 由于
分子标记在染色体上分布的随机性及染色体不同区
段交换的异质性, 连锁群上常常会产生较大的间隙,
严重者则出现小片段的连锁群[5]。本研究中有 19个
连锁群只包括 2∼4 个标记, 在 Lin 等[1]的研究中有
10 个连锁群仅包括 2~4 个标记, 肖炳光等[3]的研究
中有 17个连锁群仅包括 2∼4个标记, Bindler等[4]的
研究中有 2 个连锁群仅包括 2~4 个标记, 表明部分
烟草连锁群中还存在相当大的间隙。将分子遗传连
锁图谱与经典遗传图联系起来, 并将其归属到相应
的染色体上, 是构建一个比较饱和的连锁图谱的重
要工作, 有待后续研究进一步深化。目前我们正在
对该群体继续应用多种标记复合构图, 将在近期构
建出一张分布更均匀和位点密度较高的烟草遗传连
锁图谱。
3.2 关于 SRAP标记
SRAP是一种新型的分子标记, 已经在水稻、棉
花、马铃薯、莴苣、油菜和大蒜等作物上研究应用,
具有简便、稳定、中等产率的特点, 在基因组中分
布均匀, 适合于基因定位、基因克隆等分子生物学
研究[6], 但在烟草上除本研究外, 尚未见其他报道。
本研究构建的连锁图只是初步的框架图, 目的是检
测 SRAP 在烟草作图中是否可行。到目前为止, 已
构建的 4 张烟草分子遗传连锁图谱[1-4]应用的 DNA
标记主要是 RFLP、RAPD、ISSR 及 SSR, RFLP 标
1962 作 物 学 报 第 34卷
图 3 烟草 SRAP和 ISSR分子遗传连锁图
Fig. 3 SRAP and ISSR molecular genetic linkage map of tobacco
记具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优
点 , 但实际操作过程较复杂 , 不易实现自动化 , 并
且 DNA要求高、用量大, 对大群体进行分析的费用
高; RAPD 标记操作简便易行, 但易受实验条件影
响、重复性差、产率低; SSR的优点是多态性高, 缺
点是必须测定每类 SSR 两端序列来设计引物, 这给
SSR 标记在植物基因组研究的广泛应用带来了不便[11];
SRAP 和 ISSR 是两种很好的标记, 实验操作简单,
重复性好, 有利于遗传作图, 并在其他作物上已成
功应用。SRAP和 ISSR将成为植物研究领域的一种
有力工具。
3.3 关于分子标记偏分离
偏分离遗传现象在自然界普遍存在, 烤烟[3]、大
白菜[5]、大豆[12]、甘蓝[13]、高粱[14]等的分子遗传连
锁图谱构建中都有表现。在水稻、玉米中已经发现
了导致偏分离的雄配子体基因[15-16], 证实偏分离现
象与配子体的选择有关。Knox和 Ellis[17]认为环境因
素、非同源重组、基因转换和转座因子等也可能是
引起偏分离的重要因素。本研究中进入连锁群的 112
个标记位点当中, 有 27 个(24.1%)偏离 3∶1 的分离
比例, 比肖炳光等 [3]所用的烤烟类型品种间杂交构
建的 DH 群体(14%)偏分离稍高。本研究 F2作图群
体中出现的偏分离稍高的现象, 可能与我们选用的
亲本为烤烟和白肋烟不同栽培类型品种间杂交, 遗
传距离相对较远, 以及配子体选择性较强有关。此
外, 本研究中还出现很多引物在亲本间表现多态性,
第 11期 马红勃等: 烟草 SRAP和 ISSR分子遗传连锁图谱构建 1963
在群体中却不分离, 偏向某一亲本的现象, 这可能
与群体类型、非同源重组、群体大小、标记类型等
有关, 其分子遗传机理有待进一步研究。
4 结论
构建了烤烟×白肋烟的分子标记遗传连锁图 ,
丰富了烟草遗传连锁图谱构建的类型, 初步证实了
SRAP和 ISSR是烟草作图上的一种有力工具。该图
谱 112个标记位点分布于 26个连锁群, 覆盖长度为
1 560.2 cM, 平均图距 18.1 cM。
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