全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(12): 2035−2044 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家农作物转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08005-004)和中央级公益性科研院所基本科研业务专项。
*
通讯作者(Corresponding author): 叶武威，E-mail: yeww@cricaas.com.cn, Tel: 0372-2562283
第一作者联系方式: E-mail: wdl_21@126.com, Tel: 0372-2562279
Received(收稿日期): 2010-05-18; Accepted(接受日期): 2010-08-01.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.02035
干旱胁迫下棉花 SSH文库构建及其抗旱相关基因分析
王德龙 叶武威* 王俊娟 宋丽艳 樊伟丽 崔宇鹏
中国农业科学院棉花研究所 / 农业部棉花遗传改良重点开放实验室, 河南安阳 455000
摘 要: 以耐旱自交系邯郸 177 为材料, 利用抑制性差减杂交技术(SSH), 构建棉花苗期叶片的正向差减文库。挑取
300 个阳性克隆进行 PCR 验证, 并对验证后的单克隆进行测序和分析, 共获得 284 个有效序列。聚类后得到 202 条
uniESTs序列, 其中 174条 singlets, 28条 contigs。经过 BlastN分析, 156个 unigene可以在 GenBank中找到同源序列,
46 个 unigene 未能找到同源匹配。经 BlastX 分析, 40 个 unigene 与未知功能蛋白或假定蛋白有较高相似性, 116 条
unigene与已知功能蛋白有较高同源性。用 KOBAS系统将 33个 unigene定位到 55个 Pathways中, 其中 P值小于 0.5
的 Pathway有 23条。初步分析发现, 丙酮酸盐代谢(pyruvate metabolism)途径、乙醛酸和二羧酸代谢(glyoxylate and
dicarboxylate metabolism)途径与棉花抗旱相关性较大。这些 unigene基因涉及信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核
酸代谢、光合作用及膜运输等代谢过程。发现了苹果酸合成酶基因(Ms1, 001_B03; Ms2, 003_E04)、苹果酸脱氢酶基
因(Md1, 001_C12; Md2, 002_F01); NAC(001_C08)、锌指蛋白(zfp, 003_C06)、BZR1/BES1(003_G04)等转录调节因子, 以
及翻译控制肿瘤蛋白基因(TCTP, 002_C04)等耐旱相关基因。
关键词: 干旱胁迫; SSH; unigene; 耐旱
Construction of SSH Library and Its Analyses of Cotton Drought Associated
Genes under Drought Stress
WANG De-Long, YE Wu-Wei*, WANG Jun-Juan, SONG Li-Yan, FAN Wei-Li, and CUI Yu-Peng
Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory for Cotton Genetic Improvement, Ministry of Agriculture,
Anyang 455000, China
Abstract: A forward cDNA-SSH library was established by suppression subtractive hybridization using seedling leaf of Handan
177, a drought-tolerant cotton (Gossypium hirsuutm L.) inbred line, among which 300 positive clones were selected for sequenc-
ing. After detection by PCR for each clone, each single clone was sequenced. Totally 284 available sequences and 202 uniESTs
which 28 were contigs and 174 were singlets were obtained by cluster analyses of the ESTs sequencing. The results of BlastN
showed that 156 uniESTs had homologous sequences in GenBank database while the other 46 had no protein homologous. The
BlastX results indicated that 116 uniESTs had significant protein homology and 40 uniESTs were unknown proteins and putative
proteins. KOBAS mapped 33 ESTs of the 202 uniESTs to 55 KEGG pathways, in which there were 23 pathways at P-value<0.05.
This study suggested that there were closely relationships with cotton drought tolerance among pyruvate metabolism, glyoxylate
and dicarboxylate metabolism. A large group of drought stress-induced genes were found in the cDNA library, which involved in
many metabolism pathways such as signal transduction, energy metabolism, protein metabolism, nucleic acid metabolism, photo-
synthesis, transmembran. And some genes related to drought tolerance were found, such as malate synthase genes (MS1,
0001_C12; MS2, 0002_F01) and malate dehydrogenase genes(Md1, 001_C12; Md2, 002_F01), some transcription factors like
NAC(001_C08), BZR1/BES1(003_G04), zinc finger protein genes (zfp, 003_C06), and the translationally controlled tumor protein
gene(TCTP, 002_C04).
Keywords: Drought-stress; Suppression subtractive hybridization (SSH); unigene; Drought tolerance
棉花生长发育过程中经常会受到各种不良环境
的胁迫, 如干旱、高盐、低温等。这些因素是影响
作物生长、限制作物产量的主要非生物胁迫因子 ,
可以引起植物体内一系列生理代谢反应和生长的可
2036 作 物 学 报 第 36卷

逆性抑制, 严重时引起植株不可逆的伤害甚至死亡[1]。
近些年来, 我国干旱土地面积不断加大。据统计, 世
界干旱、半干旱地区占地球陆地面积的三分之一, 我
国干旱、半干旱地区占全国陆地面积的二分之一[2-4];
干旱灾害天气频繁出现, 影响范围广, 给我国棉花
生产带来极大的影响, 损失惨重[5]。因此了解棉花抗
旱机制, 培育棉花抗旱品种己经成为作物育种科学
的一个重要任务, 也是农业生产发展的必然需要。
利用基因工程手段发掘和克隆抗旱基因, 并通过转
基因技术转移到棉花栽培品种, 可有效解决缺乏棉
花抗逆材料的问题。目前, 转抗逆基因已经成为遗
传资源和品种改良的热点。
抗旱性是一个非常复杂的由多基因控制的性状,
涉及从信号转导基因到转录调控基因, 以及保护、
防御、胁迫耐受基因的表达[6]。国内外很多科学家
在拟南芥[7-9]、小麦[10-11]、水稻[12-14]、玉米[15-17]、大
豆[18]、高粱[19]、马铃薯[20]和烟草[21]等植物中都有抗
旱基因的研究报道。在棉花中 Selvam 等 [22]利用
cDNA-RAPD 技术比较分析棉花 KC3 和 MCU12 两
个材料的表达谱 , 分离鉴定了一个新的抗旱基因
OPA15。Kosmas等[23]利用染色体步移技术在栽培种
ZETA 2中克隆了抗旱基因海藻糖-6磷酸合成酶基因
(tps)。
近些年来, SSH(suppression subtractive hybridi-
zation)技术的广泛应用为抗旱基因的发掘提供了较
好的技术支持。SSH 技术与 DDRT-PCR 和 RDA 等
方法相比具有灵敏性高、操作简单、假阳性率低、
速度快等特点[24-28]。可以方便地分离植物发育过程
中特定发育阶段和特定组织器官差异表达的基因 ,
为揭示植物生长发育过程中的分子机理奠定基础 ;
也可以分离各种非生物胁迫条件下诱导表达的抗性
相关基因, 从而揭示植物的抗逆机制。如在抗旱基
因的研究上, 李惠勇等[29]利用 SSH技术构建了玉米
自交系品种 CN165苗期干旱诱导的正向抑制性消减
文库。张宏等[30]利用抑制消减杂交技术构建了小麦
品种小偃 22 干旱胁迫诱导基因表达的 SSH-cDNA
文库。Mathilde 等[31]利用抑制消减杂交技术构建了
大豆干旱条件下的 SSH文库。张玲等[32]构建了亚洲
棉石系 1号抗旱 SSH文库。本研究通过 SSH技术构
建陆地棉抗旱文库, 获得陆地棉干旱诱导基因 EST
序列, 利用生物信息学分析方法, 了解文库中耐旱
基因的表达种类和丰度, 进而找到参与陆地棉抗旱
的代谢途径和适应机理, 为植物抗旱基因工程提供
理论支持和基因支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理方法
将耐旱自交系邯郸 177种子在室温下用无菌水
浸泡过夜。育苗所用基质于烘箱中 180℃高温烘干。
准备 20 个直径为 30 cm, 大小一致的塑料盆, 每盆
盛装相同质量的土壤, 播种 30~40 粒种子, 灌水量
相同, 温室温度为 28~35℃。出苗 10 d后, 每盆定 5
棵长势一致的幼苗。每 2个盆为一组, 分为 10组, 每
组设一个对照和处理。处理组至 3 片真叶时停止浇
灌, 对照组继续正常浇灌, 控制土壤含水量一致。每
天用称重法监测处理盆水分含量 , 当达到 10%后 ,
每隔 1 d对处理和对照同时取样, 分别于–70℃保存
备用, 直到处理组水分含量到达 3%后停止取样[33]。
共取样 5 次, 依次标记为时期 1 (包括处理和对照)
至时期 5(包括处理和对照)。
1.2 棉花叶片 RNA的提取及 mRNA的纯化
采用改良的 CTAB-PVP 法, 提取每个处理及对
照样品的总 RNA, 每个样本 2 μL (10 μL μg–1) 总
RNA等量混合后纯化, –70℃保存。以混合的对照样
品 mRNA 为 Driver, 以混合的处理样品 mRNA 为
Tester。用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整
性, 紫外分光光度计(DU800, BAKEMAN)测定其纯
度和浓度。使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA 纯化
试剂盒(purification of polyA+ RNA from total RNA)分
离 mRNA。
1.3 抑制性消减杂交
应用 Clontech的 PCR-Select cDNA Subtraction
Kits消减杂交试剂盒, 先将Driver和 Tester的mRNA
分别反转录, 得到双链 cDNA, 再以 2 μg Tester和 2
μg Driver cDNA 作为起始材料进行差减杂交。在
37℃水浴下分别对 Tester和Driver用 Rsa І酶切 1.5 h,
将酶切后的 Tester cDNA 分成两等份, 连接上不同
的接头, 而 Driver cDNA 不连接头。两种连有不同
接头的Tester cDNA分别与过量的Driver混合, 进行
第一次差减杂交。将两种第一次差减杂交的产物混
合, 再与新鲜变性的 Driver cDNA 进行第二次差减
杂交, 利用两次抑制性 PCR 扩增差异表达的片段,
使其得到富集。
1.4 SSH-cDNA文库构建
两次 PCR产物经 QIAquick PCR Purification Kit
(Qiagen)纯化后与 pGEM-T easy (Promega)载体连接,
第 12期 王德龙等: 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建及其抗旱相关基因分析 2037


采用热激法转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞(天根),
涂于含有 Amp/X-gal/IPTG 的 LB 培养基上, 37℃避
光恒温培养进行蓝白斑筛选。将所有白色克隆挑于
含有 LB液体培养基的 96孔细胞培养板(CORNING)
中, 37℃培养过夜后加甘油至终浓度 20%, 于–80℃
保存备用。
1.5 DNA测序和生物信息学分析
以巢式 PCR引物 Primer 1和 Primer 2R进行菌
液 PCR 扩增, 对阳性克隆进行进一步筛选, 对所有
阳性克隆在 3730 自动测序仪(ABIPrism)上测序, 用
PHRED 程序对所测序列进行分析 , 以消除载体序
列、接头序列和低于 100 bp的 EST序列。对筛选的
序列进行 BlastN和 BlastX分析, 依据 Nr库和 Nt库
进行功能注释, 依据直系蛋白同源数据库进行功能
分类; 利用 KOBAS 软件对 202 个 uniESTs 进行
KEGG Pathway分析。
2 结果与分析
2.1 棉花叶片总 RNA及 mRNA质量检测
干旱胁迫的叶片 (tester)和对照叶片 (driver)总
RNA分离、纯化后, 经 1%琼脂糖凝胶电泳检测, 并
照相记录(图 1)。大部分 RNA集中在 18S和 28S带
上, 28S和 18S亮度比为 1.5~2.0。经稀释(100倍)后
用紫外分光光度计(DU800, BAKEMAN)检测显示 ,
A260/280在 1.9~2.1之间, 表明几乎没有蛋白质、酚和
多糖类物质等污染, 没有拖带现象, 说明总 RNA 完
整性较好, 可进行下一步试验。纯化的 mRNA 也呈
现正常弥散的亮带。



图 1 叶片的总 RNA电泳检测
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis for analysis of total RNA
1: 对照总 RNA; 2: 诱导总 RNA。
1: total RNA from control; 2: total RNA from the treated.

2.2 cDNA合成以及 cDNA酶切效果分析
cDNA合成反应成功与否取决于 AMV反转录酶
的活性以及总 RNA 的纯度, 本实验合成的 cDNA 的
电泳结果显示 cDNA 分子大小分布正常(图 2), 双链
cDNA合成后用四碱基(CTAG)内切酶 Rsa I进行酶切
反应, 酶切完成后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果
(图 3)。用 Rsa I内切酶消化后的 cDNA弥撒带明显下
移, 大小主要在 100~1 000 bp之间, 酶切较为充分。



图 2 双链 cDNA电泳分析
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of double chains of cDNA
M: DL2000 marker; 1: 诱导 cDNA; 2: 对照 cDNA。
M: DL2000 marker; 1: treated cDNA; 2: control cDNA.



图 3 Rsa I酶切电泳检测
Fig. 3 cDNA agarose gel electrophoresis of Rsa I digestion
M: marker III; 1: 诱导 cDNA; 2: 诱导 cDNA 酶切后; 3: 对照
cDNA; 4: 对照 cDNA 酶切后。
M: marker III; 1: treated cDNA before digestion; 2: treated cDNA
after digestion; 3: control cDNA before digestion; 4: control cDNA
after digestion.

2.3 文库质量检测
杂交后的 cDNA 以通用引物 Primer1 进行第 1
次 PCR扩增, 以巢式引物 Primer2R进行第 2次 PCR
扩增。经检测, 第 2次 PCR产物与第 1次 PCR产物
相比, 电泳条带有较为明显变化, 第二次抑制 PCR
有几条主带出现, 条带分布范围较第 1次 PCR下移,
2038 作 物 学 报 第 36卷

主要集中在 250~1 500 bp (图 4)。分别以差减后和未
差减 tester 第 2 次 PCR 产物为模板, 扩增棉花持家
基因(histon3, AF024716)来检测文库的差减效率, 差
减后的样品在 33个循环之后方出现淡淡的目的条带,
比未差减样品晚了 10个多循环, 说明大量组成型基
因被有效去除, 有差异表达及稀有基因在文库中出
现的几率大大提高(图 5)。



图 4 消减 PCR电泳检测结果
Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of the subtractive products
of the second PCR amplification
M: DL2000 marker; 1: 杂交后 cDNA; 2: 杂交前 cDNA。
M: DL2000 marker; 1: cDNA after hybridization; 2: cDNA before
hybridization.
将差减后的两次 PCR产物纯化、连接到 T-Easy
载体(TaKaRa), 转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞, 经
蓝白斑筛选共获得 2300个阳性克隆。随机挑选 120
个阳性克隆进行菌落 PCR, 其文库重组率为 93%,
插入片段大小为 250~750 bp (图 6)。



图 5 差减效率检测
Fig. 5 Subtraction efficiency evaluation
M: marker III; 1~4: 以第二次差减后的第 2次 PCR产物为模板,
分别扩增 18、23、28、33个循环; 5~8: 以未经消减的第 2次 PCR
产物为模板, 分别扩增 18、23、28、33个循环。
M: marker III; 1–4: PCR products from subtracted tester after 18,
23, 28 and 33 cycles of amplification; 5–8: PCR products from
unsubtracted tester after 18, 23, 28, and 33 cycles of amplification.



图 6 文库中部分阳性克隆 PCR鉴定结果
Fig. 6 PCR amplification of positive clones randomly picked up from the SSH library
M: DL2000; 1~18: PCR产物。M: DL2000; 1–18: PCR product.

2.4 EST的功能分类和代谢通径分析
随机挑选 289 个重组子进行测序, 去除低质量
序列后获得 284条 EST, 最短的为 112 bp, 最长的为
817 bp, 片段平均长度为 447 bp。聚类后得到 202条
非冗余 EST(unigene), 经 BlastN发现其中 116条(占
57.4%) unigene在 GenBank中有同源序列; 经 Blast-
X 比对后按照注释的功能及序列来源进行分类, 40
条 EST(22.8%)功能未知或者为假定蛋白, 另有 46条
(22.8%)未获得同源匹配, 推测可能为新基因或是处
于 3′、5′末端非翻译区的较短序列, 因而无法找到同
源匹配。在有功能注释的 ESTs中, 与催化活性有关
的 EST 有 38 条, 所占比例最高, 达到 18.8%; 参与
干旱保护、防御相关的基因有 30 条, 占 14.9%; 参
与信号转导和转录调节的 EST有 16条, 占 7.9%; 跨
第 12期 王德龙等: 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建及其抗旱相关基因分析 2039


膜转运相关的 EST有 6条, 占 3.0%; 参与光合作用
的有 4条, 占 1.9%; 参与其他结构和功能的 ESTs 22
条, 占 10.8%。表 1 列出了部分 ESTs 及其功能, 其
中 E-value 值越低 , 注释的功能越准确。对所有
uniEST按照分子功能、生物学过程和细胞组分进行
GO 分类(图 7)发现, 参与蛋白绑定(bingding)和催化
活性(catalytic activity)的 EST所占比例最大。
所有的ESTs序列用KOBAS (for KEGG Orthology
based Annotation System) [34]软件进行代谢途径分析,
将基因定位到其发挥功能的代谢途径中, 找出与抗
旱密切相关的代谢途径。KOBAS 共将 284 条 ESTs
中的 95 个定位到 55 个代谢途径中, 其中 P 值小于
0.05的代谢途径共有 23条(表 2)。可以看出, 抗旱过
程涉及到很多基因和代谢过程。其中定位到丙酮酸
盐代谢(pyruvate metabolism)途径中的 ESTs有 5个,
占 15.15%。定位到乙醛酸和二羧酸代谢途径中有 4
个, 占 12.12%; 定位到类苯基丙酸合成(phenylpro-
panoid biosynthesis)、氧化磷酸化 (oxidative phos-
phorylation)、脂肪酸代谢(fatty acid metabolism)以及
半胱氨酸和甲硫氨酸等氨基酸代谢途径的 ESTs 各
有 3个, 占 9.09%。
3 讨论
干旱、盐胁迫严重影响棉花正常的生长发育 ,
其破坏机理是造成棉珠组织细胞缺水、破坏细胞膜
结构、光合作用减弱、呼吸作用先升后降、核酸代
谢破坏、内源激素代谢失调、氮代谢异常以及酶系
统变化[35-36]。通过 SSH 技术, 可以发掘干旱胁迫下
造成棉花上述生理代谢破坏的基因表达情况 , 富
集、克隆关键基因, 并进行功能和转基因研究, 为分
析棉花干旱逆境下活动规律提供重要的信息。目前
制约 SSH技术在棉花基因功能研究中广泛运用的主
要障碍是需要的起始 RNA总量较大, 质量要求高。
而棉花组织糖多酚多, 很难纯化干净, 提取的 RNA
质量难以保证, 干扰消减杂交效率。各生物公司开
发的 RNA提取试剂盒, 包括针对棉花组织的试剂盒,
除可以提取棉纤维组织外, 其他组织均不能有效提
取。因此本实验使用了改良的 CTAB法, 在热 CTAB
法基础上加入 PVP 等试剂, 可以有效地从糖多酚多
的棉花叶片中提取 RNA, 提取过程中使用了水饱和
酚、氯仿以及 β-巯基乙醇等 RNase的不可逆抑制剂,
并且整个实验过程在低温环境下进行, 更有效抑制
了内源 RNase 的作用, 减少了多糖及其他一些杂质
的污染。经过多次实验, 优化了提取液各试剂的比
例, 因此提取的 RNA较纯, 并且量较多。
很多植物生化代谢途径直接参与植物抗逆反
应。在本研究中, 发现 2 个苹果酸合成酶基因(Ms1,
001_B03; Ms2, 003_E04), 2 个苹果酸脱氢酶基因
(Md1, 001_C12; Md2, 002_F01)同时参与丙酮酸盐代
谢(pyruvate metabolism)途径和乙醛酸和二羧酸代谢
(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)途径。丙酮
酸盐代谢途径涉及糖孝解、三羧酸循环、脂肪酸代
谢等代谢活动, 当植物体遇到恶劣外部环境, 例如
干旱, 高盐, 低温等环境时能够有效调整、平衡体内
各代谢进程, 启动保护机制, 参与清除活性氧(ROS),
保护膜系统, 特别是叶绿体和线粒体膜系统, 从而
适应外部不利环境。乙醛酸和二羧酸代谢途径主要
在遇到外部逆境干扰时, 平衡植物体内局部代谢紊
乱, 输送能量, 以增强抵抗力。而对于单个 unigene,
本实验中发现醛脱氢酶基因(ad1, 003_B01)参与的
代谢途径有 16个; 苹果酸脱氢酶基因(Md1, 001_ C12)
参与的代谢途径有 5 个。长链脂肪酸连接酶(Long-
chain-fatty-acid-CoA ligase, 1228-3_E10)、运输 ATPase
(vacuolar ATP synthase proteolipid, Contig39)和乙酰
辅酶 A 氧化酶(acyl-CoA oxidase, 1228-3_H10)等基
因参与的代谢途有 4 个 ; 过氧化物酶 (peroxidase,
Contig42)、支链氨基酸氨基转移酶(branched-chain
amino acid aminotransferase, 001_ A02.)、14-3-3d
protein (Contig41)等基因参与了 3个代谢途径。
本研究共获得参与信号转导和转录调控相关的
基因 16条, 以及参与保护、防御和胁迫耐受相关的
基因 30条, 说明植物抗旱是一个复杂的涉及多基因
控制的性状。其中真核生物转录因子是近十年来发
现的一类真核基因转录时起调节作用的蛋白质, 参
与基因应答外界环境因素所诱导的转录。在本研究
中发现的 NAC(001_C08)类转录因子在植物抗逆和
防卫反应中起重要作用。NAC转录因子的 C端是转
录激活功能区, 具有高度的多样性, 该端的共同特
点是一些氨基酸如兹氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨
酸重复出现的频率高。NAC转录因子可与 MYC-like
元件结合 , 该元件的核心序列 (ATGTG)在拟南芥
ERD1 干旱诱导反应应答过程中起重要作用[37]。锌
指蛋白基因(zfp, 003_C06)是另一类转录因子, 受干
旱胁迫的诱导, 对抗旱基因的表达进行调控。BR信
号在包括种子萌发、茎的伸长、叶片的扩展、木质
部的分化、抗病和逆境的忍受等许多发育和生理过

2040 作 物 学 报 第 36卷

表 1 棉花幼苗叶片干旱胁迫下部分诱导表达的基因
Table 1 Part genes expressed in cotton seedlings under drought stress
克隆号
Clone No.
登录号
Accession No.
功能注释
Function annotation
物种
Species
E-value
参与信号转导和转录调节的基因 Genes involved in signaling and transcription regulation
Contig41 ABY65003.1 14-3-3d protein Gossypium hirsutum 6.00E-61
003_C06 XP_002529910.1 Zinc finger protein Ricinus communis 8.00E-39
001_C08 ACI15345.1 NAC domain protein Gossypium hirsutum 1.00E-50
003_G04 BEH4_ARATH BES1/BZR1 homolog protein Arabidopsis thaliana 3.00E-24
001_F10 DQ459385.1 Serine/threonine kinase Nicotiana tabacum 6.00E-16
003_D11 RPK1_IPONI Receptor-like protein kinase Ipomoea nil 2.00E-17
001_H10 RPOD_PSEAE RNA polymerase signal factor Pseudomonas aerugi-nosa 9.00E-06
002_G07 XP_002313372.1 F-box family protein Populus trichocarpa 8.00E-13
003_E07 XP_002532580.1 cop9 signalosome complex subunit Ricinus communis 2.00E-60
1228-3_A11 XP_002515442.1 ccr4-associated factor Ricinus communis 1.00E-122
编码保护、防御和胁迫耐受蛋白的基因 Genes encoded protein protecting, defense and conferring stress tolerance
003_F08 ABN09825.1 Thioredoxin Medicago truncatula 9.00E-57
002_G06 XP_002299276.1 Glutathione reductase Populus trichocarpa 1.00E-96
Contig13 AAA99868.1 Peroxidase Gossypium hirsutum 6.00E-24
001_D04 PX11B_ARATH Peroxisomal membrane protein Arabidopsis thaliana 2.00E-33
1228-3_H10 ACOX1_ARATH Peroxisomal acyl-coenzyme Arabidopsis thaliana 5.00E-42
001_G10 XP_002331333.1 Cytochrome P450 Populus trichocarpa 7.00E-45
1228-3_D11 AAV74186.1 Metallothionein-like protein Gossypium hirsutum 2.00E-21
Contig2 P46521.1 Lea5-A Gossypium hirsutum 5.00E-40
002_C04 ACF06595.1 Translationally controlled tumor protein Elaeis guineensis 2.00E-55
001_D06 AAZ83344.1 ACC oxidase Gossypium hirsutum 3.00E-09
Contig9 XP_001635724.1 Dehydration-induced protein Gossypium arboreum 7.00E-12
002_C09 CU233317.1 Severe drought-stressed opposite wood Populus 2.00E-06
003_A11 AY039800.2 Drought-induced protein Retama raetam 1.00E-08
002_B03 XP_002512737.1 Heat shock protein binding Ricinus communis 2.00E-59
003_B08 TIF3B_ARATH Protein TIFY 3B Arabidopsis thaliana 6.00E-08
Contig4 CHI4_PHAVU Endochitinase PR4 Phaseolus vulgaris 2.00E-50
跨膜转运 Transmembran
Contig39 XP_002513751.1 Vacuolar ATP synthase proteolipid subunit Ricinus communis 4.00E-22
003_D09 ANTR1_ARATH Sodium-dependent phosphate transport protein Arabidopsis thaliana 2.00E-17
001_D01 XP_002528039.1 Sugar transporter Ricinus communis 1.00E-20
003_H06 NP_199774.1 Amino acid transmembrane transporter Arabidopsis thaliana 5.00E-33
003_E12 AAR06239.1 Dicarboxylate/tricarboxylate carrier Citrus junos 2.00E-42
001_C09 SYP51_ARATH Syntaxin Arabidopsis thaliana 2.00E-37
光合作用 Photosynthesis
003_H02 ACO51067.1 Chloroplast chlorophyll A-B binding protein Gossypium hirsutum 4.00E-74
003_D07 FER_TOBAC Ferredoxin Nicotiana tabacum 1.00E-06
1228-3_C12 YP_002970675.1 Cytochrome b6/f Alsophila spinulosa 1.00E-12
1228-3_A10 XP_002528877.1 Carotenoid cleavage dioxygenase Ricinus communis 3.00E-45
参与结构和功能代谢合成途径中的一些酶 Enzymes present in pathways leading to the synthesis of functional and structural metabolites
002_A10 ACJ15472.1 Galactinol synthase Brassica napus 2.00E-11
002_E01 A4PU48.1 S-adenosylmethionine synthetase Medicago truncatula 2.00E-45
003_E04 X52305.1 Malate synthase Gossypium hirsutum 0
第 12期 王德龙等: 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建及其抗旱相关基因分析 2041


(续表 1)
克隆号
Clone No.
登录号
Accession No.
功能注释
Function annotation
物种
Species
E-value
003_C05 XP_002531630.1 3-ketoacyl-CoA synthase Ricinus communis 1.00E-119
001_B10 EF688569.1 Phosphoethanolamine N-methyltransferase Gossypium hirsutum 7.00E-73
003_C08 Y5740_ARATH Uncharacterized glycosyltransferase Arabidopsis thaliana 4.00E-31
001_A02 XP_002510033.1 Ranched-chain amino acid aminotransferase Ricinus communis 1.00E-42
001_D07 ACT32032.1 Glycerol-3-phosphate acyltransferase Vernicia fordii 6.00E-83
001_G06 AAM75140.1 Alkaline alpha galactosidase II Cucumis melo 4.00E-41
1228-3_E10 XP_002513807.1 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase Ricinus communis 2.00E-17
003_A04 XM_002528581.1 Ubiquitin-protein ligase Ricinus communis 2.00E-20
001_G12 ACSF2_DANRE Acyl-CoA synthetase Danio rerio 4.00E-07
001_G12 XM_002519149.1 AMP dependent ligase Ricinus communis 4.00E-26
002_E12 ODBA_PANTR 2-oxoisovalerate dehydrogenase subunit alpha Pan troglodytes 4.00E-44
002_F01 XP_002524262.1 Malate dehydrogenase Ricinus communis 8.00E-39
001_E09 YP_538990.1 NADH dehydrogenase Gossypium hirsutum 2.00E-59
001_A11 ACCH1_ARATH 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase Arabidopsis thaliana 9.00E-30
003_H05 E135_ARATH Putative glucan endo-1,3-beta-glucosidase Arabidopsis thaliana 6.00E-38
001_B08 CAA74930 Class IV chitinase Arabidopsis thaliana 5.00E-12
003_C06 GDL87_ARATH GDSL esterase/lipase Arabidopsis thaliana 4.00E-24
003_F11 FTSH6_ARATH Cell division protease ftsH Arabidopsis thaliana 2.00E-21
003_F01 CLPS_SYNE7 TP-dependent clp protease adapter protein Synechococcus elonga-tus 6.00E-18
002_C06 AAB62937.1 Stress-induced cysteine proteinase Lavatera thuringiaca 2.00E-76
Contig45 AM402994.1 Partial trn7 gene for transposase Listonella anguillarum 1.00E-17
003_D10 CYPH_CATRO Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Catharanthus roseus 1.00E-43
003_B01 AL3I1_ARATH Aldehyde dehydrogenase family Arabidopsis thaliana 6.00E-64
002_E12 ODBA_PANTR 2-oxoisovalerate dehydrogenase Pan troglodytes 4.00E-44



图 7 基于 Gene Ontology的 uniEST分类
Fig. 7 Classification of uniEST on the basis of Gene Ontology

2042 作 物 学 报 第 36卷

表 2 KOBAS软件分析的部分干旱诱导代谢途径 a
Table 2 Representative drought-stressed metabolic pathways identified by KOBAS
KEGG代谢途径
KEGG pathway
定位到各代谢途径的 uniESTs数
No. of uniESTs located in various pathways
P值
P-value
Photosynthesis proteins 1 0
Photosynthesis 1 0
Phenylpropanoid biosynthesis 3 8.57E-08
Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 4 4.97E-07
Pyruvate metabolism 5 6.89E-07
Methane metabolism 3 2.30E-06
Phenylalanine metabolism 3 0.0001
Cysteine and methionine metabolism 3 0.0003
Fatty acid metabolism 3 0.0007
Reductive carboxylate cycle (CO2 fixation) 2 0.0008
Valine, leucine and isoleucine degradation 3 0.0008
Protein folding and associated processing 2 0.0020
Carbon fixation in photosynthetic organisms 2 0.0044
Selenoamino acid metabolism 2 0.0052
Citrate cycle (TCA cycle) 2 0.0078
Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 2 0.0143
Oxidative phosphorylation 3 0.0181
1,2-dichloroethane degradation 1 0.0204
Vibrio cholerae infection 2 0.0224
Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection 2 0.0312
PPAR signaling pathway 2 0.0312
Valine, leucine and isoleucine biosynthesis 1 0.0444
3-chloroacrylic acid degradation 1 0.0483
a P值大于 0.05的代谢途径没有列出。a Pathways with a P-value higher than 0.05 were not listed.

程中具有重要的调控作用, BZR1/BES1(003_G04)的
生化功能已经被确定 , 最近的研究表明 , BZR1/
BES1是一种具有调节 BR合成及下游生长反应双重
功能的转录抑制蛋白 (transcriptional repressor), 该
核蛋白调控 BR 稳态 (homeostasis)及信号转导。
BZR1 具有一个原先未知的 DNA 结合域, 它能与反
馈调节 BR 合成基因的启动子直接结合, 进而调控
基因的表达[38]。
在本研究中除了发现植物中已知的参与抗旱反
应相关酶和蛋白基因, 如脱水诱导蛋白(Contig9)、热
激蛋白(002_B03)、干旱诱导蛋白(003_A11), 抗氧化
防御系统中的过氧化物酶(POD, Contig13)、过氧化
氢酶(CAT, 1228-3_H10)、谷胱甘肽还原酶(GR, 002_
G06), 以及对组织脱水后直接保护的 LEA(Contig2)蛋
白等, 还发现了一个重要的抗旱基因, 即翻译控制
肿瘤蛋白基因(tcpc, 002_C04), 这是一类广泛存在
于动物、植物及酵母中, 在序列上高度保守且有很
高同源性的蛋白家族, 是由二个不同的研究小组分
别从人类乳腺癌组织、小鼠肉瘤细胞系和红白血病
细胞、SwiSS3T3细胞中发现的。其编码基因为 TPT1
(tumor protein translationally-controlled 1)。最初认为
TCTP 是一类生长相关蛋白, 近年的研究提示 TCTP
可能具有非常重要的抗逆、抗凋亡作用[39]。tcpc 目
前在植物中很少被研究, 只拟南芥中有研究报道。
研究人员在拟南芥中通过 RNA 干扰技术沉默 tcpc
基因, 发现在叶片伸展、根毛生长, 以及对生长素敏
感性等均下降[40]。
4 结论
成功构建了棉花抗旱 SSH 文库, 其中具有大量
与抗逆有关的基因, 直接与抗旱防御和保护有关的
有 30条, 还有参与信号转导和转录调节、结构和功
能代谢、跨膜转运、光合作用、催化活性、翻译后
修饰等间接抗旱的基因。从选出诸如苹果酸合成酶
第 12期 王德龙等: 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建及其抗旱相关基因分析 2043


基因(Ms1, 001_B03; Ms2, 003_E04)、苹果酸脱氢酶
基因(Md1, 001_C12; Md2, 002_F01)、锌指蛋白(zfp,
003_C06)、NAC、BZR1 和 BES1 等转录因子以及干
旱诱导基因 tcpc 等可作为以后克隆全长基因, 进行
转基因实验的备选基因。
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