全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(3): 365−375 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中国农业科学院作物科学研究所农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程开放课题资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 邱丽娟, E-mail: qiu_lijuan@263.net
第一作者联系方式: E-mail: wxbphd@163.com
Received(收稿日期): 2010-01-25; Accepted(接受日期): 2010-01-31.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00365
外源抗草甘膦 EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位
王晓波 1 蒋凌雪 1,2 魏 利 1 刘 林 1 陆 伟 3 李文欣 1 王 俊 1
陶 波 2 常汝镇 1 邱丽娟 1,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物种质资源引用与生物技术重点开放
实验室, 北京 100081; 2 东北农业大学, 黑龙江哈尔滨, 150030; 3中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081
摘 要: 通过基因特异引物扩增和免疫层析试纸法分别对转基因大豆中外源 EPSPs基因和其编码的蛋白进行检测，
结果表明, EPSPs基因不仅已整合到大豆基因组中, 而且 EPSPs蛋白可以正常表达。利用染色体步移法获得了转基因
大豆插入位点的侧翼序列, 序列比对表明 35S上游的大豆 DNA序列起始于 Gm02:7912740, NOS下游的大豆 DNA序
列起始于 Gm02:7777705。在本研究检测序列范围内发现插入位点两侧不同位置有 3个不同的未知片段、2个大豆基
因组序列倒位，同时发现 2个大豆基因组片段丢失。外源基因不是以点插入方式整合, 而是导致大豆基因组约 135 kb
片段的移位；NOS 下游大豆基因组序列发生重排，导致一个编码 HEC1 和 HEAT repeat 两个功能域的基因
(Glyma02g09790)结构受到影响, 首次发现该基因在 ABA 和 PEG 处理时下调表达，推测该基因通过 ABA 信号通路
参与胁迫应答。本研究通过对抗除草剂 EPSPs基因在大豆基因组中的插入位点分析, 明确了外源 EPSPs基因在大豆
基因组中的整合、定位及其侧翼序列, 为转基因大豆安全评价提供了依据。
关键词: 转基因大豆; 插入位点; 基因组; EPSPs; 抗草甘膦; 定位; 侧翼序列
Integration and Insertion Site of EPSPs Gene on the Soybean Genome in Ge-
netically Modified Glyphosate-Resistant Soybean
WANG Xiao-Bo1, JIANG Ling-Xue1,2, WEI Li1, LIU Lin1, LU Wei3, LI Wen-Xin1, WANG Jun1, TAO Bo2,
CHANG Ru-Zhen1, and QIU Li-Juan1,*
1 The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Germplasm Utilization / Institute of Crop Sci-
ences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 Northeast Agricultural University, Haribin 150030, China; 3 Biotechno-
logy Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: The detection of genetically modified crops (GMCs) is becoming both food labels and legal necessity. The aim of this
study was to identify integration and insertion locus of foreign EPSPs gene in genetically modified soybean for the safety assess-
ment of genetically modified crop. The EPSPs gene fragment was detected using gene specific primes and immunochroma-
tographic strip was used to detect the EPSPs protein. The result showed that the EPSPs gene was integrated into soybean genome
and EPSPs protein could be expressed normally. Genome walking was used to analyze the flanking sequences of both 35S pro-
moter and NOS terminator, and soybean genome database (Phytozome) was used to analyze the insertion site and study the effect
of the insertion on soybean genome. The Dra I and EcoR V restriction enzyme were found that they could be used to digest the
soybean genome completely, and the library with adaptor was established and nest PCR was used to amplify the flanking se-
quences of 35S and NOS genes in genetically modified soybean genome. The result showed that the start site of flanking region of
either 35S promoter or NOS terminator was Gm02:7912740 or Gm02:7777705, respectively, which means the foreign EPSPs
gene is not just insert into one position in soybean genome, resulting translocation of one 135 kb DNA fragment. Three different
unknown sequences and two opposite directional soybean DNA fragments were found at the flanking region of foreign EPSPs
gene cassette. We also found that there were high AT content (about 70%) and low gene density in 90 kb flanking regions of the
insertion locus, and one gene coding HEC1 and HEAT repeat domain (Glyma02g09790) was found to be rearranged. RT-PCR and
qRT-PCR showed that the gene was down-regulated during PEG and ABA treatment. In this study, we found the flanking se-
366 作 物 学 报 第 36卷

quence surrounding EPSPs gene in genetically modified soybean (GMS) was rearranged because of the insertion of foreign
EPSPs genes and one gene coding both HEC1 and HEAT repeat domain (Glyma02g09790) which may response to drought stress
through ABA signal pathway was identified for the first time.
Keywords: Genetically modified soybean; Insertion locus; Genome; EPSPs; Glyphosate-Resistance; Location; Flanking sequence
据来自国际农业生技产业应用服务中心(ISAAA)
的消息, 2008 年全球转基因作物的种植面积增加了
9.4%, 已达 1.25亿公顷, 相当于以往 13年增长的总
和。大豆仍是主要的转基因作物 , 2008 年种植面
积达 6 580万公顷 , 占全球转基因作物种植面积的
53%[1]。抗除草剂大豆自投入商业化种植以来, 由
于杂草治理便利化和高效率带来潜在利润的增加使
得它的种植面积持续扩大, 处于 4 个主要商业化种
植的转基因作物(大豆、玉米、棉花和油菜)之首。
然而, 在转基因作物带来巨大效益的同时, 关于转
基因食品的安全性及对生态环境的影响等问题一直
是关注的焦点。欧盟和美国、日本等国家先后出台
了相应的法律和管理方法, 对转基因食品实行强制
标识或自愿标识。挪威是第一个要求对转基因产品
进行含量标识的国家, 该国对转基因成分的限量标
识最低限为 2%; 欧盟和瑞士规定食品中基因修饰
成分超过 1%则必须进行标识; 日本的限量标识为
5%。我国于 2001年 5月 23日颁布了《农业转基因
生物安全管理条例》, 2002年 3月 20日开始实行的
《农业转基因生物标识管理办法》规定, 国家对农
业转基因生物实行检验检疫和标识制度。日前, 欧
盟已通过转基因作物试种知情权法案。转基因食品
的检测主要从两个方面入手, 一是核酸水平, 即检
测遗传物质中是否含有插人的外源基因; 二是蛋白
质水平, 即通过插人外源基因表达的蛋白质产物或
其功能进行检测。关于插入外源基因对受体基因表
达的影响鲜见报道。
国内外已有多种检测转基因作物中外源基因的
方法, 如竞争 PCR (competitive PCR)[2-5]、实时定量
PCR (Real-Time PCR)[6-7]、PCR-ELISA方法[8-9]、环
介导等温扩增检测技术等[10]。但上述这些方法均不
能明确插入外源 DNA 序列在植物基因组中的位置,
而这些信息在欧洲和美洲转基因食品安全评价中是
必需提供的资料[11-13]。我国在这方面的研究至今尚
未见报道, 因此, 开展转基因品种的外源基因插入
位点以及外源基因与受体基因组的整合研究, 对于
我国转基因安全评价具有重要意义。
染色体步移(Genome Walking)技术主要应用于
克隆启动子、鉴定 T-DNA或转座子的插入位点、染
色体测序工作中的空隙填补等方面[14], 在基因定位
方面也发挥了重要作用[15-16]。在前期的研究中, 我
们通过构建遗传分离群体的方法已经初步明确抗草
甘膦转基因大豆新品系 L08-001 的草甘膦抗性受单
基因控制, 定位结果表明外源基因位于大豆的 D1b
连锁群, 标记 BE475343、sat_373和 sat_211与目标
基因 EPSPs紧密连锁, 最小遗传距离为 3.4 cM (待
发表), 但外源基因在转基因大豆新品系 L08-001 染
色体上具体的插入位点尚不明确。本研究利用染色
体步移方法获得转基因大豆 35S启动子和NOS终止
子的侧翼序列, 根据大豆基因组网站(Phytozome)提
供的信息对获得的序列进行分析, 明确外源基因在
大豆染色体上的插入位点以及外源基因的插入对大
豆基因组的影响 , 并对转基因插入事件进行分析 ,
旨在为我国转基因大豆的安全评价提供信息。
1 材料与方法
1.1 供试材料
材料主要包括 L08-001、D01、M112和M113, 其
中 L08-001 是由转基因大豆 D01 与非转基因大豆
M112和M113经杂交和回交育成的抗草甘膦大豆新
品系。
1.2 外源目的基因的 PCR检测
利用 EPSPs基因特异引物 EPSPs-F: 5′-GCAAA
TCCTCTGGCCTTTCC-3′和 EPSPs-R: 5′-CTTGCCC
GTATTGATGACGTC-3′对上述材料中的 EPSPs 基
因进行检测[17], 明确外源基因是否已整合到大豆基
因组中。PCR反应采用降落 PCR(TD-PCR), 95℃变
性 30 s, 起始退火温度为 62 , 35℃ 个循环, 每循环降
低 0.3 , 72℃ ℃延伸 30 s, 其他步骤与正常 PCR相同。
1.3 EPSP蛋白的检测
利用免疫层析试纸法对样品的 EPSPs蛋白进行
检测。将样品磨碎并加入蛋白提取液提取, 溶解获
取蛋白。检测时, 先将样品垫浸在已提取好的蛋白
样品溶液中, 样品溶液在毛细吸收作用下由样品垫
沿 NC 膜向吸收垫流动。样品溶液中的特定蛋白在
流经结合垫时首先与其中胶体金标记的抗体发生抗
原-抗体的特异性的结合作用, 流经检测带时抗原-
抗体复合物被固定在检测带上的捕获抗体结合, 聚
第 3期 王晓波等: 外源抗草甘膦 EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位 367


集形成肉眼可见的金标条带 , 显示检测结果为阳
性。过量的金标抗体继续流动被固定在控制带上的
第二抗体结合聚集形成条带 , 显示检测的结果有
效。
1.4 外源基因在大豆基因组中插入位点分析
取 5 μg的基因组 DNA分别用 100 U的限制性
内切酶 Pst I、Dra I、Pvu I和 EcoR V 酶切, 总体积
500 μL于 1.5 mL管中 37℃过夜, 直至基因组充分酶
解; 将酶切消化的 DNA 片段用酚∶氯仿(1 1)∶ 抽提
2次, 70%酒精洗 1次, 沉淀后溶解在 20 μL的重蒸
水中, 电泳检测酶切效果, 选择酶切产物弥散且均
匀分布的 Dra I产物构建文库用于染色体步移分析。
根据酶切位点的核苷酸序列合成寡核苷酸制作
接头。将 50 μmol L−1长接头引物[18](Long adapter:
5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGT
CGACGGCCCGGGCTGGT-3′)和短接头寡核苷酸引
物(Short adapter: 5′-PO4-ACCAGCCCGGGCC-NH2-
3′, 5′端磷酸化和 3′端氨基化, 以提高连接效率, 降
低非特异性扩增)加到一个 0.5 mL 管中, 在 95℃温
育 5 min, 转移到 70℃在 2 h内冷却到室温并于 4℃
放置过夜。将 4 μL酶解 DNA片段产物加入 200 μL
管中, 然后加 1.9 μL相对应的接头和 1.6 μL 10×连
接缓冲液, 接着加 0.5 μL T4连接酶, 16℃连接过夜。
最后, 连接产物放置在 70℃中 5 min 以终止反应,
并加入 72 μL的重蒸水稀释以形成带接头的核基因
组酶解 DNA片段文库。
第一轮 PCR所用的引物是接头引物 AP1 (引物
序列: 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)和基
因特异性引物 GSP1 (35S GSP1: 5′-TGCGAAGGATA
GTGGGATTGTGCGTCA-3′; NOS GSP1: 5′-GAATC
CTGTTGCCGGTCTTGCGATGATT-3′), 1 μL上述文
库作为模板, 经 94 40 s, 60 30 s, 72 3 min, ℃ ℃ ℃ 进
行 30 个 PCR 循环。第二轮扩增的引物是接头引物
AP2 (5′-ACTATAGGGCACGCGTGGTC-3′)和基因
特异引物 GSP2 (35S GSP2: 5′-TGATGGCATTTGT
AGGAGCCACCTTCCT-3′; NOS GSP2: 5′-TAGCGC
GCAAACTAGGATAAATTATCGC-3′), 用 1 μL 100
倍稀释的第一轮 PCR产物作为模板, 退火温度提高
到 65 , ℃ 其他步骤与第一轮相同。
1.5 外源基因的插入对大豆基因组的影响分析
为了进一步验证和分析转基因大豆外源基因插
入事件, 首先将染色体步移获得的插入位点外侧的
大豆DNA序列在大豆 Phytozome数据库中进行比对
分析, 明确外源基因插入位点两侧相邻大豆DNA序
列在基因组中的具体位置, 并根据获得的序列设计
3对引物(表 1)，分别对外源基因序列插入位点两侧
(35S上游和 NOS下游)相邻位置及受影响 NOS下游
的大豆基因组序列进行特异 PCR分析, 验证染色体
步移获得的序列结果。
特异 PCR 的反应程序采用降落 PCR(TD-PCR):
95℃变性 30 s, 退火温度为 62 , 35℃ 个循环, 每循环
降 0.3 , 72℃ ℃延伸 40 s, 循环后 72℃延伸 8 min。

表 1 验证外源 EPSPs基因插入位点及侧翼序列的特异 PCR引物
Table 1 Special PCR Primers for confirmation of insertion and flanking region sequence around foreign EPSPs gene
引物名称
Name of primer
上游引物序列
Forward primer sequence (5′−3′)
下游引物序列
Reverse primer sequence (5′−3′)
检测位置
Detection position
目的片段大小
PCR fragment
size (bp)
Insert2 TTTATCAAGCGGCAAGTCAA GTGCAAATTATTCAAACCCT 35S上游
Upstream insertion site of 35S
230
Insert1 TTCGTATTGTAATCTCCCTCA TCGCCTCAAACAGTTCTTCT NOS下游
Downstream insertion site of NOS
275
NOS-BD GTCATCAATACGGGCAAGGC TTCACTGGCATACGAACAAT NOS下游重排序列
Rearrangment of downstream flanking
sequence to NOS
1154

1.6 Glyma02g09790基因的检测及其表达分析
1.6.1 Glyma02g09790 基因在转基因和非转基因大
豆中的检测 利用 Glyma02g09790基因序列分别
设计了的特异 PCR 引物(表 2)对转基因和非转基因
大豆进行检测(引物 Glyma02g09790.1用于扩增基因
第 1~2 外显子; 引物 Glyma02g09790.2 用于扩增基
因第 11~13外显子), PCR反应程序均采用降落 PCR
(TD-PCR), 95℃变性 30 s, 起始退火温度为 62 , 32℃
个循环, 每循环降低 0.3 , 72℃ ℃延伸 40 s, 循环后
72℃延伸 10 min。
1.6.2 Glyma02g09790 基因的半定量 RT-PCR
为研究 Glyma02g09790 基因的表达特性, 分别
提取非转基因大豆全苗、根、茎、叶、花、经胞囊
线虫处理 6 d的根、100 μmol L−1 ABA处理 6 h、200
mmol L−1 NaCl处理 6 h和 20% PEG6000处理 6 h的
大豆植株 RNA (TaKaRa 公司的 RNA 提取试剂盒),
368 作 物 学 报 第 36卷

表 2 Glyma02g09790基因特异 PCR引物
Table 2 Specific primer for Glyma02g09790 gene
引物名称
Primer name
上游引物序列
Forward primer sequence (5′−3′)
下游引物序列
Reverse primer sequence (5′−3′)
检测类型
Detecting type
目的片段大小
PCR fragment size (bp)
DNA 787
Glyma02g09790.1 ATGGACGTGGAGAGATCTTCGCTGT ATATCTTCTTGAGCCAAACG
cDNA 293
DNA 317
Glyma02g09790.2 CGACCTGATGAACAACAAAG GAGCAACAAGCAGTCTACGC
cDNA 151

利用 Promega 公司生产的反转录试剂盒合成 cDNA
(详细反应步骤可参见公司网站 http://www.takara.
com.cn/和 http://www.promega.com.cn/), 利用基因
特异引物进行 PCR扩增, 大豆核糖体 18S rRNA基
因为 RT-PCR 反应的内标, 内标引物为 F: 5′-CCTT
GCTTGTTGCTTTACTAAATAG-3′, R: 5′-ATGCAC
CTTTTCGTTTGTTTCGGAG-3′, 反应程序为: 95℃
变性 30 s, 58℃退火 30 s, 72℃延伸 40 s, 28个循环,
最后一轮 72℃延伸 8 min。
1.6.3 Glyma02g09790基因的定量表达分析(qRT-PCR)
对该基因在半定量 RT-PCR 中差异表达的两
个处理(20% PEG6000和 100 μmol L−1 ABA)进行实
时荧光定量表达分析(qRT-PCR), 实验采用 SYBR
Green I荧光染料法, PCR反应体积为 20 μL, 其中包
括 1×SYBR Green I Real-Time PCR Master Mix (购
于 TaKaRa公司), 引物 0.4 μmol L−1, 在 ABI公司的
7300定量 PCR仪上进行, 反应程序为: 95 , 1 min; ℃
95 , 15 s, 60 , 1 min, ℃ ℃ 延伸 72 , 31 s, 40℃ 个循环,
并在循环的延伸阶段实时采集荧光, 每个反应重复
3次。数据处理利用 2−∆∆Ct法计算基因的相对表达量。
2 结果与分析
2.1 EPSPs基因插入大豆基因组
利用 EPSPs 特异引物对外源基因进行检测, 在
转基因大豆新品系 L08-001及其供体亲本 D01中均
检测到目标片段, 而阴性对照(水)和非转基因材料
(M112 和 M113)中均没有扩增出目标基因(图 1), 说
明外源基因已经整合到大豆基因组中。
通过双抗夹心法方法(即单抗-抗原-单抗), 并以
胶体金聚集显色这一物理显色过程检测抗原活性
(图 2), 在转基因大豆 L08-001和 D01中均检测到目
标基因 EPSPs 编码蛋白(图中箭头), 而在非转基因
大豆品种 M112 和 M113 中均没有检测到目标基因
EPSPs 编码蛋白, 表明外源基因在转基因材料中已
经正常表达。

图 1 转基因和非转基因大豆材料中 EPSPs基因的检测结果
Fig. 1 PCR products of EPSPs gene from GMO and non-GMO
M: 100 bp DNA ladder; 1: 阴性对照(水); 2: D01; 3: M112;
4: M113; 5: L08-001。
M: 100 bp DNA ladder; 1: negative control (water); 2: D01;
3: M112; 4: M113; 5: L08-001.

图 2 转基因和非转基因大豆 EPSPs蛋白的检测(箭头表示
EPSPs蛋白)
Fig. 2 Detection of EPSPs protein from GMS and non-GMS
(arrows show the protein of EPSPs)

2.2 外源基因的插入对大豆基因组的影响
2.2.1 转基因大豆 35S和 NOS侧翼序列的获得
利用 4种内切酶对 D01和 L08-001基因组进行
酶切, 电泳检测结果表明 Dra I和 EcoR V可以将基
因组完全消化(图 3)。选择 Dra I完全消化的大豆基
因组与接头进行连接, 构建带有接头的大豆基因组
文库, 用于巢式 PCR反应。
利用 35S 启动子和 NOS 终止子特异 PCR 引物
(GSP1)和接头引物 AP1 组合对上述文库进行扩增
第 3期 王晓波等: 外源抗草甘膦 EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位 369


(图 4), 由图 4 可以看出, 35S 与 AP1 的主要扩增产
物长度小于NOS和AP2的扩增产物的长度, 且二者
的扩增产物均呈弥散状, 需要进行第二轮巢式 PCR
扩增。

图 3 大豆基因组用 Pvu I、Dra I、Pst I和 EcoR V酶切消化的
检测结果
Fig. 3 Digestion of soybean genome using four restriction
enzymes of Pvu I, Dra I, Pst I, and EcoR V
M: 100 bp DNA ladder; 2和 4表示被内切酶 Dra I和 EcoR V完
全消化的转基因大豆 D01和 L08-001大豆基因组。
M: 100 bp DNA ladder; 2 and 4 show the completely digested re-
striction enzyme D01 and L08-001 genome by Dra I and EcoR V
respectively.

图 4 染色体步移的第一轮 PCR扩增
Fig. 4 First round PCR for genome walking
M: 100 bp DNA ladder; 1: D01 35S; 2: L08-001 35S; 3: D01 NOS;
4: L08-001 NOS.

利用 35S和NOS基因的巢式引物(GSP2)和接头
引物 AP2 组合以第一轮 PCR 扩增结果为模板进行
PCR扩增(图 5), 可以发现 35S-GSP2与 AP2扩增出
长度约为 300 bp的片段, 而 NOS-GSP2与 AP2扩增
的产物长度约为 1.3 kb, 将目标片段切胶回收并测
序。
2.2.2 外源基因的插入导致大豆基因组 DNA 发生
片段重排 将获得的序列在大豆基因组数据库中
(Phytozome)进行比对, 并对序列结构进行分析。结
果表明 , 35S 上游扩增出的片段中的序列来源于
Gm02: 7912958~7912740, 与 NOS 下游获得的序列
间隔达 135 kb (图 6)。NOS下游获得序列包括 68 bp
NOS终止子序列、254 bp EPSPs基因片段、3段大
豆 DNA序列(分别来源于 Gm02: 7777705~7777344、
Gm02: 7752726~7753007和Gm02: 7752684~7752543),
此外还发现 2 段来源未知的序列, 其中“unknown2”
长 168 bp, “unknown3”长 41 bp。序列分析表明, NOS
下游 3 段来源于大豆基因组的序列中, 第 2 段序列
与其他 2段序列位于不同的DNA编码链(方向不同),
与第 1段序列的物理距离为 24 kb, 表明在插入位点
附近大豆基因组发生了 DNA重排。

图 5 染色体步移的第二轮 PCR扩增
Fig. 5 Second round PCR for genome walker
M: 100 bp DNA ladder; 1: D01 35S; 2: L08-001 35S; 3: D01 NOS;
4: L08-001 NOS.

为进一步检测插入位点, 用插入位点两侧设计
的两对引物(Insert1和 Insert2, 图 7-A)扩增, 在非转
基因大豆品种 M112 和 M113 中扩增出了目标片段,
在转基因材料中没有扩增出目标片段, 说明转基因
大豆中该位点受到了影响。为验证侧翼序列的准确
性 , 根据染色体步移获得的 DNA 序列设计引物
(NOS-BDF和 NOS-BDR, 图 7-B)对转基因和非转基
因材料进行扩增, 结果只在转基因材料中扩增出了
目标片段, 且片段长度与预期吻合, 说明染色体步
移获得的序列是可靠的(图 7-B)。
2.2.3 外源基因插入位点附近基因组 DNA 碱基含
量 对外源基因插入位点的侧翼序列 AT 含量进
行分析 , 结果表明 , 35S 上游序列中 AT 含量为
75.34%, NOS下游序列中AT总含量为 71.57%, 可见
EPSPs插入位点两侧序列所在的 90 kb范围内 AT碱



图 6 转基因大豆与非转基因大豆在第 2号染色体上的序列比对
Fig. 6 Sequences alignment between the GMS and non-GMS in chromosome 2
绿色方框表示大豆基因组 DNA; 红色方框表示未知来源的序列; 方框内数字表示片段的长度, 箭头表示序列的方向; 方框外的数字表示片段在大豆基因组中的具体位置;
图中标示了引物所在的具体位置及扩增区域。
Green boxes show the soybean genome DNA; red boxes show the sequence which the origin is unknown; arrows show the direction of genes; number in the box shows the length of the sequence, while the
number out of the box shows the exact position of the gene in soybean genome, and the position of the primer used in the study was also marked in the figure.

第 3期 王晓波等: 外源抗草甘膦 EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位 371



图 7 EPSPs插入位点(A)及 NOS下游侧翼序列(B)的检测
Fig. 7 Detection of insert site (A) of EPSPs and its flanking sequence downstream of NOS (B)
M: 100 bp DNA ladder; N: 阴性对照(水); 1和 5: M112; 2和 6: M113; 3和 7: D01; 4和 8: L08-001。
M: 100 bp DNA ladder; N: negative control (water); 1 and 5: M112; 2 and 6: M113; 3 and 7: D01; 4 and 8: L08-001.

基含量均较高, 都在 70%左右; 35S 上游 DNA 序列
所在的 90 kb 范围内平均基因密度为千个碱基对
0.078个, 而 NOS下游 DNA序列所在 90 kb范围内
的平均基因密度为千个碱基对 0.170个(图 8)。
2.2.4 外源 EPSPs基因的插入对大豆编码基因的影响
根据已公布大豆基因组序列分析发现 EPSPs 基

图 8 35S(A)和 NOS(B)两侧基因组 DNA的 AT含量和基因密度
Fig. 8 AT content and gene density of genome DNA adjacent 35S promoter (A) and NOS terminator (B)
372 作 物 学 报 第 36卷

因的插入导致Gm02: 7912740~7777705区域(135 kb)
在转基因大豆基因组内移位, 这个区域共有 11个注
释有功能的基因(Phytozome), 从中随机检测了 3 个
基因(基因名称分别为 Glyma02g09930、Glyma02g1-
0000和Glyma02g09950), 用其各自基因特异引物在
转基因和非转基因大豆中均可以检测到目标基因。
然而, NOS下游序列中由于基因组 DNA重排导致一
个基因 Glyma02g09790 的结构受到影响 , 该基因
5′UTR 和第 1 外显子被重新排列。序列分析表明, 非
转基因大豆中该基因全长 8 560 bp, 包含 23个外显子
和 22个内含子, 编码 1 160个氨基酸, 其中 200~350
位氨基酸编码HEC1结构域, 914~950位氨基酸编码一
个 HEAT repeat结构域, 与拟南芥 AT5G16210基因编
码氨基酸的相似性为 65%。对该基因编码蛋白的磷酸
化位点进行预测, 共发现 60 个可能的磷酸化位点
(NetPhos 2.0), 其中可能被磷酸化的 Ser基团 43个、
Thr基团 12个、Tyr基团 5个(图 9), 表明磷酸化可能
是该基因翻译后调控的一个重要方式。

图 9 Glyma02g09790基因编码蛋白磷酸化位点预测
Fig. 9 Predicted phosphorylation sites in the Glyma02g09790 protein

由于受影响的是基因的 5′UTR 和第 1 外显子,
利用位于第 1 和第 2 外显子上的基因特异引物进行
检测, 结果在非转基因大豆 M112 中可以检测到该
基因及其表达产物, 而在转基因大豆 L08-001 中没
有检测到基因组 DNA序列及其表达产物(图 10), 表
明外源基因的插入导致转基因大豆中 Glyma02g-
09790 基因的结构发生改变。然而对该基因未受重
排影响的区域 (第 11~13外显子 )进行检测时发现 ,
在转基因和非转基因材料中均可检测到相同的基因
组DNA序列及转录本, 转录本的测序结果表明转基
因大豆中 Glyma02g09790基因内含子的剪切方式与
非转基因大豆 Glyma02g09790 基因完全相同, 说明
虽然转基因材料中 Glyma02g09790基因的结构发生
改变, 但该基因仍然可以表达。

图 10 转基因(L08-001)和非转基因(M112)大豆中 Glyma02g09790基因的检测
Fig. 10 Detection of Glyma02g09790 gene in transgenic (L08-001) and non-transgenic (M112) soybean
第 3期 王晓波等: 外源抗草甘膦 EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位 373


半定量 RT-PCR研究表明, 该基因在大豆的根、
茎、叶和花中均有表达, 其中在大豆胞囊线虫和盐
胁迫处理下该基因的表达未受影响 , 但 20%
PEG6000 渗透胁迫下该基因的表达受到抑制 (图
11)。利用实时荧光定量 PCR 研究表明, 在 ABA 处
理 6 h后该基因的表达量比对照下降了 50%, 而 20%
PEG6000模拟干旱胁迫 6 h后该基因的表达量只有
对照的 20% (图 12), 说明该基因的表达受干旱胁迫
调控, 并且可能通过 ABA信号通路参与胁迫应答。

图 11 Glyma02g09790基因的半定量表达分析
Fig. 11 Expression analysis of Glyma02g09790
ROOT和 CK表示 02g09790和大豆 18S rRNA基因在未处理的
非转基因大豆的根和全苗中的表达, SCN inoculation、NaCl
和 PEG6000分别表示基因在受胞囊线虫侵染的根中、200 mmol
L−1 NaCl和 PEG6000处理后的苗中的表达。
ROOT and CK show the 02g09790 and soybean 18S rRNA gene
expression in non-transgenic soybean root and seedling; SCN in-
oculation, NaCl and PEG6000 show the gene expression pattern in
the root inoculated by Heterodera glycines, seeding dealed with 200
mmol L−1 NaCl, and PEG6000, respectively.


图 12 非转基因大豆中 Glyma02g09790基因在干旱和 ABA胁
迫下的定量表达分析
Fig. 12 Quantitative expression pattern of the gene under
drought and ABA in non-transgenic soybean

3 讨论
本研究通过 PCR扩增和体外蛋白检测表明, 外
源 EPSPs基因已经整合到大豆品种的基因组并且已
正常表达。田间除草剂喷洒鉴定结果表明, 2个转基
因大豆 D01和 L08-001在 8倍和 10倍的除草剂条件
下均能正常生长, 与非转基因亲本相比表现出较高
的除草剂抗性。利用染色体步移方法扩增出转基因
大豆中外源基因 EPSPs 的 35S 上游和 NOS 下游的
大豆基因组 DNA 序列, 发现在 NOS 下游检测到重
新排列的大豆基因组 DNA序列。为验证这些序列的
可靠性, 作者分析了序列的酶切位点, 发现发生变
化序列中没有 Dra I 酶切位点, 说明重排序列并非
酶切片段的自连接。此外, 在 NOS下游重排位点的
两侧用特异引物进行检测, 验证了染色体步移获得
序列的正确性。由于 35S上游和 NOS下游序列大豆
基因组序列相距 135 kb, 对这段序列内的 3 个基因
进行特异 PCR均可检测到期望的产物, 推测外源基
因在整合进大豆第 2 号染色体时, 导致大豆基因组
相关 DNA 序列的重排。Forsbach 等[19]在转基因拟
南芥的系统研究中也发现 , 在多数情况下单拷贝
T-DNA 插入伴随有基因组的重排发生, 出现目的位
点序列的删除或复制、T-DNA序列的部分删除或复
制以及染色体上的变化(如易位及倒位的发生)等 ,
但也有研究表明这种修饰作用对目的基因的表达并
无影响[20-21]。
在人类基因组内, GC的含量大约为 40%, 这些
GC 并不是平均分布在基因组内, 在某些 DNA 片段
上其含量可高达 60%以上, 而在另一些区域则只有
33%左右。这种 GC含量的差别, 在基因表达的调控
和基因突变上都可能扮演着重要的角色。例如, 在
基因的末端通常存在一些富含双核苷酸“CG”的区
域, 称为“CpG岛”(CpG island)。在人类基因组内, 存
在有近 3 万个 CpG 岛, 在大多数染色体上, 平均每
100万碱基含有 5~15个 CpG岛, 其中有 1.8万多个
CpG岛的 GC含量为 60%~70%。通常, 这些 CpG岛
不仅是基因的一种标志, 而且还参与基因表达的调
控和影响染色质的结构。与此相反, 有研究表明植
物基因组中富含 AT 的序列常作为重组热点[22-23]。
左开井等[22]利用 Tail-PCR的方法对不同来源的转基
因抗虫棉中外源基因插入区的侧翼序列进行了分析,
发现不同来源的转基因品种外源基因插入的上游侧
翼序列含有一段残留质粒片段, 外源基因插入的下
游侧翼片段为富含 AT 碱基结构。本研究也发现了
相同的结果，不同的是,本研究不仅在外源 EPSPs基
因插入的上游侧翼序列了发现了未知片段，在其下
游侧翼序列中也发现了未知片段；除外源基因插入
的下游侧翼片段为富含 AT碱基(71.57%)结构外, 其
上游侧翼片段为也富含AT碱基, 35S上游序列中AT
含量高达 75.34%; 且这些区域的基因密相对较低,
推测外源基因 EPSPs的插入位点可能与基因组中的
重组热点区域有关。
本研究对利用染色体步移从 D01和 L08-001中
扩增获得的目标片段的序列比较发现, 不同材料中
374 作 物 学 报 第 36卷

得到的长度相同的目标片段序列也相同。由于
L08-001 是 D01 与 M112 杂交后连续多代回交并通
过定向选择选育而成的抗草甘膦转基因大豆新品系,
也就是说 L08-001 的草甘膦抗性来源于 D01, 表明
常规育种采用的有性杂交未影响外源基因插入位点
的侧翼序列, 外源基因插入导致的基因组序列的改
变是可遗传的。因此可以通过检测外源基因的插入
位点和重排的基因组序列判断转基因材料的来源 ,
进而通过建立包括外源基因插入位点和 DNA 重排
等信息的数据库对转基因材料进行搜集、保存和评
价。
本研究发现外源基因的插入导致了一个编码
HEC1 和 HEAT repeat 功能域的基因结构受到影响,
大豆基因组中该基因存在 2个拷贝(Pytozome), 为
区分不同的拷贝 , 我们设计了第 2号染色体上特异
引物并对其进行检测。结果发现, 虽然基因结构发
生了改变, 但该基因仍可表达, 且内含子的剪切模
式没有发生改变, 说明植物基因组中可能存在某种
修复机制, 可以修复受损伤的基因结构, 维持基因
的正常转录, 稳定基因的功能。研究发现 HEC1 功
能域与细胞分化、染色体分离有关, 可以与 SMC蛋
白互作, 而 HEAT repeat 功能域与酵母的蛋白酶体
活性的调节有关[24], 本研究首次发现该基因可能在
ABA 信号通路中参与干旱胁迫应答, 由于该基因存
在 60个可能的磷酸化位点, 磷酸化可能是其翻译后
的重要修饰方式, 因此结构改变对基因的翻译后修
饰以及对转基因大豆生理、生化水平的影响有待进
一步研究。
4 结论
外源 EPSPs基因已整合到大豆基因组中并能正
常表达, 插入位点位于大豆第 2 号染色体。外源基
因 EPSPs 插入导致大豆基因组大片段移位, 并导致
一个编码 HEC1和 HEAT repeat功能域、在 ABA信
号通路中参与干旱胁迫应答的基因结构受到影响。
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