全 文 ：第 29 卷 第 1 期 作　物　学　报 V o l. 29, N o. 1
2003 年 1 月　 44～ 48 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 44～ 48　 Jan. , 2003
水稻转基因整合模式中外源基因的遗传规律Ξ
华志华　朱雪峰　吴明国　于彦春　赵　艳　高振宇　颜美仙　钱　前　
黄大年3
(中国水稻研究所农业部水稻生物学重点实验室, 浙江杭州 310006)
摘　要　通过对低拷贝数的转基因株京引 119 的世代连续跟踪分析以及高世代材料的群体遗传分析表明, 共转化基因
bar 和 cecrop in B 在基因组中紧密连锁并能稳定的遗传和表达。来自于转基因嘉 59 和丙 9363 的两高世代抗除草剂材料
TR 5 和 TR 6 的杂交后代分析结果显示, 多拷贝的 bar 基因以单基因表型性状传递, 两材料中的 bar 基因互不等位。
TR 5 基因组中, 多插入位点的 bar 和 cecrop in B 基因在遗传转育过程中发生基因片断丢失, 但此片段不影响转基因的
表达。表明转基因事件中, 表型性状的稳定和转基因多插入位点的纯合互不一致。
关键词　水稻 (O ry z a sa tiva L. ) ; cecrop in B ; bar; 遗传; 表达部分插入位点
中图分类号: S512　　　文献标识码: A
Inher itance of Exo-genes In tegra ted in to the R ice Genom es
HUA Zh i2H ua　ZHU Xue2Feng　W U M ing2Guo　YU Yan2Chun　ZHAO Yan　GAO Zhen2Yu
YAN M ei2X ian　Q IAN Q ian　HUAN G D a2N ian
(B iotechnology D ep artm en t, Ch ina N ationa l R ice R esearch Institu te and K ey L abora tory f or R ice B iology , M inistry of A g ricu ltu re, H ang z hou
310006, Ch ina)
Abstract　Co2t ran sfo rm ed genes, ba r and cecrop in B , w h ich in tegra ted in the genom e of J ingyin 119 w ith
low cop ies, w ere detected to be linkage and inherit and exp ress stab ly am ong differen t genera t ion s. How 2
ever, acco rd ing to the cro ss betw een TR 5 and TR 6, tw o h igh BA STA resistan t genera t ion s self po llina ted
from tran sgen ic J ia59 and B ing9363, the ba r genes of m u lt i2in serted loci w ere no t a lleic. Som e ba r o r ce2
crop in B genes m igh t lo se du ring the m u lt ip lica t ion of t ran sgen ic p lan ts, bu t lo ss d id no t affect the exp res2
sion of the tran sgene. So the pheno type stab ility cou ld no t suggest tha t the m u lt i2in serted loci of t ran s2
genes w ere hom ozygou s.
Key words　R ice (O ry z a sa tiva L. ) ; cecrop in B ; ba r; H ered ity; Inheritance
　　植物转基因技术已成为一项将外源基因导入受
体基因组中行之有效的方法。如今, 无论是基因枪
转化还是农杆菌转化, 在水稻的基因转化技术上已
日益成熟。但是外源基因在宿主基因组内的稳定遗
传和表达一直令人关注。90 年代初发现的基因沉
默现象被认为是转基因技术实用化的一道障
碍[ 1～ 3 ]。抗除草剂基因 ba r 在大部分 T 1 代材料中表
现出典型的孟德尔分离规律[ 8 ] , 也有部分转基因事
件中表现出异常的孟德尔分离规律[ 9 ]。本文利用基
因枪转化获得的 ba r 和 cecrop in B 共转化株为材
料, 通过单株稻茬连续跟踪、高世代群体分析以及
杂交分离试验, 研究了共转化基因在世代传递中的
稳定性。
1　材料与方法
1. 1　材料
水稻品种为京引 119、嘉 59、秀水 63。转化质
粒为 pCB l[ 4 ] , 酶切图谱如图 1 所示。Ξ 基金项目: 浙江省自然科学基金 (398227)和浙江省生物技术重点攻关项目 (961102216)资助项目。
作者简介: 华志华 (19712) , 男, 浙江富阳人, 硕士, 助研, 研究方向: 分子生物学
　 3 通讯联系人。A utho r fo r co rrespondence. E2m ail: cnrrgene@fy. hz. zj. cn
Received on (收稿日期) : 2002203205, A ccep ted on (接受日期) : 2002206209

图 1　　质粒 pCB l(6. 9 kb)酶切图谱
A ct, 水稻 actin21 启动子; ab, cecrop in B 编码序列; P in, 马铃薯蛋白酶抑制剂Ê 终止子;
35S, 烟草花叶病毒 35S 启动子; bar, bar 基因编码序列; nos, 胭脂碱合成酶终止子。
F ig. 1　　L inear restrict ion m ap s of p lasm id pCB l(6. 9 kb) used in co transfo rm ation experim ents. A ct, rice actin21 p romo ter,
ab, cecrop in B gene encoding sequence; P in, po tato p ro teinase inh ib ito r Ê term inato r; 35S, cau liflow er
mo saic virus (CaM v) 35S p romo ter; bar, bar gene encoding sequence; nos, A .
tum ef aciens T i2p lasm id nopaline synthase term inato r.
1. 2　转化方法
基因枪转化, 转化参数按L i 等[ 5 ]方法略有改
动。
1. 3　遗传分析
转基因京引 119 通过严格自交繁殖, 建立第 1
代至第 6 代系谱材料 (编号 24～ 39) , 保留各代稻茬
以分析转基因在世代传递过程中的稳定性。第 5 代
单株收种子作为第 6 代群体研究用材料, 分析共转
化基因的连锁规律。转基因嘉 59 和秀水 63 的高世
代抗除草剂BA STA 的稳定材料为 TR 5 和 TR 6,
通过杂交, 研究多插入位点转基因的等位性和遗传
规律。
1. 4　Southern -blot 和 Northern -blot 分析
用CTAB 法提取水稻总DNA [ 6 ]。RNA 提取参
照 T rizo l 试剂盒说明。B a r 基因的 Sou thern 和
N o rthern 杂交分析按文献[ 7 ]。B a r 探针取质粒
pCB l 经 E coRV 酶切电泳回收的 0. 9 kb 片段, ce2
crop in B 探针为质粒 pCB l 经 P stÉ 和 H indË 双酶
切后电泳回收的 1. 12 kb 片断, 按D IG DNA L a2
beling K it (Roche)进行D IG2dU T P 标记。杂交与检
测按D IG L um inescen t D etect ion K it (Roche)进行。
2　结果与分析
2. 1　转基因遗传稳定性分析
从转基因京引 119 及其 6 个世代的 Sou thern2
b lo t 分析结果看出 (图 2) , ba r 和 cecrop in B 在转基
因京引 119 基因组中大约有两个拷贝, 分别插入两
个位点, 而且在基因的传递过程中表现为完全一致
的杂交图谱, 无论是插入位点还是转基因的预期片
断在不同的世代个体中完全相同。此结果表明共转
化基因 ba r 和 cecrop in B 在转基因京引 119 基因组
表现出稳定的遗传。图 2 还表明, 基因组DNA 经
过双酶切后除释放出预期的片段外 [ 0. 9 kb (E ) 和
1. 12 kb (F ) ], 另外还有一条额外的杂交带。说明
转基因整合的两个拷贝中, 有一个拷贝发生重组修
饰而得不到预期长度的片段。
2. 2　共转化基因连锁分析
在转基因京引 119 第 6 代群体中, 发现不同个
体间 ba r 和 cecrop in B 的 Sou thern 杂交模式一致
(图 3) , 说明共转化基因在后代遗传中发生稳定纯
合。结合图 2 的研究结果, 进一步证实通过基因枪
转化可以获得稳定遗传的共转化转基因纯合体植
株。
2. 3　转基因稳定表达分析
已有研究表明转基因容易发生转录和转录后抑
制, 导致在宿主细胞质中很难检测到目的m RNA
的存在[ 2, 3 ]。N o rthern2b lo t 分析可以反映转基因是
否在宿主细胞中进行正常的表达。图 4 表明, ba r
和 cecrop in B 基因在转基因京引 119 T 0、T 1、T 3 和
T 6 代均得到转录, 说明两者在世代传递过程中不
仅得到稳定的传递而且得到稳定的表达, 没有发生
基因沉默。图 4 还表明, 随着世代的增加, m RNA
水平有所下降。但尚不能肯定随着世代的增加, 转
基因表达水平下降, 还需要延长世代作进一步
N o rthern2b lo t 研究。根据我们对此材料的 T 10代对
除草剂BA STA 的抗性稳定水平判断, 两者似乎不
存在这种关系。因此图 4 的结果可能是实验误差所
致。
2. 4　多插入位点转基因的等位性和遗传规律
从 TR 5、TR 6 和 TR 5öTR 6 的 F 1 代植株叶片
中提取DNA , 进行 Sou thern 杂交分析结果表明 (图
5) , ba r 和 cecrop in B 基因已被整合到TR 5、TR 6 的
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图 2　　基因组DNA Southern2blo t 分析。基因组DNA 分别
用 P stÉ (A , B)、H indË (C, D )、Eco RV (E) 和 H indË 2P stÉ (F) 酶切, 分别与 bar 基因和 cecrop in B 基因探针进行杂
交。23～ 29: 转基因京引 119 当代转化株及其T 1～ T 6 共 6 个
世代的稻茬。U T: 非转基因对照; M : 标准分子量。
F ig. 2　　Southern b lo ts of genom ic DNA from transgenic
p lan ts co transfo rm ed w ith cecrop in B and bar genes. DNA
w as digested w ith P stÉ (A , B) , H indË (C, D ) , E co RV (E)
and H indË 2P stÉ (F). T he blo ts w ere p robed w ith bar and
cecrop in B specific fragm ent. L anes 23～ 29: T 0 t ransfo rm ants
of JY119 and 6 differen t generation stubbles from T 1 to T 6.
U T , untransfo rm ed negative contro l: w ild2type rice p lan t;
M , DNA mo lecu lar w eigh t m arker Ë (Roche).
图 3　　转基因京引 119 T 6 代群体遗传分析。基因组DNA
用 P stÉ 酶切, 分别与 bar 基因和 cecrop in B 基因探针进行杂
交。a2j: 转化体 23 T 6 代随机选择个体。转基因京引 119 当代
转化株及其T 1～ T 6 共 6 个世代的稻茬。U T: 非转基因对照;
M : 标准分子量。1c, 5c o r 10c 相当于水稻单倍体基因组中含
有 1, 5, 10 个拷贝 bar 或者 cecrop in B 基因的杂交信号
F ig. 3　　 Inheritrance analysis of T 6 p rogeny of transfo rm ant
JY119. DNA w as digested w ith P stÉ , and the sam e blo t w as
p robed first w ith bar specific fragm ent, then stripped and
rep robeded w ith cecrop in B specific fragm ent. L anes a2j: ran2
dom selected p lan ts of T 6 p rogeny of transfo rm ant 23. 1c, 5c
o r 10c w as a fragm ent contain ing the bar o r cecrop in B specific
sequence equivalen t to 1, 5 o r 10 cop ies per hap lo id rice
genom e.
图 4　　N o rthern2blo t 分析。23、24、26、29: 转基因京引
119 当代转化株及其 T 1、T 3 和 T 6 世代的稻茬。RNA 加样量
标准以溴化乙碘染色的RNA 凝胶电泳照片表示
F ig. 4　　N o rthern b lo t analysis of bar and cecrop in B mRNA
in differen t transgenic p lan ts. L anes 23, 24, 26 and 29: T 0
t ransfo rm ants of JY119 and its T 1, T 3 and T 6 p rogenies. T he
pho tograph of the eth idium brom ide2stain ing RNA gel as a
contro l fo r loading is also show n
基因组DNA 上, 其中 TR 5 显示出 5～ 6 条杂交带,
TR 6 只有 1～ 3 条杂交带。这说明 TR 5 基因组中,
外源基因以多拷贝多插入位点的形式被整合。将
TR 5、TR 6 分别与各自亲本嘉 59、秀水 63 进行杂
交和回交, 结果看出, F 2 和B 1C 1 代材料对除草剂
BA STA 抗性分离比符合孟德尔单基因分离规律
64　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　29 卷

图 5　　TR 5、TR 6 和 TR 5öTR 6 的 bar 和 cecrop in B
基因 Southern 杂交结果。23: 阳性对照 (转基因株
JY119) ; U T: 非转基因对照
F ig. 5　　T he Southern2blo t analysis of bar gene in TR 5,
TR 6 and TR 5öTR 6. 23: Po sit ive contro l (T ransfo rm ant
JY199) ; U T: untransfo rm ed negative contro l
(表 1) , 说明 TR 5 基因组中 ba r 基因的不同插入位
点 (具有表达功能) 紧密连锁, 与 TR 6 基因组中低
拷贝的 ba r 基因一样, 以单基因的形式被遗传。
TR 5 和 TR 6 杂交获得的 F 2 代除草剂BA STA 抗性
分离统计表明, 整合在 TR 5、TR 6 基因组DNA 上
的 ba r 基因表现出两基因的独立分配规律, 抗除草
剂植株与感除草剂植株的分离比例为 15∶1 (表 1) ,
进一步证实位于 TR 5 和 TR 6 基因组 DNA 中的
ba r 基因为单基因遗传, 而且互不等位。
　　图 5 显示, TR 5 和 TR 6 杂交后, TR 5 有一条
杂交带在 F 1 代中丢失 (箭头所示)。从杂交图谱还
可以看出, 在单一切点酶 (P stÉ , X ba É ) 作用下,
TR 5 和 TR 6 基因组中选择标记基因 ba r 和非选择
标记基因 cecrop in B 的杂交图谱非常相似, F 1 代中
与 ba r 基因探针杂交发现丢失的条带同样在与
cerop in B 基因探针杂交时发生丢失。原因可能是转
化质粒在核酸酶、重组酶等核酸修复体系的作用
下, 其结构遭到破坏, 虽然 ba r 和 cecrop in B 基因
紧密连锁, 但两者之间不存在 P stÉ 和 X ba É 酶切
位点。因此酶切后与两个探针的杂交结果类似。
3　讨论
外源基因能否在转基因的后代中稳定地遗传和
表达是基因工程技术实用化研究中人们普遍关注的
问题。基因沉默现象的发现使很多人对转基因技术
的实用化研究产生了迷惑, 总怀疑转基因在后代中
得不到稳定的遗传和表达。我们的结果表明不仅选
择标记基因 ba r 而且与其共转化的非选择标记基因
cecrop in B 均能得到稳定地遗传和表达。另从我们
对除草剂BA STA 抗性的连续跟踪表明, 第 10 代
群体仍旧表现出对BA STA 的稳定抗性 (2001 年结
果) , 由此转基因株配组转育的后代材料也表现出
稳定的除草剂BA STA 抗性 (数据未列)。
表 1　　抗除草剂 Basta 稳定系杂交试验
Table 1　　The cross test of stable herbic ide resistance tran sgen ic r ice l ines
受体品种
Recep to r
F2
抗除草
剂株数
Basta2
resistan t
p lan ts
感除草
剂株数
Basta2
sensit ive
p lan ts
ς 2
　
　
　
　
　
P
　
　
　
　
　
B 1C1
抗除草
剂株数
Basta2
resistan t
p lan ts
感除草
剂株数
Basta2
sensit ive
p lan ts
ς2
　
　
　
　
　
P
　
　
　
　
　
TR 5ö嘉 59 536 157 1. 909 (3∶1) 0. 2～ 0. 1 34 37 0. 056 (1∶1) 0. 9～ 0. 8
TR 6ö秀水 63 393 136 0. 107 (3∶1) 0. 8～ 0. 7 20 27 0. 766 (1∶1) 0. 5～ 0. 3
TR 5öTR 6 631 45 0. 128 (15∶1) 0. 8～ 0. 7
　　但是, 对多插入位点的转基因株 TR 5 和 TR 6
的杂交转育研究表明, 两 ba r 基因互不等位, 多拷
贝的转基因由于紧密连锁而表现出单基因的简单分
离规律。TR 5 基因组内有一个转基因插入位点在遗
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传转育过程中发生丢失, 表现出不稳定的遗传传递
现象。片断丢失可能有两种原因引起: ① 转育过程
中, 由于基因互作, 导致基因片断丢失, 但此片断
不影响 TR 5 基因组中转基因的表达。如果影响转
基因的表达, 那么 TR 5öTR 6 F 1 代基因组中 ba r 基
因的转录片断来自于 TR 6 基因组, 其 F 2 代除草剂
抗性分离比就不符合 15∶1 的独立分配规律, 而可
能是 3∶1 的分离比。② 转育过程中, 稳定传递的
杂交带可能已经纯合, 但丢失的杂交带可能尚处于
杂合状态, 没有传递至 F 1 代, 但此杂交带也不影响
TR 5 基因组中转基因的表达。如果影响转基因的表
达, 那么 TR 5 除草剂抗性表型也应该是杂合体, 而
不是抗性纯合的高世代材料。与其亲本嘉 59 进行
杂交和回交结果, 除草剂抗性分离比也不一定符合
3∶1 和 1∶1 分离规律。
我们下一步将通过进一步配制 TR 5öTR 6 的 F 1
代种子, 分析在 F 1 代中片断丢失的概率是否为
50%。如果是, 就说明片断丢失是由于杂合体所
致。我们就可以通过花培技术来纯合转基因事件中
的多插入位点。如果不是, 那么基因片断的丢失可
能与基因互作有关。丢失位点所在的周边序列对转
基因的稳定整合不利。通过比较 TR 5 基因组内稳
定和不稳定整合位点所处的DNA 环境, 可以进一
步认清转基因稳定整合的规律。
References
[ 1 ]　H ua Z2H (华志华) , H uang D 2N (黄大年). Genetic mode of
exogenes in transgenic p lan ts. A cta B otan ica S in ica (植物学
报) , 1999, 41: 1～ 5 ( in Ch inese)
[ 2 ]　L yer L M , Kumpatla S P, Chandrasekah ran M B, et a l.
T ransgene silencing in monoco ts. P lan tM ol B iol, 2000, 43:
323～ 346
[ 3 ]　W assenegger M , Pelissier T. A model fo r RNA 2m ediated
gene silencing in h igher p lan ts. P lan t M ol B iol, 1998, 37:
349～ 362
[ 4 ]　H uang D 2H (黄大年) , Zhu B (朱冰) , Yang W (杨炜) , et a l.
In troduction of Cecrop in B gene in to rice (O ry z a sa tiva L. )
by particle gun bom bardm ent and analysis of transgenic
p lan ts. S ci Ch ina (S er. C ) , 1996, 39: 652～ 661
[ 5 ]　L i L C, Q u R D , deKochko A , Fauquet C, Beachy R N. A n
impo rted rice transfo rm ation system using the b io list ic
m ethod. P lan t Cell R ep orts, 1993, 12: 250～ 255
[ 6 ]　Rogers S O , Bendlich A L. Extraction of to tal cellu lar DNA
from p lan ts, algae and fungi. In Gelvin SB and Sch ilperoo rt
A R (eds) P lan t M o lecu lar B io logy M anual, 2nd edn. 1～ 8.
Kluw er A cadem ic Publishers, Do rdrech t (1994).
[ 7 ]　Sam brook J , F ritsch E F, M aniatis T. M olecu lar C lon ing: a
L abora tory M anua l. 2nd edit ion, 1989.
[ 8 ]　Zhou S2M (周盛梅) , W ang X2L (汪晓玲) , H ua Z2H (华志
华) , et a l. P roduction of herb icide2resistan t direct seedling
rice (O ry z a sa tiva L. ) p lan ts from agronom ically impo rtan t
japonica variet ies via part icle bom bardm ent. J H ang z hou
T each ing Colleg e (N atu ra l S cience) [杭州师范学院学报 (自
然科学版) ], 2001, 18: 20～ 25 ( in Ch inese)
[ 9 ]　Zhu B (朱冰) , H uang D 2N (黄大年) , Yang W (杨炜) , et a l.
P roduction of herb icide2resistan t transgenic rice p lan ts from
imm ature em bryo s using bio list ic m ethod. S ci A g ricu lt S in
(中国农业科学) , 1996, 29: 15～ 20 ( in Ch inese)
[ 10 ]　Spencer T M , O′B rien J V , StartW G, et a l. Segragation of
transgenes in m aize. P lan t M ol B iol, 1992, 18: 201～ 210
84　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　29 卷