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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
自 1962 年 Shimomura 等［1］首次从维多利亚多
管水母（Aequoria victoria）中分离出绿色荧光蛋白
（avGFP）后，到目前为止，通过一系列体外分子进
化的手段发展出几乎覆盖整个荧光光谱的 GFP 突变
体，如蓝色（Blue）、青色（Cyan）、黄色（Yellow）
荧光蛋白［2-5］。绿色荧光蛋白主要作为报告基因应
用于生命科学领域。然而，1997 年 Abedi 等［6］将
20 个氨基酸残基的短肽插入到 GFP 松散的 Loop 位
点处，其中大部分插入的位点都严重影响荧光蛋白
的折叠和发光，但同时筛选出了少数合适的插入位
点，在插入外源短肽后仍能正常发射荧光。这种体
收稿日期 ：2012-11-12
作者简介 ：梁俊婷，女，硕士研究生，研究方向 ：生物大分子的人工定向进化 ；E-mail ：lynne5601@hotmail.com
通讯作者 ：焦浈，女，博士，副教授，研究方向 ：作物遗传育种 ；E-mail ：jiaozhen@zzu.edu.cn
红色荧光蛋白 mCherry 中插入外源短肽位点的研究
梁俊婷1，2  李鹿之2  陈少鹏2  焦浈1
（1. 郑州大学 离子束生物工程省重点实验室，郑州 450052 ；2. 中国科学院合肥物质科学研究院技术生物
与农业工程研究所，合肥 230031）
摘 要 : 荧光蛋白及其突变体广泛应用于细胞生物学、分子生物学及医学等领域，而围绕荧光蛋白建立的各种新技术，如
BiFC（双分子荧光互补技术）、FRET（荧光能量共振转移技术）、Optical highlighter（荧光笔探针）等，则极大地促进了多个生物
相关学科的发展。采用转座子突变技术，在红色荧光蛋白 mCherry 中随机插入 5 个氨基酸残基。经流式细胞仪检测和分选，成功
获得 13 个插入外源氨基酸短肽后，仍具有荧光活性的 mCherry 荧光蛋白突变体，为 BiFC 以及构建新型生物感受器提供了更多可
插入外源 DNA 的合适位点。
关键词 : 红色荧光蛋白 短肽 插入位点
Study on Sites of the Tolerate Peptide Insertion in the Fluorescent
Protein of mCherry
Liang Junting1，2 Li Luzhi2 Chen Shaopeng2 Jiao Zhen1
（1. Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052 ；2. Institute of Technical
Biology & Agriculture Engineering，Chinese Academy of Sciences，Hefei 230031）
Abstract:  The fluorescent proteins（FPs）and their color variants have been widely used in cell biology, molecular biology and
medicine. Various new technologies based on these proteins such as bimolecular fluorescence complementation （BiFC）, fluorescence resonance
energy transfer （FRET）-based techniques and optical highlighter are enlightening the whole biology technology. In this paper, we used
transposon-based mutagenesis and flow cytometry to verify thirteen tolerate sites of mCherry with five amino acids inserted which fluoresced red.
The inserted variants with fluorescence can be served for BiFC and provide more selective sites for designing of bio-sensors.
Key words:  Red fluorescent protein Short-peptide Inserted sites
外进化 GFP 的方式不同于以往改造 GFP 的方式，传
统的方法主要采用一轮或多轮的点突变改造 GFP 荧
光蛋白。随后，Baird 等［7］对增强型绿色荧光蛋白
（EGFP）的每一个位点做了更为系统和精确的筛选，
其可插入外源短肽的位点基本上与 GFP 保持一致，
但是其他的荧光蛋白或者 GFP 突变体是否也具有类
似的或不同的耐受外源短肽插入的位点呢？
1999 年，红色荧光蛋白 drFP583［8］（商品名是
DsRed，558 nm/583 nm）首次被发现，极大丰富了
荧光蛋白的光谱多样性。较之 GFP 及其突变体，红
色荧光蛋白 drFP583 的激发和发射波长大大增加，
2013年第5期 145梁俊婷等 ：红色荧光蛋白 mCherry 中插入外源短肽位点的研究
而且具有在组织成像方面背景荧光低等诸多优势。
因此，红色荧光蛋白引起了研究人员的广泛关注。
但是野生型的 drFP583 体内外均易形成四聚体且成
熟速度慢［9］，这些缺陷极大限制了它在生物学上的
应用。为了克服这些缺点，研究人员随后通过多轮
的随机突变和定点突变改造，在 2002 年首次得到了
红色荧光蛋白 drFP583 的单体 mRFP1［10］。与野生
型 drFP583 相比，mRFP1 具有更长的激发和发射波
长（584 nm/607 nm），其荧光亮度更强，成熟速度
更快。在 mRFP1 的基础上，Shaner 等［11］通过多轮
随机和定点突变得到了 mCherry。优化后的 mCherry
比 mRFP1 荧光亮度更亮，成熟时间更短，激发和发
射波长更长（587 nm/610 nm）。因其诸多优良性能，
mCherry 备受研究人员的青睐。
已有研究表明 mCherry 类似 GFP，可以插入外源
短肽［12］。为了获得更多的更合适的插入位点，本研
究使用 mCherry 为靶荧光蛋白，旨在通过转座子的
突变系统寻找 mCherry 中可供外源短肽插入的位点。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和培养基 大肠杆菌感受态细胞
Trans I 及质粒 pUC19 均购自北京全式金生物公司。
LB 培养基、SOC 培养基和 LB 培养基配方参考分子
克隆实验指南（第 3 版）。LB/Agar/Amp 培养基（Amp
终浓度是 200 μg/mL），LB/Agar/Amp/Kan 培养基（Amp
终浓度是 200 μg/mL，Kan 终浓度为 10 μg/mL）。
1.1.2 主要的试剂 Not I 、EcoR I 和 Sal I 限制性
酶以及 DNA Ladder Marker 购买于 TaKaRa 公司。高
保真酶 KOD Plus 购自 ToYoBo 公司。普通 Taq 酶购
自北京 TIANGEN 生物公司。IPTG（异丙基 -β-D-硫
代吡喃半乳糖苷）贮存浓度为 100 mmol/L，工作浓
度为 1 mmol/L。T4 连接酶购自 NEB 公司。PCR 产
物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均
为 Axygen 公司产品。寡核苷酸引物合成和 DNA 测
序由上海生工生物公司完成。转座子随机突变试
剂 盒 Mutation Generation SystemTM Kit（F-701） 购 自
Finnzymes 公司。
1.2 方法
1.2.1 质粒构建 用于扩增 mCherry 的上下游引物
分 别 为 ：F ：5-TCAGACGAATTCGGTACCGGCGGC
TCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3，R ：5-AG
ATTGTCGACGGTACCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATG
CCGC-3。分别在上游引物加上限制酶 EcoR I，下游
引物加上限制酶 Sal I，mCherry 经 PCR 扩增后，经
EcoR I 和 Sal I 酶切。回收 mCherry 酶切片段连接到
经 EcoR I 和 Sal I 酶切的质粒 pUC19 上，得到重组
质粒 pUC-MC。转化入大肠杆菌感受态细胞 Trans I
中，使用质粒提取试剂盒提取质粒 pUC-MC。
1.2.2 以转座子试剂盒为基础的突变体系统 按照
转座子随机突变试剂盒 Mutation Generation SystemTM
Kit 说明书，使用具有 Kan 抗性的 MuA 转座子进行
体外转座反应。将自身 DNA 随机转座到已经构建
好的质粒 pUC-MC（靶 DNA）上。体外转座反应体
系按照说明书要求，在 1.5 mL 的离心管中分别加入
1 μL 转座子，120 ng 目的 DNA（质粒 pUC-MC），4
μL Buffer，1 μL MuA 转座酶，最后加入超纯水至终
体积 20 μL。轻轻混匀后 30℃反应 1 h，75℃水浴 10
min，灭活 MuA 转座酶。
1.2.3 mCherry 及 其 突 变 体 的 获 得 取 2 μL 转 座
酶体外转座反应系统的反应混合物，加入到 50 μL
Trans I 感受态细胞中，转化后涂布在 LB/Agar/Amp
培养板上，37℃培养过夜。收集所有的细菌克隆后
提取质粒。EcoR I 和 Sal I 酶切后，琼脂糖凝胶电泳，
产生 4 条明亮且大小不同的条带（图 1-A）。这 4 条
带大小分别为 3.8 kb（2.7 kb 质粒 +1.1 kb 转座子），
2.7 kb（空质粒），1.8 kb（0.7 kb mCherry + 转座子）
和 0.7 kb（mCherry）。回收 1.8 kb 和 2.7 kb 的条带，
连接后转化，涂板，37℃培养过夜后，收取所有克隆，
最终得到在 mCherry 中插入转座子的细菌库，提质粒，
得到 pUC-MC/TS。由于转座子序列两端均含有特定
的 Not I 酶切位点，质粒 pUC-MC/TS 经 Not I 酶切后，
转座子基因基本被切除，仅留下包括 Not I 酶切位点
在内的 15 个碱基，得到质粒 pUC-MC/15 bp。
1.2.4 mCherry 及其突变体的诱导表达 将构建好的
质粒系统 pUC-MC/TS 和 pUC-MC/15 bp 分别转入大
肠杆菌感受态细胞 Trans I，在含有 200 μg/mL Amp
或（和）10 μg/mL Kan 的 TB 培养液中，37℃，180
r/min 条件下培养 12 h。然后将菌液 1∶50 接种在含
有相应抗生素的 TB 培养液中，在 37℃，180 r/min
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期146
下培养菌液直到 OD600 达到 0.4。加入 IPTG 诱导使
其终浓度为 1 mmol/L，在 16℃，180 r/min 条件下诱
导 mCherry 荧光蛋白，8 h 后流式细胞仪检测其荧光
变化。
1.2.5 流 式 细 胞 仪 检 测 及 分 选 将 诱 导 后 表 达
mCherry 的菌液 12 000 r/min 离心去上清，用磷酸盐
缓冲液（PBS）洗 2 遍。调整菌液 OD600 值为 0.2 后，
用 AriaIII 流式细胞仪（BD）进行分选和检测（激发
波长 ：561 nm，发射波长 ：610 nm）。3 次平行试验
后，根据其相对荧光强度，观察突变体相对于野生
型 mCherry 的荧光变化。
1.2.6 mCherry 突变体测序 在流式细胞仪分选阳性
菌液培养后挑取单克隆菌斑，测序。各测序结果与
mCherry 序列比对后确认有 15 个碱基插入到 mCherry
序列即可认定为阳性克隆。
1.2.7 统计分析 试验数据来自至少 3 次重复试验，
结果的表示方法为 ：x
-
±s。数据组之间的显著性分
析用 students’t test 方法，P<0.05 为显著性差异。
2 结果
2.1 mCherry短肽插入突变体库的构建
利用转座子随机突变系统将转座子（Kan 抗性）
随机插入到质粒 pUC-MC，使用 mCherry 两端特定
的限制酶 EcoR I 和 Sal I 酶切后得到 4 条不同大小的
DNA 片段（图 1-A），将含有转座子序列的 mCherry
片段（1.8 kb）连接到 pUC19 片段（2.7 kb）上得到
突变体库 pUC-MC/TS（图 1-B）。在此突变体库的基
础上，使用限制酶 Not I 切除突变体 pUC-MC/TS 上
的转座子序列，在原位置残留 15 个碱基。这样便得
到 15 个碱基仅插入到 mCherry 序列的质粒突变体库
pUC-MC/15 bp（图 1-C）。
䍘㋂pUC-MC
pUC-MC/TSケਈփᓃ
···
···
࢙։Ⲵ15 bp
mCherry
pUC19
转座子
pUC-MC/15 bpケਈփᓃ
3800
M 1A B C
2700
1800
700
bp
（A）M ：250 bp DNA Ladder Marker ；1 ：质粒 pUC-MC/TS 突变体在 EcoR Ⅰ和 Sal Ⅰ双酶切 ；（B）质粒 pUC-MC 以及转
座子随机插入到质粒 pUC-MC 后得到的质粒突变体库 pUC-MC/TS ；（C）质粒 pUC-MC 及切除转座子后留下的 15 个碱
基仅插入到 mCherry 序列中的突变体库 pUC-MC/15 bp
图 1 突变体库 pUC-MC/TS 和 pUC-MC/15 bp 的构建
2.2 mCherry短肽突变体的筛选
适当的条件下诱导表达 mCherry 短肽突变体后，
使用流式细胞分选仪（ArialIII，BD）分选出阳性细
菌（图 2），表达红色荧光蛋白的大肠杆菌如图 2-B
P3 所示。扩大培养后，即获得插入短肽后仍发荧光
的突变体群。
2.3 mCherry短肽突变体的获得
将流式细胞仪分选出的阳性菌培养后涂板，
挑取单克隆后测序。测序的各突变体序列与原始
mCherry 序列比对后，确定 15 个碱基插入到 mCherry
序列及其插入位置，然后分析其在荧光蛋白 mCherry
二级结构中的插入位置。
测序结果显示，有 15 个碱基插入到 mCherry 序
列的克隆共有 53 个，占所有测序的单克隆总数（85
个）的 64%，即筛选 mCherry 短肽突变体的阳性率
约 64%。同时，共有 13 个 mCherry 短肽突变体诱导
后仍发射红色荧光，其插入位置分别位于 mCherry
氨基酸序列的第 K9、E10、F11、F65、G90、G116、
K121、E148、M150、L157、G171、V187 和 T223
氨基酸残基位置处，分别简称为 m9、m10、m11、
m65、m90、m116、m121、m148、m150、m157、
m171、m187 和 m223（图 3）。
2013年第5期 147梁俊婷等 ：红色荧光蛋白 mCherry 中插入外源短肽位点的研究
2.4 mCherry短肽突变体荧光亮度的测定
将 上 述 13 个 mCherry 短 肽 突 变 体 及 野 生 型
mCherry 在相同诱导条件下诱导后，流式细胞仪检测
它们在大肠杆菌内的表达。mCherry 短肽突变体的
荧光亮度与野生型 mCherry（未插入的荧光强度为
100%）相比明显减弱（图 4）。
3 讨论
Mu 噬菌体是目前研究 DNA 转座的理想模型
之一，其转座机理［13］已有详尽报道。本研究采用
MuA 转座酶催化的转座子突变系统，将转座子随机
插入到荧光蛋白 mCherry 中，经转座子两端特定的
Not I 限制酶切后，剩余 15 个碱基残留在 mCherry 序
列中。但是，15 个碱基插入到 mCherry 序列后，荧
光蛋白 mCherry 的荧光大部分都已经消失，只有在
若干个特定位点处 mCherry 仍保留较强荧光。这些
350
250
150
100
50
102 103 104 105
C
ou
nt
0
200
300
P3
PE-A
Specimen_001-ctrA
350
B
250
150
100
50
102 103 104 105
C
ou
nt
0
200
300
P3
PE-A
Specimen_001-pUC19-mCherry-Not l-15 bp
A ：阴性对照组 ；B ：IPTG 诱导表达荧光突变体大肠杆菌，P3 区域为阳性区
图 2 流式细胞仪筛选诱导后表达质粒突变体 pUC-MC/15bp 的大肠杆菌
12 41 221 193 153 156 183 91 114 117
8681
90 116
12173
1011321
57
7 8 9 4 5
12710499172
171
157
150
148
65
187
223
910
11
1671402042105022
6
36
Nterm Cterm
图 3 5 个外源氨基酸所在 mCherry 二级结构中相应氨基
酸残基的位置（方框所示）
120
100
80
60
40
20
Fl
ou
re
sc
en
t I
nt
en
si
ty
%
0
mC
he
rry m9
0
m1
16
m1
71
m1
87
m1
21
m1
48
m1
50
m1
57 m9 m1
0
m1
1
m2
23 m6
5
loop β-strand C-/N-termini α-helix
图 4 质粒突变体 pUC-MC/15bp 中 15 个碱基插入 mCherry 序
列的氨基酸位数对应 mCherry 突变体的相对荧光强度
特定的位点主要分布在 N/C 末端，第 3、4 个 β 折叠
之间，第 5、6 个 β 折叠之间，第 8、9 个 β 折叠之间，
第 9、10 个 β 折叠之间以及第 6、7、8 个 β 折叠上。
Li 等［12］证明了 mCherry 可耐受外源短肽插入的位
点主要分布在第 1、2 个 β 折叠之间，第 6、7 个 β
折叠之间，第 9、10 个 β 折叠之间，但认为最耐受
插入外源肽段的位点是在第 9、10 个 β 折叠之间的
Loop 结构。本研究显示，虽然在第 9、10 个 β 折叠
之间的 Loop 结构（第 187 位氨基酸残基）处的突变
体 m187 仍能发出 56% 的相对荧光，但并无充分的
证据证实此 Loop 结构最耐受外源肽段的插入。第 9、
10 个 β 折叠之间的 Loop 中第 V187 位氨基酸残基处
插入的 m187 突变体的荧光强度与插入其他 Loop 结
构处的突变体短肽相比荧光最亮 ；第 5、6 个 β 折
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期148
叠之间的荧光蛋白突变体亮度最低，约为野生型
mCherry 荧光亮度的 15%。因此本研究证明此 Loop
结构中耐受外源短肽插入的程度较弱。
另外，本研究在 β 折叠上也筛选出 4 个不同的
插入位点，与插入到松散的 Loop 结构中的各个位点
相比，荧光蛋白突变体的亮度总体降低。但在第 7
个 β 折叠上有两个位点处（第 E148 和 M150 位）的
荧光蛋白突变体均能发出较亮的荧光。这说明与其
他 β 折叠相比，这两个位点处或其附近的位点耐受
度较强。迄今为止，仍未有相关的文献报道，系统
筛选出荧光蛋白 mCherry 的 β 折叠上所有耐受外源
短肽插入的位点。本研究使用突变转座系统，首次
将 β 折叠柱上可插入位点系统的筛选出来，共有 4
个可插入位点。同时本研究还发现，位于荧光蛋白
mCherry 的发色体（MYG）附近的第 F65 位突变体
m65，荧光强度约为原来的 52%。
本研究证明的可插入位点不仅包括已有相关报
道的附近位点，如 V187 处与 Li 等［12］报道的 K184
位都在第 9、10 个 β 折叠柱之间的 Loop 结构，而且
证实了更多不同的位点，这极大地增加了荧光蛋白
mCherry 中可插入的位点的数目，为试验的进一步设
计（如荧光双分子互补技术）提供更多可选择的位
点。同时，也为改造荧光蛋白作为生物感受器或者
插入更长外源短肽提供了更多可参考的位点。
4 结论
采用转座子随机突变系统最终将 5 个氨基酸短
肽随机到荧光蛋白 mCherry 中，共筛选出 13 个特定
插入位点。这些插入外源短肽的 mCherry 突变体仍
然能发出较强的荧光，其中第 9、10 个 β 折叠柱间
的 Loop 结构耐受外源短肽插入的能力较强 ；相反，
在第 5、6 个 β 折叠柱间耐受度较弱。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）